專利名稱：微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法。
背景技術(shù)：
生物轉(zhuǎn)化屬于化學(xué)和生物學(xué)的交叉領(lǐng)域，生物催化劑和反應(yīng)介質(zhì)是生物轉(zhuǎn)化的兩大要素。生物催化劑工程運用發(fā)酵技術(shù)或從動植物中分離提取獲得大量的酶，其研究經(jīng)歷了自由酶、固定化酶和細胞的過程；介質(zhì)工程則為生物催化劑作用過程提供理想的溶劑體系，傳統(tǒng)上以水為溶劑體系，自Klibanov等開創(chuàng)有機相酶催化反應(yīng)以來，有機溶劑介質(zhì)體系得到了廣泛的研究。
單寧酶全稱為單寧?；饷?tannin acyl hydrolase，EC 3.1.1.20)，是一種細胞膜結(jié)合酶，可分泌到胞外，能水解水解性單寧和沒食子酸酯類中的酯鍵和縮酚酸鍵，從而生成沒食子酸和葡萄糖及相應(yīng)的醇類化合物。單寧酶主要產(chǎn)生于真菌類曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)的微生物，尤其是曲霉屬的黑曲霉(Aspergillus.niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。另外，在酵母、細菌和植物中也有產(chǎn)單寧酶的研究報道。
沒食子酸酯類是沒食子酸的重要衍生物之一，能促進纖維蛋白和血栓的溶解、擴張血管、增加冠動脈血流量及有效抑制血小板的凝集，廣泛地應(yīng)用于治療心腦血管疾病。同時，沒食子酸酯類還可清除體內(nèi)的氧自由基，對炎癥、病毒性疾病、細菌感染性疾病、胃潰瘍、輻射損傷、過敏及老年性癡呆等均有一定的治療和防治作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域中具有廣泛而重要的應(yīng)用前景。其中沒食子酸丙酯(propyl gallate，PG)表現(xiàn)的尤為突出。PG是FAO/WHO組織批準(zhǔn)的油溶性合成食品抗氧化劑，對人體無任何毒副作用，是國際上通用的食品抗氧化劑。PG的醫(yī)藥商品名為“通脈酯”，是治療心腦血管疾病的一類新藥，具有抗血小板聚集、增強纖維蛋白和血栓溶解、擴張血管及增加冠動脈血流量等療效。同時它還能清除體內(nèi)氧自由基、預(yù)防乳腺癌，對Lrewis肺癌具有抑制和抗轉(zhuǎn)移作用。
目前，PG是由沒食子酸和丙醇酯化反應(yīng)而成，合成方法可分為化學(xué)合成法和生物合成法，在工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域中化學(xué)合成法一直是占主導(dǎo)地位。由于沒食子酸中苯環(huán)及其上的羧基和兩個酚羥基形成共軛大π鍵，其反應(yīng)活化能很高，因此其酯化反應(yīng)所需的條件較為苛刻。鑒于此，化學(xué)合成法一般是以離子交換樹脂、濃硫酸或固體酸等作為催化劑，將沒食子酸與過量的丙醇回流脫水制備成PG。該生產(chǎn)過程不僅制備時間長、產(chǎn)率不高，而且濃硫酸具有強氧化性，易使具有鄰二酚結(jié)構(gòu)的沒食子酸發(fā)生氧化，生成大量的副反應(yīng)產(chǎn)物，且還會嚴重腐蝕生產(chǎn)設(shè)備。而相比之下，采用生物合成法酯化合成PG就容易得多，而且反應(yīng)條件溫和，不存在副反應(yīng)等諸多問題。1952年Toch和Hensler首次在水相中利用單寧酶(tannase EC 3.1.1.20)催化合成沒食子酸甲酯和乙酯，開創(chuàng)了生物合成桔酸酯的先河.
隨著20世紀(jì)70～80年代中有機相酶(細胞)促反應(yīng)研究的蓬勃興起，迄今為止，該研究領(lǐng)域中已積累大量的研究成果和建立起較為完善的理論基礎(chǔ)，并顯示出水相酶促反應(yīng)所無法比擬的優(yōu)勢，尤其是有機相中反應(yīng)平衡點可向合成方向移動，以及依賴于水的副反應(yīng)(水解反應(yīng))顯著減少，這無疑為有機相中進行合成PG的酯化反應(yīng)創(chuàng)造條件。1985年，Weetal首次用固定的單寧酶成功催化合成沒食子酸丙酯和沒食子酸戊酯，168h酯化率分別為41.4％和78％，同年Weetal取得了沒食子酸丙酯合成的專利，1989年Gaathon等利用反膠束固定化單寧酶合成沒食子酸丙酯，90h的產(chǎn)率為51％，但是由于反膠束物化性能不穩(wěn)定，很難放大和工業(yè)化生產(chǎn)。至今對于生物法合成桔酸酯的研究仍在不斷探索中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法。
方法的步驟如下1)將黑曲霉孢子培養(yǎng)得到的菌絲體收集過濾，用0.85％(w/v)NaCl溶液沖洗，在0.01～0.2mol/L pH 2.2～5.8緩沖溶液中平衡后過濾，得到含水量為60～80％(w/w)的菌絲體。所述的緩沖溶液pH2.2～3.6的為甘氨酸—鹽酸緩沖液，pH3.6～5.8的為乙酸—乙酸鈉緩沖液(配制方法見《生物化學(xué)實驗原理和方法》李建武等編，北京大學(xué)出版社，1994年，p404)。
2)在有機溶劑苯體系中，每升有機溶劑中加入0.06～0.1L的正丙醇和4～10mmol的沒食子酸，再在每升有機溶劑中加入20～50g的上述黑曲霉菌絲體，在攪拌速度150～220rpm和反應(yīng)溫度20～50℃下進行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時間為48～96h。
上述的黑曲霉孢子培養(yǎng)方法為將CGMCC保藏號No.3.315的黑曲霉(Aspergillus niger)接種到黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基上，在30℃下培養(yǎng)5天，然后將萌發(fā)的黑曲霉孢子接種到300L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養(yǎng)溫度30℃條件下培養(yǎng)72h。
黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基為(單位％(w/v))單寧酸0.5％，蛋白胨0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，瓊脂6％。
黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基為(單位％(w/v))單寧酸1.0～4.0％，可溶性淀粉0.2～0.4％，蔗糖0.3～0.8％，葡萄糖0.1～0.3％，豆餅粉0.5～1.0％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，F(xiàn)eSO40.001％，pH 6.0。
本發(fā)明的優(yōu)點文獻報道的方法均使用游離單寧酶或者固定化單寧酶作為生物催化劑，但是曲霉屬的單寧酶為胞內(nèi)酶，分布在真菌的細胞壁與細胞膜之間，結(jié)合得非常牢固，相當(dāng)于固定在細胞中，導(dǎo)致單寧酶分離純化過程中破壁取酶非常困難，而本方法建立了黑曲霉產(chǎn)單寧酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，利用該產(chǎn)單寧酶的黑曲霉菌絲體作為生物催化劑，不使用傳統(tǒng)的自由酶或者固定化酶，省去了酶的分離純化過程，而且完整細胞具有對有機溶劑的耐受性更高，易于回收等優(yōu)點，因此大大降低了生產(chǎn)成本；通過有機介質(zhì)工程，將黑曲霉菌絲體加入有機介質(zhì)體系中催化酯化反應(yīng)，在溫和的反應(yīng)條件下，沒食子酸丙酯反應(yīng)產(chǎn)率達到30～60％。至今國內(nèi)外仍未有文獻報道直接利用產(chǎn)單寧酶的黑曲霉菌絲體作為催化劑在有機介質(zhì)體系中合成沒食子酸丙酯。
具體實施例方式
實施例1將CGMCC保藏號No.3.315的黑曲霉(Aspergillus niger)接種到黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基上，在30℃下培養(yǎng)5天，然后將萌發(fā)的黑曲霉孢子接種到300L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養(yǎng)溫度30℃條件下培養(yǎng)72h。
黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基為(單位％(w/v))單寧酸0.5％，蛋白胨0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，瓊脂6％。
黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基為(單位％(w/v))單寧酸1.0％，可溶性淀粉0.2％，蔗糖0.8％，葡萄糖0.3％，豆餅粉0.8％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，F(xiàn)eSO40.001％，pH 6.0。
將上述培養(yǎng)72h的菌絲體收集過濾，用0.85％(w/v)NaCl溶液沖洗，在0.01mol/L pH 3.6乙酸—乙酸鈉緩沖溶液中平衡1小時后過濾，得到含水量為80％(w/w)的菌絲體。將300L有機溶劑苯加入攪拌式反應(yīng)器中，然后在其中加入30L正丙醇溶液、3mol沒食子酸，15kg菌絲體，然后在反應(yīng)溫度45℃，攪拌速度220rpm條件下反應(yīng)72小時，最終沒食子酸丙酯產(chǎn)率32％。
實施例2將CGMCC保藏號No.3.315的黑曲霉(Aspergillus niger)接種到黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基上，在30℃下培養(yǎng)5天，然后將萌發(fā)的黑曲霉孢子接種到300L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養(yǎng)溫度30℃條件下培養(yǎng)72h。
黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基為(單位％(w/v))單寧酸0.5％，蛋白胨0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，瓊脂6％。
黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基為(單位％(w/v))單寧酸4.0％，可溶性淀粉0.4％，蔗糖0.3％，葡萄糖0.1％，豆餅粉0.8％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，F(xiàn)eSO40.001％，pH 6.0。
將上述培養(yǎng)72h的菌絲體收集過濾，用0.85％NaCl(w/v)溶液沖洗，在0.1mol/L pH 2.6甘氨酸—鹽酸緩沖溶液中平衡1小時后過濾，得到含水量為80％(w/w)的菌絲體。將100L有機溶劑苯加入攪拌式反應(yīng)器中，然后在其中加入6L正丙醇溶液、0.4mol沒食子酸，2kg菌絲體，然后在反應(yīng)溫度20℃，攪拌速度150rpm條件下反應(yīng)48小時，最終沒食子酸丙酯產(chǎn)率41％。
實施例3將CGMCC保藏號No.3.315的黑曲霉(Aspergillus niger)接種到黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基上，在30℃下培養(yǎng)5天，然后將萌發(fā)的黑曲霉孢子接種到300L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養(yǎng)溫度30℃條件下培養(yǎng)72h。
黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基為(單位％(w/v))單寧酸0.5％，蛋白胨0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，瓊脂6％。
黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基為(單位％(w/v))單寧酸2.0％，可溶性淀粉0.3％，蔗糖0.5％，葡萄糖0.2％，豆餅粉0.9％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，F(xiàn)eSO40.001％，pH 6.0。
將上述培養(yǎng)72h的菌絲體收集過濾，用0.85％NaCl(w/v)溶液沖洗，在0.2mol/L pH 2.2甘氨酸—鹽酸緩沖溶液中平衡1小時后過濾，得到含水量為60％(w/w)的菌絲體。將200L有機溶劑苯加入攪拌式反應(yīng)器中，然后在其中加入13L正丙醇溶液、1.0mol沒食子酸，6kg菌絲體，然后在反應(yīng)溫度40℃，攪拌速度180rpm條件下反應(yīng)72小時，最終沒食子酸丙酯產(chǎn)率58％。
實施例4將CGMCC保藏號No.3.315的黑曲霉(Aspergillus niger)接種到黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基上，在30℃下培養(yǎng)5天，然后將萌發(fā)的黑曲霉孢子接種到300L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養(yǎng)溫度30℃條件下培養(yǎng)72h。
黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基為(單位％(w/v))單寧酸0.5％，蛋白胨0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，瓊脂6％。
黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基為(單位％(w/v))單寧酸3.0％，可溶性淀粉0.3％，蔗糖0.6％，葡萄糖0.3％，豆餅粉0.5％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，F(xiàn)eSO40.001％，pH 6.0。
將上述培養(yǎng)72h的菌絲體收集過濾，用0.85％NaCl(w/v)溶液沖洗，在0.1mol/L pH 5.8乙酸—乙酸鈉緩沖溶液中平衡1小時后過濾，得到含水量為70％(w/w)的菌絲體。將50L有機溶劑苯加入攪拌式反應(yīng)器中，然后在其中加入4L正丙醇溶液、0.2mol沒食子酸，2kg菌絲體，然后在反應(yīng)溫度50℃，攪拌速度200rpm條件下反應(yīng)96小時，最終沒食子酸丙酯產(chǎn)率51％。
權(quán)利要求
1.一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法，其特征在于，方法的步驟如下1)將黑曲霉孢子培養(yǎng)得到的菌絲體收集過濾，用0.85％(w/v)NaCl溶液沖洗，在0.01～0.2mol/L pH2.2～5.8緩沖溶液中平衡后過濾，得到含水量為60～80％(w/w)的菌絲體；2)在有機溶劑苯體系中，每升有機溶劑中加入0.06～0.1L的正丙醇和4～10mmol的沒食子酸，再在每升有機溶劑中加入20～50g的上述黑曲霉菌絲體，在攪拌速度150～220rpm和反應(yīng)溫度20～50℃下進行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時間為48～96h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法，其特征在于所述的黑曲霉孢子培養(yǎng)方法為將CGMCC保藏號No.3.315的黑曲霉(Aspergillus niger)接種到黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基上，在30℃下培養(yǎng)5天，然后將萌發(fā)的黑曲霉孢子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養(yǎng)溫度30℃條件下培養(yǎng)72h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法，其特征在于所述的黑曲霉菌種保藏培養(yǎng)基為單寧酸0.5％(w/v)，蛋白胨 0.1％(w/v)，K2HPO40.1％(w/v)，NaH2PO40.1％(w/v)，MgSO4·7H2O0.05％(w/v)，瓊脂6％(w/v)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法，其特征在于所述的黑曲霉產(chǎn)單寧酶的發(fā)酵培養(yǎng)基為單寧酸1.0～4.0％(w/v)，可溶性淀粉0.2～0.4％(w/v)，蔗糖0.3～0.8％(w/v)，葡萄糖0.1～0.3％(w/v)，豆餅粉0.5～1.0％(w/v)，NH4NO30.1％(w/v)，K2HPO40.1％(w/v)，KCl 0.05％(w/v)，MgSO4·7H2O 0.05％(w/v)，CaCl20.02％(w/v)，MnCl2·6H2O 0.04％(w/v)，F(xiàn)eSO40.001％(w/v)，pH6.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法，其特征在于所述的緩沖溶液pH2.2～3.6的為甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH3.6～5.8的為乙酸-乙酸鈉緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法。方法的步驟如下1)將黑曲霉孢子培養(yǎng)得到的菌絲體收集過濾，用0.85％(w/v)NaCl溶液沖洗，在0.01～0.2mol/L pH 2.2～5.8緩沖溶液中平衡后過濾，得到含水量為60～80％(w/w)的菌絲體；2)在有機溶劑苯體系中，每升有機溶劑中加入0.06～0.1L的正丙醇和4～10mmol的沒食子酸，再在每升有機溶劑中加入20～50g的上述黑曲霉菌絲體，在攪拌速度150～220rpm和反應(yīng)溫度20～50℃下進行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時間為48～96h。本方法建立了黑曲霉產(chǎn)單寧酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，利用該產(chǎn)單寧酶的黑曲霉菌絲體作為生物催化劑，不使用傳統(tǒng)的自由酶或者固定化酶，省去了酶的分離純化過程，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P7/62GK1635127SQ20041006817
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月10日
發(fā)明者李永泉, 喻曉蔚 申請人:浙江大學(xué)