專利名稱：丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，是丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆hcvme及其編碼序列HCVME在丙型肝炎疫苗制備中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)過去曾稱為腸道外(經(jīng)血)傳播的非甲非乙型肝炎(NANBH)病毒，1989年確定其3′端約75％的基因序列后才正式命名。它有世界性分布、傳播途徑廣、基因組易變異、轉(zhuǎn)慢率高、能與其它各型肝炎混合感染、引起肝硬變及肝細(xì)胞癌等特點(diǎn)。HCV屬于黃病毒科，病毒基因組為線性單股RNA，長(zhǎng)約9500核苷酸，由5′端非編碼區(qū)、核心(C)區(qū)、包膜(E)區(qū)、非結(jié)構(gòu)區(qū)1～5(NS1～5)組成。HCV基因組高度變異，在同一感染者體內(nèi)常以準(zhǔn)毒株形式存在。研究報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作表明，HCV E2蛋白中存在中和表位，其相應(yīng)的中和抗體不僅可以阻止病毒對(duì)靶細(xì)胞的粘附，而且在感染痊愈過程中起著重要作用。同時(shí)，HCV各組成蛋白中的Th(輔助性T細(xì)胞)和CTL(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)抗原表位誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)及外周血和肝臟內(nèi)的Th1/Th2表型對(duì)感染后病毒的清除及“頓挫感染”起決定性作用。
分析HCV疫苗的研究現(xiàn)狀，可以看出，因HCV無法在體外大量擴(kuò)增，故傳統(tǒng)的減毒/滅活疫苗不能研制。重組亞單位疫苗研究中，雖然明確E蛋白中存在誘導(dǎo)中和抗體的抗原決定簇，但其交叉保護(hù)性較低，面臨HCV的高變異而失去中和突變株的能力；雖然HCV的各種蛋白成分中存在CTL表位，但重組亞單位蛋白的免疫又會(huì)出現(xiàn)許多類似HCV感染后的致病表現(xiàn)，對(duì)免疫系統(tǒng)造成損傷，使似乎能夠清除HCV的T細(xì)胞免疫出現(xiàn)最終的無能化，而且，存在致病性的潛在危險(xiǎn)。由此來看，表位多肽疫苗在HCV疫苗研究中具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，其可聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有利于HCV疫苗研制的各種抗原表位，協(xié)同誘導(dǎo)保護(hù)和治療性免疫反應(yīng)。
在表位疫苗的設(shè)計(jì)中，表位的選擇是首要考慮的問題。HCV E2蛋白中的HVR1(HCV高變區(qū)1)區(qū)存在具有中和性的株特異性B細(xì)胞表位，許多研究者對(duì)其進(jìn)行了深入研究。Francois等對(duì)歐洲分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)收集的1382條HCV序列和6個(gè)經(jīng)1FN-α2a治療的丙肝患者的HVR1序列進(jìn)行軟件分析比較，發(fā)現(xiàn)HVR1的結(jié)構(gòu)存在一定的保守性，氨基酸總體傾向于疏水性，中性及親水性氨基酸稀少，堿性氨基酸數(shù)遠(yuǎn)高于酸性氨基酸，且種類和位置相對(duì)保守。[參見Francois F.等人，病毒學(xué)雜志，755703(2001)]。同時(shí)，Puntoriero等提出HVR1的免疫原性變化較其基因結(jié)構(gòu)變化小，以234條變異的HVR1基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出兼并保守的氨基酸序列，以此構(gòu)建噬菌體展示肽庫(kù)，以不同丙肝患者的血清對(duì)肽庫(kù)進(jìn)行篩選，鑒定出了具有交叉反應(yīng)性的模擬表位。以此模擬表位MAPs合成肽免疫動(dòng)物，可誘導(dǎo)出能與不同株HVR1交叉反應(yīng)的抗體[參見Puntoriero G.等人，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志，173521-3533(1998)]。Watanabe等發(fā)現(xiàn)天然的HVR1序列同Puntoriero提出的HVR1保守序列的相似性可決定同丙肝患者血清的交叉反應(yīng)性[參見Watanable K.等人，病毒學(xué)，264153-158(1999)]。而且，Zucchelli等用這些模擬HVR1表位替換天然的E2蛋白中的HVR1序列，構(gòu)建了多個(gè)模擬E2蛋白的核酸疫苗，以單一和“雞尾酒”形式免疫家兔，提出了HVR1模擬表位聯(lián)合性疫苗研究的新途徑[參見Zucchelli S等人，肝臟，33692(2001)]。
在T細(xì)胞表位的選擇中，Renard等報(bào)道了C區(qū)的35～45(YLLPRRGPRL)和132～140(DLMGYIPLV)兩段氨基酸序列為CTL表位，其在HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠中得到充分的驗(yàn)證，而且在16例丙肝患者中，有6例可檢測(cè)到針對(duì)132～140的CTL反應(yīng)[參見RenardN.等人，肝臟學(xué)雜志，2000；32(2)363-364]。Brinster等對(duì)前期在丙肝患者中確定的NS3區(qū)的4條HLA-A2的CTL表位在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)驗(yàn)證其效果，發(fā)現(xiàn)1073～1081(CVNGVCWTV)多肽在NS3 DNA免疫后和多肽免疫后都表現(xiàn)出可靠而強(qiáng)勁的CTL反應(yīng)[參見Brinster C.等人，肝臟.2001；34(6)1206-1217]。Diepolder等研究發(fā)現(xiàn)在NS3區(qū)存在能同多種MHC II類分子結(jié)合的HCV的Th表位1251～1259(VLVLNPSVA)，能結(jié)合的分子包括HLA-DR4，HLA-DR11，HLA-DR12，HLA-DR13，和HLA-DR16，充分表明其作為T細(xì)胞輔助表位應(yīng)用于疫苗研究中的前景[參見Diepolder HM.等人，病毒學(xué)雜志，1997；71(8)6011-6019]。
但迄今為止，關(guān)于B細(xì)胞表位、CTL表位、及Th表位之間的協(xié)同作用的報(bào)道，由于選擇的表位不甚理想，效果也不理想，故無法用于丙肝疫苗制備等用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種有應(yīng)用前景的丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆hcvme及其編碼序列HCVME。
本發(fā)明構(gòu)建的hcvme包含了HCV基因組E2區(qū)中HVR1模擬B細(xì)胞表位基因9條和T細(xì)胞表位基因4條，其中T細(xì)胞表位基因的4條為C區(qū)保守CTL表位2條、NS3區(qū)保守CTL表位1條及NS3區(qū)保守Th表位1條。它們是從已報(bào)道的HCV各表位中優(yōu)選出來的[分別參見Puntoriero G.等人，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志，173521-3533(1998)；Renard N.等人，肝臟學(xué)雜志，32(2)363-364(2000)；Brinster C.等人，肝臟，34(6)1206-1217(2001)；Diepolder HM.等人，病毒學(xué)雜志，71(8)6011-6019(1997)]。各表位的氨基酸序列及特點(diǎn)見序列表1(SEQ ID NO.1)。
本發(fā)明將各表位之間以三個(gè)氨基酸的編碼序列為接頭，通過PCR方法合成由上述13條表位基因串聯(lián)而成的多表位抗原的基因克隆。但各表位抗原基因的設(shè)計(jì)，是采用畢赤酵母偏性密碼子并適當(dāng)應(yīng)用大腸桿菌偏性密碼子，以便既可在原核細(xì)胞中表達(dá)，也可在真核細(xì)胞中表達(dá)。表位之間接頭的設(shè)計(jì)，采用B表位之間及B表位和T表位之間為甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸，T表位之間為丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸，以使各表位相對(duì)獨(dú)立。
丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆(hcvme)的構(gòu)建，采用混合PCR合成基因和酶切、連接相結(jié)合的方法，包括如下步驟1、合成相應(yīng)的26條寡核苷酸片段，這26條寡核苷酸片段中分別有相應(yīng)片段在5′端和3′端彼此互補(bǔ)。其中5′端互補(bǔ)的片段編號(hào)分別為2號(hào)和3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)、6號(hào)和7號(hào)、8號(hào)和9號(hào)、10號(hào)和11號(hào)、12號(hào)和13號(hào)、16號(hào)和17號(hào)、18號(hào)和19號(hào)、20號(hào)和21號(hào)、22號(hào)和23號(hào)、24號(hào)和25號(hào)；3′端互補(bǔ)的片段編號(hào)分別1號(hào)和2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)、5號(hào)和6號(hào)、7號(hào)和8號(hào)、9號(hào)和10號(hào)、11號(hào)和12號(hào)、13號(hào)和14號(hào)、15號(hào)和16號(hào)、17號(hào)和18號(hào)、19號(hào)和20號(hào)、21號(hào)和22號(hào)、23號(hào)和24號(hào)、25號(hào)和26號(hào)；26條寡核苷酸片段的核苷酸序列見序列表2(SEQ ID NO.2)，其中5′端互補(bǔ)部分見表中()內(nèi)部分，3′端互補(bǔ)部分見表中[]內(nèi)部分。
2、丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆的分段克隆上述26條寡核苷酸片段既是引物也是模板，用混合PCR方法，將序列表2中前1-14條寡核苷酸片段合成hcvme前段A，其中3′端包含kpnI酶切位點(diǎn)；將后15-26條寡核苷酸片段合成hcvme后段B，其中5′端包含kpnI酶切位點(diǎn)。這兩條片段中都包含了相應(yīng)的表位接頭編碼序列。
3、丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆的全長(zhǎng)基因克隆利用丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆前段A和后段B的kpnI酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切和連接后將A和B連接起來，即為本發(fā)明全長(zhǎng)基因克隆hcvme；將hcvme與原核或真核重組表達(dá)載體連接并轉(zhuǎn)化相應(yīng)菌株或細(xì)胞后，可表達(dá)hcvme編碼的蛋白HCVME。
本發(fā)明具有如下特點(diǎn)1、采用設(shè)計(jì)26條前后相互重疊的寡核苷酸片段混合PCR分段合成基因，限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接基因片段相結(jié)合的方法，并分為A、B兩段分別進(jìn)行PCR合成，構(gòu)建丙型肝炎病毒多表位抗原基因全長(zhǎng)克隆，避免了由于全基因較長(zhǎng)，一次性合成容易出現(xiàn)突變的缺點(diǎn)。
2、應(yīng)用畢赤酵母偏性密碼子并適當(dāng)應(yīng)用大腸桿菌偏性密碼子來設(shè)計(jì)基因，為hcvme基因既能在大腸桿菌中表達(dá)進(jìn)行前期研究又能在真核細(xì)胞中大量表達(dá)為后期準(zhǔn)備擴(kuò)大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
3、B表位之間及B表位和T表位之間用甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸分開，T表位之間用丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸分開，為各表位都能被有效提呈提供了條件。
4、利用丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆，可以研制多種形式、兼有防治功能的丙型肝炎侯選疫苗，用于HCV感染的防治；可以研制多種丙肝病毒抗原或抗體的檢測(cè)試劑，用于HCV患者的診斷。


圖1.pMD-HCVME重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意2.hcvme前段基因片段A的合成示意3.hcvme后段基因片段B的合成示意4.重組質(zhì)粒pMD-HCVME1的構(gòu)建流程5.重組質(zhì)粒pMD-HCVME2的構(gòu)建流程6.重組質(zhì)粒pMD-HCVME的構(gòu)建流程7.原核融合表達(dá)質(zhì)粒pGEX-HCVME的構(gòu)建流程8.10條天然HVR1合成肽與雄性家兔免疫血清(1∶1000)的交叉反應(yīng)頻率圖具體實(shí)施方式
丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆(hcvme)的具體構(gòu)建方法如下一、合成hcvme基因所需的26條寡核苷酸片段(見SEQ ID NO.2，由上海申能博彩生物技術(shù)公司合成)。
二、26條寡核苷酸片段既是引物也是模板，經(jīng)PCR反應(yīng)分別合成前后兩段基因片段A和B，PCR合成和拼接反應(yīng)均應(yīng)用ExpandTMLong Template PCR系統(tǒng)。
1、hcvme前段基因片段A的合成(圖2)1-14號(hào)寡核苷酸片段(30μM)各0.5μldNTP(10mM) 2.0μl10×PCR buffer 5.0μlDNA聚合酶混合液(10單位/μl) 1.0μl滅菌重蒸水 35μl按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃ 30秒、65℃ 30秒、74℃ 1分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后74℃延伸10分鐘。
2、hcvme后段基因片段B的合成(圖3)15-26號(hào)寡核苷酸片段(30μM) 各0.5μldNTP(10mM) 2.0μl10×PCR buffer 5.0μlDNA聚合酶混合液(10單位/μl) 1.0μl滅菌重蒸水 35μl按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃ 30秒、65℃ 30秒、74℃ 1分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后74℃延伸10分鐘。
三、按常規(guī)將PCR合成后純化的前段基因片段A與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布Amp+瓊脂培養(yǎng)平板，37℃過夜，挑取8個(gè)克隆進(jìn)行小量質(zhì)粒抽提，所得質(zhì)粒經(jīng)酶切及1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確認(rèn)獲得陽性克隆。重組質(zhì)粒命名為pMD-HCVME1。(圖4)四、按常規(guī)將PCR合成后純化的后段基因片段B與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布Amp+瓊脂培養(yǎng)平板，37℃過夜，挑取8個(gè)克隆進(jìn)行小量質(zhì)粒抽提，所得質(zhì)粒經(jīng)酶切及1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確認(rèn)獲得陽性克隆。重組質(zhì)粒命名為pMD-HCVME2。(圖5)五、按常規(guī)將重組質(zhì)粒pUC-HCVME1用BamHI+KpnI酶切，回收約568bp的基因片段；將重組質(zhì)粒pUC-HCVME2用KpnI+Sal I酶切，回收約432bp的基因片段?；厥盏膬蓚€(gè)片段與經(jīng)BamHI+Sal I酶切的pMD18-T載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布Amp+瓊脂培養(yǎng)平板，37℃過夜，挑取8個(gè)克隆進(jìn)行小量質(zhì)粒抽提，所得質(zhì)粒經(jīng)酶切及1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確認(rèn)獲得陽性克隆。重組質(zhì)粒命名為pMD-HCVME。(圖6)六、取pMD-HCVME質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。結(jié)果表明，hcvme基因全長(zhǎng)975bp，其核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列分別見序列表3和序列表4(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，與所設(shè)計(jì)的序列相同。
丙型肝炎病毒多表位抗原基因(hcvme)同gst基因融合表達(dá)一、構(gòu)建原核融合表達(dá)質(zhì)粒pGEX-HCVME重組質(zhì)粒pMD-HCVME經(jīng)BamHI/SalI雙酶切后，回收目的片段。原核融合表達(dá)載體pGEX-4T-1經(jīng)BamHI/SalI雙酶切后，回收載體片段。兩個(gè)片段在DNA連接酶作用下于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布Amp+瓊脂培養(yǎng)平板，37℃過夜，挑取16個(gè)克隆進(jìn)行小量質(zhì)粒抽提，用BamHI/SaI酶切及1％瓊脂糖凝膠電泳，鑒定出陽性克隆。重組質(zhì)粒命名為pGEX-HCVME。(圖7)二、篩選高效表達(dá)克隆從上述鑒定出的pGEX-HCVME陽性克隆中挑取6株菌，用轉(zhuǎn)入空白載體pGEX-4T-1的2株菌作對(duì)照，分別在3mL的2×YT培養(yǎng)基中37℃擴(kuò)增12h，加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至終濃度為0.6mmol/L誘導(dǎo)3h。誘導(dǎo)結(jié)束后各取1mL菌液，常規(guī)處理及7.5％PAGE電泳檢測(cè)，根據(jù)肉眼觀察電泳條帶中目的蛋白條帶濃度來篩選高效表達(dá)克隆。
三、優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件用上述篩選獲得的高效表達(dá)株進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件。首先，確定誘導(dǎo)的菌液濃度，在3mL的2×YT培養(yǎng)基中，新鮮過夜培養(yǎng)菌液按1∶100接種，于37℃培養(yǎng)，高速振搖250rpm/min，取不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定OD600值，在不同OD600值下以0.6mmol/L IPTG誘導(dǎo)3h，收集菌液1mL，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。而后，確定IPTG誘導(dǎo)的溫度，以菌液OD600約為1.0時(shí)開始誘導(dǎo)，分別在20℃、25℃、28℃、30℃及37℃誘導(dǎo)3h，收集菌液1mL，檢測(cè)蛋白表達(dá)量。而后，在菌液OD600約為1.0，誘導(dǎo)溫度28℃，IPTG濃度0.6mmol/L條件下，確定誘導(dǎo)時(shí)間，取誘導(dǎo)1h、2h、3h及4h的菌液1mL，檢測(cè)蛋白表達(dá)量。最終確定菌液OD600＝0.6、溫度為28℃、IPTG濃度為0.6mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為3h為最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。
四、融合蛋白GST-HCVME的大量表達(dá)和親和層析純化應(yīng)用上述確定的誘導(dǎo)表達(dá)條件，并優(yōu)化超聲破碎條件和洗脫條件來大量獲得融合蛋白GST-HCVME。具體步驟將重組菌劃Amp+瓊脂培養(yǎng)平板，37℃過夜。挑取單克隆菌落在10mL的2×YT培養(yǎng)基中37℃擴(kuò)增12h，而后，按1∶100接種稀釋接種于預(yù)熱的2×YT培養(yǎng)基中，高速振搖2h，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，于28℃誘導(dǎo)3h。用8000rpm/min×10min 4℃離心收集菌體，對(duì)應(yīng)1mL菌液用50μL冰預(yù)冷的1×PBS懸浮細(xì)菌，在冰浴中進(jìn)行超聲破碎，取少量嘗試在破碎時(shí)分別加入溶菌酶或加入TritonX-100或加入DTT輔助破碎。而后，破碎液內(nèi)加入20％的TritonX-100至終濃度1％，室溫下低速振蕩30min，溶解蛋白。用12000rpm/min×10min 4℃離心后將上清轉(zhuǎn)移到干凈的器皿中，即為胞漿蛋白提取液。用1×PBS平衡10mL的Glutathione SepharoseTM 4B后，加入上述胞漿蛋白提取液，控制流速1mL/min，用10倍柱床體積的1×PBS洗至基線后，用10mmol/L的還原性谷胱甘肽(溶于50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，洗脫GST-HCVME蛋白。蛋白經(jīng)透析除鹽、冷凍干燥后，用純水溶解，用Bradford法測(cè)定濃度
hcvme同gst基因融合表達(dá)產(chǎn)物GST-HCVME的免疫原性研究一、GST-HCVME與丙肝抗體陽性血清的反應(yīng)性用ELISA方法檢測(cè)。所用HCV ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。
方法是以純化的GST-HCVME包被酶標(biāo)板，用正常人血清作陰性對(duì)照，分別檢測(cè)20份丙肝抗體陽性血清。具體步驟如下1、包被純化的GST-HCVME用包被液稀釋為0.5μg/μl，加100μg/孔，于4℃包被過夜。
2、封閉用封閉液將孔加滿，并去除各孔中的貼壁氣泡，37℃封閉40min(或4℃封閉過夜)。
3、準(zhǔn)備包被過夜的酶標(biāo)板用洗滌液洗滌3次，每次3min，并將孔條作好標(biāo)記。
4、加樣用樣品稀釋液按1∶10、1∶100或1∶200分別稀釋待測(cè)血清和陰性對(duì)照血清，按100μl/孔加入檢測(cè)孔中，以樣品稀釋液作為空白對(duì)照，所有檢測(cè)均設(shè)復(fù)孔。
5、孵育粘上封板紙，置37℃恒溫反應(yīng)60分鐘。
6、洗板棄孔中液體，用洗滌液加滿孔洗滌，放置15-20秒鐘后棄液體，在吸水紙上拍干，如此反復(fù)洗五次。
7、酶標(biāo)每孔加酶標(biāo)二抗工作液(HRP-羊抗人IgG 1∶1000稀釋)100μl，粘上封板紙，置37℃恒溫反應(yīng)60分鐘。
8、洗板同前(6)。
9、顯色每孔加TMB顯色劑A、B各50μl，37℃避光顯色5-10分鐘。
10、終止每孔中加終止液50μl，輕輕混勻，終止反應(yīng)。
11、比色測(cè)雙波長(zhǎng)OD450nm/630nm，空白孔校零，酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)光吸收值。
12、結(jié)果判定P/N≥2.1時(shí)為陽性；反之為陰性。
結(jié)果見表1
表1、GST-HCVME與丙肝抗體陽性血清的反應(yīng)性樣品 OD450/630結(jié)果 樣品 OD450/630結(jié)果 樣品 OD450/630結(jié)果1 0.144 + 9 1.00+ 170.045 -2 0.132 + 10 0.15+ 180.051 -3 0.065 - 11 0.12+ 190.034 -4 0.382 + 12 0.20+ 200.131 +5 0.657 + 13 0.13+ C10.032 -6 0.041 - 14 0.11+ C20.042 -7 0.111 + 15 0.84+ C30.035 -8 0.163 + 16 0.90+ C40.028 -注意表中數(shù)據(jù)為兩次獨(dú)立檢測(cè)結(jié)果的平均值。C為陰性對(duì)照(N)，以P/N≥2.1為陽性(+)。
由表1數(shù)據(jù)計(jì)算可知GST-HCVME能同20份丙肝抗體陽性血清中的15份發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)頻率為75％。
二、抗GST-HCVME與10條天然HVR1合成肽的交叉反應(yīng)性1、動(dòng)物免疫及免疫血清的收集①制備GST-HCVME乳化液將純化的GST-HCVME經(jīng)干燥后用純水溶解，調(diào)整蛋白濃度為0.2μg/μl，加入等體積的完全弗氏佐劑(首次接種時(shí))和不完全弗氏佐劑(加強(qiáng)免疫時(shí))后，用超聲破菌器在100w功率下，冰水浴中多次乳化(一次乳化2mL，共需10次左右)，取乳化后液體5～10μl滴入冷水中，油滴浮于水面而不分散者為乳化完全。
②免疫動(dòng)物新西蘭雄性家兔(夠自第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)共6只，分為兩組，每組各3只；一組為實(shí)驗(yàn)組(注射GST-HCVME乳化液)，一組為陰性對(duì)照組(不注射)。
將實(shí)驗(yàn)組家兔背部皮肽剃毛消毒，選擇6～8個(gè)部位分別注射乳化液0.5～1ml/處，以后每隔2周接種一次，共接種5次，首次接種劑量為1.0mg/只·次，加強(qiáng)免疫接種為0.2～1.0mg/只·次。免疫前和每次免疫后一周采血，血液置室溫中凝固約1h，然后置4℃過夜進(jìn)一步收縮血塊，第2天離心，收集上清液即為免疫血清。及時(shí)分裝凍存待測(cè)。
③制備抗GST-HCVME多克隆抗體家兔末次免疫14天(即首次免疫后第12周)后，動(dòng)物禁食24h，心臟采血，血清以33％飽和硫酸銨沉淀(4℃，靜置30min)，5000rpm離心15min。棄沉淀，上清再以50％飽和硫酸銨沉淀(4℃，靜置30min)，5000rpm離心15min。沉淀溶于適量PBS(pH7.2)溶液中，置透析袋對(duì)PBS(pH7.2)透析去除硫酸銨即為抗GST-HCVME多克隆抗體。0.22μm濾器過濾除菌后，分裝、凍存?zhèn)溆谩?br> 2、抗GST-HCVME抗體與天然HVR1合成肽的交叉反應(yīng)性以10條不同的HVR1變異株的合成肽[氨基酸序列見(SEQ ID NO.5)]分別包被Immunuoplate Maxisorp檢測(cè)板，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)免疫兔血清中是否含有交叉識(shí)別GST-HCVME的特異性抗體(結(jié)果見圖8)。由圖可以看出，從首次免疫后第8周，10條肽中的9條可識(shí)別抗GST-HCVME多克隆抗體，僅第5條不與抗GST-HCVME多克隆抗體反應(yīng)，而且各個(gè)HVR1肽的識(shí)別反應(yīng)強(qiáng)度不同。此結(jié)果提示，GST-HCVME中的模擬表位在一定程度上可誘導(dǎo)出交叉反應(yīng)性抗體，預(yù)示其作為疫苗應(yīng)用時(shí)，具有誘導(dǎo)交叉保護(hù)的能力。
由以上結(jié)果表明，本發(fā)明丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆hcvme及其表達(dá)的蛋白HCVME，可用于制備HCV抗原或抗體的檢測(cè)試劑，也可用于制備HCV核酸疫苗及多肽疫苗。
Organization Applicant----------------------Street上海市翔殷路City上海市State上海市Country中國(guó)PostalCode200433PhoneNumberFaxNumberEmailAddress<110>OrganizationName第二軍醫(yī)大學(xué)Application Project-------------------<120>TitleSEQ ID NO.1<130>AppFileReference1<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence--------<213>OrganismName1<400>PreSequenceStringQTHTTGGQAGHQAHSLTGLFSPGAKQN27
<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameF78SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組HVR1區(qū)384-410區(qū)段，為模擬B表位Sequence--------<213>OrganismName2<400>PreSequenceStringTTHTGGQQAHTTSRLVSLFSPGASQK 26<212>TypePRT<211>Length26SequenceNameE19SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組HVR1區(qū)384-410區(qū)段，為模擬B表位Sequence--------<213>OrganismName3<400>PreSequenceStringQTHTTGGVVSHQTRSLVGLFSPGPQQN27<212>TypePRT
<211>Length27SequenceNameM63SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組HVR1區(qū)384-410區(qū)段，為模擬B表位Sequence--------<213>OrganismName4<400>PreSequenceStringQTTTTGGQVSHATHGLTGLFSLGPQQK27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameD6SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組HVR1區(qū)384-410區(qū)段，為模擬B表位Sequence--------<213>OrganismName5<400>PreSequenceStringTTHTVGGSVARQVHSLTGLFSPGPQQK27<212>TypePRT<211>Length27
SequenceNameG31SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組HVR1區(qū)384-410區(qū)段，為模擬B表位Sequence--------<213>OrganismName6<400>PreSequenceStringQTHTTGGVVGHATSGLTSLFSPGPSQK27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameH1SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組HVR1區(qū)384-410區(qū)段，為模擬B表位Sequence--------<213>OrganismName7<400>PreSequenceStringTTTTTGGQVGHQTSGLTGLFSPGAQQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameR6
SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組HVR1區(qū)384-410區(qū)段，為模擬B表位Sequence--------<213>OrganismName8<400>PreSequenceStringQTTTTGGSASHAVSSLTGLFSPGSKQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameM122SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組HVR1區(qū)384-410區(qū)段，為模擬B表位Sequence--------<213>OrganismName9<400>PreSequenceStringQTTVVGGSQSHTVRGLTSLFSPGASQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameR9SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組HVR1區(qū)384-410區(qū)段，為模擬B表位Sequence--------<213>OrganismName10<400>PreSequenceStringYLLPRRGPRL10<212>TypePRT<211>Length10SequenceNameC-T1SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組C區(qū)35-44區(qū)段，為CTL表位Sequence--------<213>OrganismName11<400>PreSequenceStringDLMGYIPLV9<212>TypePRT<211>Length9SequenceNameC-T2
SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組C區(qū)132-140區(qū)段，為CTL表位Sequence--------<213>OrganismName12<400>PreSequenceStringCVNGVCWTV9<212>TypePRT<211>Length9SequenceNameNS3-T1SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組NS3區(qū)1073-1081區(qū)段，為CTL表位Sequence--------<213>OrganismName13<400>PreSequenceStringVLVLNPSVA9<212>TypePRT
<211>Length9SequenceNameNS3-T2SequenceDescription位于丙型肝炎病毒基因組NS3區(qū)1251-1259區(qū)段，為Th表位<120>TitleSEQ ID NO.2<130>AppFileReference2<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence--------<213>OrganismName1<400>PreSequenceStringcggatccgaa ttcatgggtc caggtagaca aacc[cacacc accggtggtc aagctg]56<212>TypeDNA<211>Length56SequenceName1SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的1號(hào)片段Sequence
--------<213>OrganismName2<400>PreSequenceString(ctggagagaa caaaccggtc)aaagagtgag cttggtgac[c agcttgacca ccggtggtgtg]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName2SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的2號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName3<400>PreSequenceString(gaccggtttg ttctctccag)gtgctaagca aaacggtcca[ggtactaccc acaccggtgg]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName3SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的3號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName4
<400>PreSequenceString(gaacaaagaa accaatctgg)aggtggtgtg agcttgttga[ccaccggtgt gggtagtacc]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName4SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的4號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName5<400>PreSequenceString(ccagattggt ttctttgttc)tctccaggtg cttctcaaaa[gggtccaggt caaacccacac]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName5SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的5號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName6<400>PreSequenceString
(accaaggatc tggtttggtg)agaaacaaca ccaccggtg[g tgtgggtttg acctggaccc]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName6SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的6號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName7<400>PreSequenceString(caccaaacca gatccttggt)tggtttgttc tctccaggtc[cacaacaaaa cggtccaggtc]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName7SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的7號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName8<400>PreSequenceString(gggtagcgtg agaaacttga)ccaccggtgg tggtggttt[g acctggaccg ttttgttgtg]
60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName8SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的8號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName9<400>PreSequenceString(tcaagtttct cacgctaccc)acggtttgac cggtttgtt[c tctttgggtc cacaacaaaag]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName9SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的9號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName10<400>PreSequenceString(agcaacagaa ccaccaacgg)tgtgggtagt acctggacc[c ttttgttgtg gacccaaagag]61
<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName10SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的10號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName11<400>PreSequenceString(ccgttggtgg ttctgttgct)agacaagttc actctttg[ac cggtttgttc tctccaggtc]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName11SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的11號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName12<400>PreSequenceString(accggtggtg tgggtttgac c)tggaccctt ttgttgtg[ga cctggagaga acaaaccggt]60<212>TypeDNA
<211>Length60SequenceName12SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的12號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName13<400>PreSequenceString(ggtcaaaccc acaccaccgg t)ggtgttgtt ggtcacgct[a cctctggttt gacctctttg]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName13SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的13號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName14<400>PreSequenceStringggtggtacct ggaccctttt gagatggacc tggagagaa[c aaagaggtca aaccagaggt]60<212>TypeDNA<211>Length60
SequenceName14SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的14號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName15<400>PreSequenceStringcggtaccacc accaccaccg gtggtcaagt tggtcac[caa acctctggtt tgaccggtttg]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName15SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的15號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName16<400>PreSequenceString(ggtttgacct ggaccgtttt)gttgagcacc tggagagaa[c aaaccggtca aaccagaggtttg]63<212>TypeDNA<211>Length63
SequenceName16SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的16號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName17<400>PreSequenceString(aaaacggtcc aggtcaaacc)accaccaccg gtggttctg[c ttctcacgct gtttcttctttg]62<212>TypeDNA<211>Length62SequenceName17SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的17號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName18<400>PreSequenceString(ggaccgtttt gcttagaacc)tggagagaac aaaccggt[ca aagaagaaac agcgtgagaag]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName18
SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的18號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName19<400>PreSequenceString(ggttctaagc aaaacggtcc)aggtaagcaa accaccgtt[g ttggtggttc tcaatctcac]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName19SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的19號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName20<400>PreSequenceString(aagcacctgg agagaacaaa)gaggtcaaac ctctaacggt[gtgagattga gaaccaccaac]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName20SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的20號(hào)片段
Sequence--------<213>OrganismName21<400>PreSequenceString(tttgttctct ccaggtgctt)ctcaaaacgg tccaggttgt[gttaacggtg tttgttggac]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName21SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的21號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName22<400>PreSequenceString(agcaacagat gggttcaaaa)ccaaaacgta agcagcaacg[gtccaacaaa caccgttaac]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName22SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的22號(hào)片段
Sequence--------<213>OrganismName23<400>PreSequenceString(ttttgaaccc atctgttgct)gctgcttact acttgttgc[c aagaagaggt ccaagattgg]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName23SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的23號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName24<400>PreSequenceString(gcagcaacca atgggatgta)acccatcaag tcgtaagcag[ccaatcttgg acctcttcttg]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName24SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的24號(hào)片段Sequence--------
<213>OrganismName25<400>PreSequenceString(tacatcccat tggttgctg[c) ttactaagcggccgcgtcgacg]42<212>TypeDNA<211>Length42SequenceName25SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的25號(hào)片段Sequence--------<213>OrganismName26<400>PreSequenceString[cgtcgacgcg gccgcttagtaag]23<212>TypeDNA<211>Length23SequenceName26SequenceDescription合成的26條寡核苷酸片段中的26號(hào)片段注()中為5′端互補(bǔ)部分，[]中為3′端互補(bǔ)部分。
<120>TitleSEQ ID NO.3<130>AppFileReference3<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence--------<213>OrganismName1<400>PreSequenceStringatgggtccag gtagacaaac ccacaccacc ggtggtcaag ctggtcacca agctcactct60ttgaccggtt tgttctctcc aggtgctaag caaaacggtc caggtactac ccacaccggt120ggtcaacaag ctcacaccac ctccagattg gtttctttgt tctctccagg tgcttctcaa180aagggtccag gtcaaaccca caccaccggt ggtgttgttt ctcaccaaac cagatccttg240gttggtttgt tctctccagg tccacaacaa aacggtccag gtcaaaccac caccaccggt300ggtcaagttt ctcacgctac ccacggtttg accggtttgt tctctttggg tccacaacaa360aagggtccag gtactaccca caccgttggt ggttctgttg ctagacaagt tcactctttg420accggtttgt tctctecagg tccacaacaa aagggtccag gtcaaaccca caccaccggt
480ggtgttgttg gtcacgctac ctctggtttg acctctttgt tctctccagg tccatctcaa540aagggtccag gtaccaccac caccaccggt ggtcaagttg gtcaccaaac ctctggtttg600accggtttgt tctctccagg tgctcaacaa aacggtccag gtcaaaccac caccaccggt660ggttctgctt ctcacgctgt ttcttctttg accggtttgt tctctccagg ttctaagcaa720aacggtccag gtaagcaaac caccgttgtt ggtggttctc aatctcacac cgttagaggt780ttgacctctt tgttctctcc aggtgcttct caaaacggtc caggttgtgt taacggtgtt840tgttggaccg ttgctgctta cgttttggtt ttgaacccat ctgttgctgc tgcttactac900ttgttgccaa gaagaggtcc aagattggct gcttacgact tgatgggtta catcccattg960gttgctgctt actaa975<212>TypeDNA<211>Length975SequenceNamehcvmeSequenceDescriptionhcvme基因核苷酸序列
<120>TitleSEQ ID NO.4<130>AppFileReference4<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence--------<213>OrganismName1<400>PreSequenceStringMGPGRQTHTT GGQAGHQAHS LTGLFSPGAK QNGPGTTHTG GQQAHTTSRL VSLFSPGASQ60KGPGQTHTTG GVVSHQTRSL VGLFSPGPQQ NGPGQTTTTG GQVSHATHGL TGLFSLGPQQ120KGPGTTHTVG GSVARQVHSL TGLFSPGPQQ KGPGQTHTTG GVVGHATSGL TSLFSPGPSQ180KGPGTTTTTG GQVGHQTSGL TGLFSPGAQQ NGPGQTTTTG GSASHAVSSL TGLFSPGSKQ240NGPGKQTTVV GGSQSHTVRG LTSLFSPGAS QNGPGCVNGV CWTVAAYVLV LNPSVAAAYY300LLPRRGPRLA AYDLMGYIPLVAAY324<212>TypePRT<211>Length324SequenceNameHCVME
SequenceDescriptionhcvme基因編碼的蛋白序列<120>TitleSEQ ID NO.5<130>AppFileReference5<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence--------<213>OrganismName1<400>PreSequenceStringNTRITGGSAARTTGGFVGLFSPGAKQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameHCV-SH3SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName2<400>PreSequenceString
GTYTTGGAQGRATQGLTSLFSRGSAQK27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameHCV-BJ2SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName3<400>PreSequenceStringSTHVTGGVQGHSLQRLTSLFTFGPAQK27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameXL1SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName4<400>PreSequenceStringHTRTTGGVAARTTSGLTSLFSSGPSQK27<212>TypePRT
<211>Length27SequenceNameXL11SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName5<400>PreSequenceStringGTRVTGGAQGRYHRSLTSLFTPGPTQR27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameXL15SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName6<400>PreSequenceStringETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGAKQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceName6
SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName7<400>PreSequenceStringNTYVTGGSAGRAVAGFAGLLQPGAKQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceName7SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName8<400>PreSequenceStringETHSVGGSAAHTTSRFTSLFSPGPQQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceName8SequenceDescription天然HVR1合成肽
Sequence--------<213>OrganismName9<400>PreSequenceStringSTYSMGGAAAHNARGLTSLFSSGASQR27<212>TypePRT<211>Length27SequenceName9SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName10<400>PreSequenceStringETYIIGAATGRTTAGLTSLFSSGSQQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceName10SequenceDescription天然HVR1合成肽
權(quán)利要求
1.一種丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆hcvme，其特征在于包含了HCV基因組E2區(qū)中HVR1模擬B細(xì)胞表位基因9條和T細(xì)胞表位基因4條，其中T細(xì)胞表位基因的4條為C區(qū)保守CTL表位2條、NS3區(qū)保守CTL表位1條及NS3區(qū)保守Th表位1條，各表位基因之間以三個(gè)氨基酸的編碼序列為接頭串聯(lián)而成，其中B表位之間及B表位和T表位之間為甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸的編碼序列，T表位之間為丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸的編碼序列，hcvme的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
2.權(quán)利要求1所述基因克隆hcvme所表達(dá)的多表位抗原HCVME，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4。
3.權(quán)利要求1所述的基因克隆hcvme在制備HCV核酸疫苗或多肽疫苗中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的多表位抗原HCVME在制備HCV多肽疫苗及HCV抗原或抗體的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，是丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆hcvme及其編碼的多表位抗原HCVME。hcvme包含了HCV基因組E2區(qū)中HVR1模擬B細(xì)胞表位基因9條和T細(xì)胞表位基因4條，其中T細(xì)胞表位基因的4條為C區(qū)保守CTL表位2條、NS3區(qū)保守CTL表位1條及NS3區(qū)保守Th表位1條。經(jīng)一系列試驗(yàn)研究表明，其與gst基因的原核融合表達(dá)產(chǎn)物GST－HCVME和丙肝抗體陽性血清有高交叉反應(yīng)性，GST－HCVME免疫雄性家兔后的血清對(duì)天然HVR1合成肽有高識(shí)別頻率。因此，hcvme及其表達(dá)產(chǎn)物HCVME可用于制備丙型肝炎的核酸疫苗、多肽疫苗以及HCV抗原或抗體的檢測(cè)試劑。
文檔編號(hào)C12N15/13GK1609213SQ20041006647
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者戚中田, 高軍, 趙平, 龔育平, 趙蘭娟, 潘欣 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)