專利名稱：采用pcr技術檢測ad患者hla－dr的制作方法
所屬領域本發(fā)明屬于對致病基因的檢測方法，尤其是一種采用PCR技術檢測AD患者HLA-DR3基因型的方法。
背景技術：
異位性皮炎(Atopic Dermatitise，簡稱AD)是一種慢性炎癥性皮膚病，又稱特應性皮炎或遺傳過敏性皮炎，是一種有明顯家族聚集傾向、慢性復發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病。目前AD患病率呈逐年上升趨勢，同時伴有哮喘和變應性鼻炎，但其發(fā)病機制尚未明確，病因不明，一般認為是遺傳和環(huán)境共同作用導致發(fā)病，是一種多基因病。隨著分子生物學技術的廣泛應用，從分子水平上研究生命現象成為了現實。因此，利用序列特異性聚合酶鏈反應(PolymeraseChain Reaction，簡稱PCR)研究AD患者人類白細胞抗原(Human LeucocyteAntigen，簡稱HLA)-DRB的基因，從而檢測出AD患者是否攜帶HLA-DR3等位基因，有利于對患者進行早期診斷治療，避免患者病情的進一步發(fā)展。
通過檢索，截止目前尚未發(fā)現通過PCR技術檢測AD患者的HLA-DR3基因型的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用PCR技術檢測AD患者HLA-DR3基因型的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現的工藝方法為(1)提取AD患者的靜脈血并采用2％EDTA抗凝；(2)采用低滲法對抗凝后的靜脈血進行白細胞的分離；(3)采用酚-氯仿法制備基因組模板DNA；(4)在已消毒過的0.5ml Eppendorf管中依次加入以下試劑a.模板DNA 1μl(濃度為0.05～0.1μg/μl)；b.引物4μl(濃度為2μmol/l)，c.反應液20μl(含Taq酶0.5U，dNTP 50μmol)；
(5)對試劑實施預變性，變性溫度93～95℃，時間為118～122秒；(6)對試劑實施變性，變性溫度為93～95℃，時間為38～42秒；(7)對試劑實施退火，溫度為53～55℃，時間為43～47秒；(8)對試劑實施延伸，溫度71～73℃，時間為38～42秒；(9)重復(6)、(7)、(8)步驟28～32個循環(huán)；(10)循環(huán)后保持延伸溫度4～6分鐘，得出PCR擴增產物含有HLA-DR3基因型的最終試劑。
所述的引物是依據第十一屆HLA Workshop會議確定的基因核苷酸序列所設計的特異性引物。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是本方法利用分子生物學技術，從HLA-DRB基因調節(jié)免疫應答的角度研究了異位性皮炎的發(fā)病機制，對于臨床早期診斷和評估病程具有重要意義，為異位性皮炎的基因治療奠定了理論基礎。通過本方法不僅可以找到AD患者的易感基因和抗性基因，還可明確AD患者的HLA-DRB易感基因的單鏈構象多態(tài)性是否有堿基突變，從分子水平確定了在AD患者中起決定作用的HLA-DR3等位基因是否異常，從而實現對患者的早期診斷和治療。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明實施例做進一步詳述具體的工藝方法為1.基因組DNA的提取提取AD患者的靜脈血5ml，并采用2％EDTA抗凝；2.采用通用的低滲法對抗凝后的靜脈血進行白細胞的分離；3.然后采用酚-氯仿法提取該AD患者的基因組DNA，該基因組DNA作為下列檢測的模板DNA；4.采用序列特異性引物PCR擴增技術，制備PCR擴增產物。
試劑準備在已消毒過的0.5ml Eppendorf管中依次加入以下試劑a.模板DNA 1μl(濃度為0.05～0.1μg/μl)，b.引物4μl(濃度為2μmol/l)，該引物是依據第十一屆HLA Workshop會議確定的基因核苷酸序列所設計的特異性引物。
c.反應液20μl(含Taq酶0.5U，dNTP 50μmol)。
擴增產物制備工藝a.預變性預變性溫度為93～95℃，時間為118～122秒，最佳溫度和時間分別為94℃、120秒。
b.變性變性溫度為93～95℃，時間為38-42秒；最佳溫度和時間為94℃、40秒。
上述兩個步驟的作用將復雜的DNA分子變性為單鏈，避免因溫度過高或持續(xù)時間過長，對Taq DNA聚合酶活性和脫氧核糖核苷三磷酸底物造成損壞。此外我們可以控制根據模板DNA的復雜程度，我們可以細微調整變性溫度和時間。
c.退火溫度為53～55℃，時間為43～47秒，最佳溫度和時間分別為54℃、45秒。此步驟的作用Tm＝4(G+C)+2(A+T)在Tm允許的范圍內，提高PCR反應的特異性，根據引物的長度和其G+C含量確定退火溫度，避免因退火溫度選擇不當造成引物與模板間的非特異結合大大減少的現象。
d.延伸溫度71～73℃，時間為38～42秒，最佳溫度和時間分別為72℃、40秒。該步驟的作用保證Taq DNA聚合酶具有最高的活性，該延伸反應的時間是根據擴增片段的長度確定的。
e.循環(huán)上述三個步驟完成后，進行b、c、d的整體循環(huán)，循環(huán)次數為28～32個循環(huán)，最佳循環(huán)次數為30個循環(huán)。該PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。
f.循環(huán)后保持延伸溫度4～6分鐘，最佳5分鐘。
5.擴增產物制備后，采用2％瓊脂糖凝膠在電泳儀上進行電泳，然后在紫外線燈下進行觀察，如果含有HLA-DR3等位基因，則在相應位置出現有特征條帶，證明該AD患者攜帶有HLA-DR3等位基因。
下面簡單敘述一下本方法各工步的工作原理變性通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。
退火當溫度突然降低時，由于模板分子結構較引物復雜的多，而且反應體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈間互補的機會較少。
延伸在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在下，5′-3′的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應。
以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產物可以作為下一循環(huán)的模板，數小時后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量復制。
權利要求
1.一種采用PCR技術檢測AD患者HLA-DR3基因型的方法，其特征在于工藝方法為(1)提取AD患者的靜脈血并采用2％EDTA抗凝；(2)采用低滲法對抗凝后的靜脈血進行白細胞的分離；(3)采用酚-氯仿法制備基因組模板DNA；(4)在已消毒過的0.5ml Eppendorf管中依次加入以下試劑a.模板DNA 1μl，濃度為0.05～0.1μg/μl；b.引物4μl，濃度為2μmol/l，c.反應液，20μl，含Taq酶0.5U，dNTP 50μmol；(5)對試劑實施預變性，預變性溫度93～95℃，時間為118～122秒；(6)對試劑實施變性，變性溫度為93～95℃，時間為38～42秒；(7)對試劑實施退火，溫度為53～55℃，時間為43～47秒；(8)對試劑實施延伸，溫度71～73℃，時間為38～42秒；(9)重復(6)、(7)、(8)步驟28～32個循環(huán)；(10)循環(huán)后保持延伸溫度4～6分鐘，得出PCR擴增產物含有HLA-DR3基因型的最終試劑。
2.根據權利要求1所述的采用PCR技術檢測AD患者HLA-DR3基因型的方法，其特征在于所述的引物是依據第十一屆HLA Workshop會議確定的基因核苷酸序列所設計的特異性引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用PCR技術檢測AD患者HLA－DR
文檔編號C12Q1/68GK1635141SQ20031012206
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月31日 優(yōu)先權日2003年12月31日
發(fā)明者張玉環(huán), 趙宏麗, 王學謙, 孫曉慧, 劉玉笰, 李虹, 康瑞珠 申請人:天津市長征醫(yī)院