專利名稱：棉花黃萎病菌分泌型激發(fā)子基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物抗病基因工程領(lǐng)域，更具體地涉及一種能夠在棉花及其它植物上引起抗病過敏反應(yīng)的非特異性大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)激發(fā)子的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
識別在植物與病原物的互作過程中起著關(guān)鍵作用。病原物必須識別其生存環(huán)境中可能的寄主植物，并進一步識別寄主植物特殊的表面特征以便成功的侵入和侵染，病原物要成功的侵染寄主，必須識別并克服植物的防衛(wèi)反應(yīng)。與此同時，植物也必須識別其生存環(huán)境中各種各樣可能的病原物并啟動自身相應(yīng)的防衛(wèi)機制。
在植物與病原物的識別過程中，激發(fā)子及其受體起著非常重要的作用。激發(fā)子最初僅表示能誘導(dǎo)植物合成并積累植物保衛(wèi)素的分子或其他刺激因子，但現(xiàn)在普遍用于所有能刺激防衛(wèi)機制的分子，包括寡糖，糖蛋白，多肽和脂類分子等。
激發(fā)子可能是來源于病原菌的物質(zhì)分子，也可能是在病原菌的作用下植物釋放的化合物。激發(fā)子可以分為2大類，非特異性的激發(fā)子和小種特異性的激發(fā)子。非特異性激發(fā)子能夠在寄主和非寄主植物上引起防衛(wèi)反應(yīng)，而特異性的激發(fā)子只能在特異品種的植物上引起抗病反應(yīng)。
植物的防衛(wèi)機制包括抗微生物的植物保衛(wèi)素的合成和積累，攻擊病原物表面多聚物的糖基水解酶的產(chǎn)生，活性氧的產(chǎn)生，細胞的過敏性壞死，抑制病原物降解酶的蛋白質(zhì)抑制物的合成和由于胼胝質(zhì)、富含羥脯氨酸糖蛋白或木質(zhì)素沉積而對植物細胞壁的修飾作用。最終的結(jié)果是增強植物的抗病性。
植物病害嚴重影響植物的生長發(fā)育，病害的發(fā)生往往給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的損失，嚴重影響國民經(jīng)濟的發(fā)展。在植物病害的防治方面，由于毒性、殘留和抗藥性三大問題，化學防治的應(yīng)用受到很大限制。隨著分子生物學的深入發(fā)展和重組DNA技術(shù)的日趨完善，利用抗病基因工程來改良作物的抗病性，近年來取得了迅速的發(fā)展。
最初的策略是在植物中過量表達抗菌蛋白以增強作物的抗病性，但是這種方法往往會影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且這種抗性往往只局限于很少幾種病原菌，不能產(chǎn)生廣譜的抗病性。最重要的是，轉(zhuǎn)入的抗菌蛋白的作用會受到植物本身防衛(wèi)機制的影響，轉(zhuǎn)入的蛋白必須與植物內(nèi)源的抗病化合物相匹配才能起到抗病的作用。植物的抗病基因也被廣泛應(yīng)用于抗病育種，但植物所獲得的抗病性往往會由于病原菌小種的變異而喪失，而且抗病基因在親緣關(guān)系較遠的物種中常常不能很好的工作，這給抗病基因的應(yīng)用帶來了很大的限制(Maarten &Jerome，2001，Nature，411865-868)。
過敏反應(yīng)(hypersensitive response)是植物防衛(wèi)反應(yīng)系統(tǒng)中最強有力的武器。選擇能夠誘導(dǎo)植物過敏反應(yīng)的激發(fā)子基因，以病原菌誘導(dǎo)啟動子驅(qū)動并轉(zhuǎn)化植物，使該基因在病原菌侵入的情況下表達，啟動植物的過敏反應(yīng)，從而有望獲得廣譜性的抗病性。Harald keller等(Harald keller等，1999，The plant cell，11223-235)以煙草hsr203J基因的啟動子驅(qū)動來自大雄疫霉的激發(fā)子基因cryptogein轉(zhuǎn)化煙草，獲得了廣普的抗真菌煙草，而且轉(zhuǎn)入的激發(fā)子基因只在病原物侵染的情況下表達。而Maarten & Jerome的轉(zhuǎn)基因番茄能夠抑制病毒的侵染(Maarten & Jerome，2001，Nature，411865-868)。
棉花是我國重要的經(jīng)濟作物之一，黃萎病是棉花廣泛流行的一種病害。由于黃萎病的發(fā)生，給我國的棉花生產(chǎn)造成相當嚴重的經(jīng)濟損失。針對黃萎病所采取的防治措施中最有效的就是種植抗病品種。獲得抗性品種的途徑，一種是傳統(tǒng)的育種方法，但是育種時間長，耗資大，抗性品種的抗性易退化，而且受到抗性品種資源少的限制。另一種方法是通過抗病基因工程將相關(guān)基因?qū)朊藁w內(nèi)，使棉花獲得或增強抗病性，且不影響棉花本身的優(yōu)良品質(zhì)。克隆能夠在棉花上引起過敏反應(yīng)的激發(fā)子基因?qū)槊藁共』蚬こ烫峁┗蛸Y源。
迄今為止，本領(lǐng)域尚沒有報道過棉花黃萎病菌分泌型激發(fā)子基因，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)棉花黃萎病菌分泌型激發(fā)子基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種棉花黃萎病菌分泌型激發(fā)子基因。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種新穎的分離出的VdNEP多肽，該多肽源自大麗輪枝菌，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2中第1-233位，第19-233位(去除信號肽)，或第24-233位(去除信號肽和前5個aa)氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位所述的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有引起過敏性壞死斑功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述VdNEP多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中19-717位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-903位的序列；(c)具有SEQ ID NO1中73-717位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有VdNEP活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達VdNEP的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有VdNEP活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的VdNEP多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-903個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了檢測樣品中是否存在VdNEP的方法，它包括將樣品與VdNEP的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在VdNEP。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種改善植物抗病性的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有VdNEP多肽DNA編碼序列，所述的VdNEP多肽具有SEQ ID NO2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位的氨基酸序列；
(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使VdNEP多肽DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入VdNEP多肽DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了VdNEP基因核苷酸序列圖2顯示了VdNEP基因的蛋白質(zhì)序列圖3顯示了VdNEP蛋白與幾個不同物種的乙烯和壞死誘導(dǎo)蛋白的同源比較(BLASTP)結(jié)果。VdNEP蛋白與來自尖鐮孢霉(Fusarium oxysporum)、單子腐霉(Pythium monospermum)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)和大雄疫霉(Phytophthora sojae)的乙烯和壞死誘導(dǎo)蛋白氨基酸序列同源性分別為62％，38％，36％，33％。
圖4顯示了VdNEP表達蛋白在煙草(A)、擬南芥(B)和棉花(C)葉片上引起的過敏性壞死斑。
具體實施例方式
本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次從大麗輪枝菌獲得了一個編碼乙烯和壞死誘導(dǎo)蛋白的基因VdNEP。該基因共計702個核苷酸，原核表達獲得的蛋白能夠在煙草和擬南芥葉片上引起過敏性壞死斑，并伴隨有活性氧的爆發(fā)，是一種非特異性的激發(fā)子。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的研究表明VdNEP蛋白能夠誘導(dǎo)擬南芥病程相關(guān)(PR)基因的表達。VdNEP蛋白在很低的濃度下即可誘導(dǎo)棉花懸浮細胞合成棉酚(一種植物保衛(wèi)素)。隨著使用濃度的提高引起棉花懸浮細胞的過敏性死亡(有典型的DNA剪切現(xiàn)象)。將VdNEP蛋白注射入棉花子葉，在低濃度下同樣會出現(xiàn)過敏性壞死斑，而在高濃度條件下出現(xiàn)葉片失水萎蔫。用VdNEP蛋白處理成熟的棉花真葉葉片，則造成葉片的失水干枯。
在本發(fā)明中，術(shù)語“VdNEP”、“VdNEP多肽”或“激發(fā)子VdNEP”可互換使用，都指具有大麗輪枝菌激發(fā)子VdNEP氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的激發(fā)子VdNEP，還包括含有不含有信號肽的VdNEP。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的VdNEP或多肽”是指VdNEP多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化VdNEP。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括VdNEP的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然VdNEP相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“VdNEP多肽”指具有VdNEP活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與VdNEP相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或多個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括VdNEP的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與VdNEPDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗VdNEP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含VdNEP多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO3所示的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了VdNEP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有VdNEP多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供VdNEP或多肽的類似物。這些類似物與天然VdNEP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“VdNEP保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼VdNEP的多聚核苷酸。
本發(fā)明的VdNEP核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或VdNEP編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的VdNEP多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼VdNEP多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，VdNEP多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語“重組表達載體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含VdNEP編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對于轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得抗病性提高的植物。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的VdNEP或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進或?qū)筕dNEP功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組VdNEP篩選多肽庫可用于尋找有價值的能抑制或刺激VdNEP功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對VdNEPDNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。較佳地，指那些能與VdNEP基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制VdNEP的分子，也包括那些并不影響VdNEP功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的VdNEP基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的VdNEP基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達VdNEP或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用VdNEP基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與VdNEP基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用VdNEP或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測VdNEP水平的測試方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的。一種檢測檢測樣品中是否存在VdNEP的方法是利用VdNEP的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與VdNEP特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在VdNEP。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從大麗輪枝菌cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為903個堿基，其開放讀框位于19-717位，編碼全長為233個氨基酸的VdNEP(SEQ IDNO2)。
VdNEP為改善植物的抗病性提供了新的途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景?？捎帽景l(fā)明的VdNEP改善抗病性(尤其是抗黃萎病菌)的植物沒有特別限制，因為VdNEP是非特異性的激發(fā)子。代表性的植物包括(但并不限于)棉花、煙草、擬南芥等等。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1大麗輪枝菌cDNA文庫的構(gòu)建和噬菌體的釋放25℃，150rpm震蕩懸浮培養(yǎng)大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)2-3周，在其分泌蛋白的分泌達到高峰時，收取菌體為材料，提取總RNA，利用Stratagene公司的建庫試劑盒，用以下方法構(gòu)建了一個棉花黃萎病菌的cDNA文庫。
合成的第一、二鏈cDNA及分級分離后的樣品均取一定的量電泳，確保cDNA的質(zhì)量，尤其是分級分離后，含有500bp以下cDNA的組分均不采用，以免影響大片段cDNA的連接效率。cDNA與ZAP express載體(Stratagene公司)連接后，經(jīng)包裝蛋白包裝，得到約含1.0×106Pfu獨立克隆的原庫。
將XL1-Blue感受態(tài)細胞(Stratagene公司)用10mM MgSO4稀釋至OD600為1.0。SOLR細胞的制備類似于XL1-Blue細胞，最后長至OD600為0.5-1.0之間。在1.5ml離心管中加入200μl XL1-Blue細胞，5μl陽性噬菌體溶液，1μl ExAssit輔助噬菌體(＞1×106pfu/ml，Stratagene公司)，混勻，37℃溫育15min。將混合液轉(zhuǎn)至3ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)2-2.5小時。2,000g離心15min，吸出上清。70℃溫育15min，4,000g離心15min，吸出上清液。兩個1.5ml離心管中各加入200μl新鮮的XLOLR細胞(Stratagene公司)，并分別加入上述的上清液100、10μl，37℃溫育15min，各取10-50μl鋪LB(含100μg/ml Amp)平板，37℃培養(yǎng)過夜。獲得單克隆。
結(jié)果將文庫噬菌體釋放到XLOLR細胞中，獲得單克隆2000個。
實施例2測序和ESTs序列的分析挑取單克隆，96孔板震蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，抽樣電泳檢測質(zhì)粒質(zhì)量。以T3引物為測序引物，在Megabase自動測序儀上測序。將獲得的1300個DNA序列在Genebank中進行比較，根據(jù)比較結(jié)果，按照ESTs序列可能的功能進行分類(期望值大于e-3)。
結(jié)果在這1300個ESTs序列中，決定蛋白命運的序列有35個；與蛋白合成有關(guān)的序列12個；與細胞骨架有關(guān)的序列5個；轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白24個；信號傳導(dǎo)相關(guān)的序列71個；轉(zhuǎn)錄相關(guān)的序列10個；與自身防御和侵染寄主相關(guān)的序列52個；DNA代謝的序列5個；能量代謝有關(guān)的序列17個；在Genebank中未發(fā)現(xiàn)任何同源序列的229個，約占17.6％，同源性較低(期望值大于e-3)的序列646個，接近50％；與功能未知的蛋白同源的序列41個；以及其它功能的序列100多個。
與真菌防御和侵染寄主相關(guān)的52個ESTs序列中，部分序列編碼的蛋白與其它植物或動物病原菌中的毒性因子或侵染相關(guān)蛋白有較高的相似性，可能編碼大麗輪枝菌的激發(fā)子。
其中，06H05號序列編碼分泌出胞外的天冬氨酸蛋白酶，該蛋白酶在許多動物病原菌侵染寄主的過程中起著關(guān)鍵的作用，可能與病原菌的附著、定殖和侵入相關(guān)。03E05號序列編碼分泌出胞外的絲氨酸蛋白酶，09F07號序列編碼木質(zhì)素酶，都可能參與寄主細胞壁的降解。
令人感興趣的是，07G01號序列編碼一個約25KD的乙烯和壞死誘導(dǎo)蛋白，與分離自鐮刀菌的乙烯和壞死誘導(dǎo)蛋白氨基酸序列同源性為62％。有研究表明，分離自鐮刀菌的乙烯和壞死誘導(dǎo)蛋白能夠誘導(dǎo)煙草的抗病防衛(wèi)反應(yīng)，因而07G01很有可能也編碼一種激發(fā)子，該基因被命名為VdNEP。
對VdNEP的測序結(jié)果如SEQ ID NO1和圖1所示，共903bp，其中ORF位于第19-717位，編碼一個全長為233aa的蛋白(SEQ ID NO2和圖2)。其中信號肽位于第1-18位。
VdNEP蛋白與幾個不同物種的乙烯和壞死誘導(dǎo)蛋白的同源比較(BLASTP)結(jié)果如圖3所示。VdNEP蛋白與來自Fusarium oxysporum、Pythium monospermum、Pythium aphanidermatum和Phytophthora sojae的乙烯和壞死誘導(dǎo)蛋白氨基酸序列同源性分別為62％，38％，36％，33％。
實施例3VdNEP基因的原核表達和純化(a)表達載體的構(gòu)建VdNEP基因cDNA全長序列用正向引物VdNEPEcoRF 5′gaattccagcagccccccaaggtt 3′(SEQ ID NO3；含EcoR I酶切位點)和反向引物VdNEPNotR 5′gcggccgcttaaaacgcggcgcgcatg 3′(SEQ ID NO4；含NotI酶切位點)，以抽提的大麗輪枝菌mRNA為模板，經(jīng)Pfu聚合酶進行RT-PCR擴增后(去除了預(yù)測的信號肽序列)，酶切，連接導(dǎo)入pET32a(+)質(zhì)粒(Novagen公司)，熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒，測序驗證。
(b)誘導(dǎo)表達將步驟(a)獲得的質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21。挑選陽性克隆，在含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600＝0.4-0.6，加入IPTG(終濃度為1mM)，22℃，220rpm震蕩培養(yǎng)12小時。高速離心收集菌體。用裂解緩沖液重新懸浮菌體，經(jīng)超聲波破碎菌體以后，4℃高速離心，收集上清液。取上清液20uL，加入等量的2XSDS上樣緩沖液，沸水浴3-5分鐘后高速離心5分鐘。SDS-PAGE電泳，考馬斯亮蘭R250溶液染色，觀察蛋白誘導(dǎo)表達情況。
結(jié)果SDS-PAGE電泳檢測，獲得一個約42KD的融合表達蛋白(His-VdNEP融合蛋白)，與預(yù)測值相符。
蛋白純化按照Novagen公司的pET系統(tǒng)操縱手冊進行，采用pET HisTag Ni親和層析法。緩沖液的配制參見操作手冊。將收集的上清液緩慢通過Ni-NTA樹脂柱，使帶有his蛋白標簽的表達蛋白與樹脂結(jié)合，用大量清洗緩沖液非特異性結(jié)合的雜蛋白，最后用洗脫緩沖液將表達蛋白從樹脂柱上洗脫下來。收集洗脫下來的蛋白溶液，在大體積的磷酸鹽緩沖液中4℃透析過夜。
蛋白定量將獲得的蛋白溶液用考馬斯亮藍G-250溶液定量。同時純化pET32a(+)空質(zhì)粒表達的約20KD的his標簽蛋白作為對照。
結(jié)果獲得了純化的約42KD的融合表達蛋白(His-VdNEP融合蛋白)。
實施例4VdNEP表達蛋白在煙草和擬南芥上引起的反應(yīng)用無針頭的1mL注射器將0.02μg/μL的VdNEP表達蛋白溶液從葉片背面分別注射入煙草和擬南芥的葉片，同時注射his標簽蛋白作為對照。48小時后觀察煙草和擬南芥葉片上的反應(yīng)。
注射2小時以后用DAB(3，3′-Diaminobenzidine)溶液對擬南芥葉片進行染色，觀察活性氧的產(chǎn)生。切取葉片浸泡在1mg/mL的DAB(Sigma)(pH3.8)中，25℃光照8小時，取出葉片置于96％乙醇中煮沸10分鐘，然后在新鮮的乙醇中浸泡4小時，觀察有無紅褐色沉淀產(chǎn)生并拍照。
注射8小時以后用臺盼藍溶液對擬南芥葉片進行染色，觀察細胞的過敏性死亡。將葉片在含0.25mg/mL臺盼藍的乳酚溶液中煮沸2分鐘，置于2.5g/mL的水合氯醛溶液中脫色12小時，觀察并拍照。死亡的細胞被染成藍色。
RT-PCR分析取所需的材料用液氮磨成細粉，加1mLTRIzol試劑(Invitrogen)，混勻并室溫靜置5分鐘。再加入0.2mL氯仿混勻，室溫靜置3分鐘。4℃12000g離心10分鐘，上清移至新管加0.5mL異丙醇室溫放置10分鐘以沉淀RNA，12000g離心10分鐘。沉淀用70％乙醇稍洗，RNA溶于一定體積的DEPC處理的水中。
PolyA mRNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄采用Takara公司RNA PCR系統(tǒng)。取1μg總RNA，按照試劑盒說明書操作，室溫靜置10min后，42℃反應(yīng)30min，取出，沸水煮5min后，置于冰上，以使反轉(zhuǎn)錄酶失活。取1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作PCR。以肌動蛋白為內(nèi)標，校正用于RT-PCR反應(yīng)的模板量。以PR基因各自特異性的引物做PCR(PR1基因正向引物PR1F5′tcccgctcaaccgccaaaag3′(SEQ ID NO5)，反向引物PR1R5′acggaggcacaaccaagtcg3′(SEQ ID NO6)；ACS6基因正向引物ACS6F5′cataagtgttgcggaagtaa′(SEQ ID NO7)，反向引物ACS6R5′ggcaatggaacgaacc3′(SEQ ID NO8))，分析PR基因表達的變化。
結(jié)果48小時后0.02ug/uL的VdNEP表達蛋白在煙草和擬南芥葉片上引起了過敏性壞死斑(圖4A和圖4B)。注射2小時以后，用DAB溶液對擬南芥葉片進行染色，發(fā)現(xiàn)有活性氧的產(chǎn)生。注射8小時以后用臺盼藍溶液對擬南芥葉片進行染色，即發(fā)現(xiàn)有細胞的過敏性死亡。
RT-PCR分析表明，VdNEP表達蛋白在注射4小時以后即可誘導(dǎo)擬南芥PR蛋白(ACS6和PR1)的表達。
實施例5VdNEP表達蛋白在棉花上引起的反應(yīng)(a)對懸浮培養(yǎng)的棉花細胞的影響棉花細胞懸浮培養(yǎng)挑取生長旺盛、結(jié)構(gòu)疏松的愈傷組織塊，轉(zhuǎn)接到MB(MS大量元素、微量元素+B5有機物，并附加1mg/L 2，4-D，0.1mg/L IAA，0.1mg/L KT)液體培養(yǎng)基中，24℃，110rpm振蕩培養(yǎng)，每7天繼代培養(yǎng)一次，繼代3-5次后，用于激發(fā)子處理實驗。
伊文思藍染色將細胞在0.02％的伊文思藍染色液中染色20分鐘，用大量水沖洗細胞后，將細胞鋪在載玻片上，在顯微鏡下觀察并拍照，死亡的細胞被染成藍色。
DNA剪切用凋亡DNA抽提試劑盒(華舜公司)提取懸浮細胞DNA，在2％的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，觀察DNA剪切現(xiàn)象并拍照。
將VdNEP表達蛋白溶液加入棉花懸浮培養(yǎng)細胞至終濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.5和1μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)36小時以后，測定懸浮細胞中棉酚的含量，同時伊文思(Evans)藍染色觀察棉花懸浮培養(yǎng)細胞的死亡率。
結(jié)果在VdNEP蛋白濃度為0.01-0.1ug/mL時，懸浮細胞中的棉酚含量隨著VdNEP表達蛋白濃度的提高而增加，Evans藍染色表明棉花懸浮培養(yǎng)細胞的死亡率也在增加。在VdNEP表達蛋白濃度濃度達到0.5ug/mL時，懸浮細胞中的棉酚含量急劇下降，Evans藍染色表明棉花懸浮培養(yǎng)細胞幾乎全部死亡。DNA檢測表明，死亡的細胞有明顯的DNA剪切現(xiàn)象，是典型的過敏性死亡。
(b)對棉花葉子的影響(i)用無針頭的1mL注射器將不同濃度(0.02、0.2、和2ug/uL)的VdNEP表達蛋白溶液分別注射入棉花的子葉，28℃光照培養(yǎng)，定時觀察葉片癥狀。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低濃度下(0.02ug/uL)，48小時后葉片上會形成過敏性壞死斑(圖4C)，在高濃度下(2ug/uL)，12小時后葉片即脫水萎蔫。
(ii)將新剪下的棉花真葉葉片葉柄浸入0.7ug/uLVdNEP表達蛋白溶液，28℃光照培養(yǎng)，定時觀察葉片癥狀。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，48小時后，葉片失水干枯。
實施例6VdNEP基因的分子特征Southern blot分析提取大麗輪枝菌的基因組DNA，每樣品取20μg DNA分別用Pst I，Xba I，Xho I酶切。待DNA完全酶切后，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，切去多余的凝膠，0.25M HCl浸泡15min，水洗，加入變性液，于室溫輕搖變性45min，短暫水洗，加入中和液室溫中和30min。以20×SSC為轉(zhuǎn)移液，用毛細管吸印法轉(zhuǎn)膜12-16小時，將DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-XL膜上，用鉛筆標記上樣孔位置，6×SSC短暫漂洗，80℃烘烤固定2小時，備用。
探針標記將實施例3獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、割膠純化后，取25ng作為模板標記探針。探針的標記使用Prime-a-Gene Labeling System(Promega)，標記體系為50μL(摻入α-32P-dCTP)，37℃溫浴1小時。標記的探針以QIAquick NucleotideRemoval Kit純化。
預(yù)雜交和雜交將轉(zhuǎn)有總RNA硝酸纖維素膜，浸入10mL預(yù)雜交液中，在雜交爐中42℃預(yù)雜交2-4小時。將變性后的探針，全部加入上述預(yù)雜交液中，42℃雜交24小時。
洗膜與壓片雜交結(jié)束后，倒出雜交液。按照以下程序洗膜1)2×SSC，0.1％SDS室溫洗滌兩次，每次5min，2)0.2×SSC，0.1％SDS室溫洗滌兩次，每次5min，3)0.2×SSC，0.1％SDS，42℃洗滌兩次，每次15min，4)2×SSC，室溫短暫漂洗。
將膜置于紙巾上，以除去大部分液體。將膜用保鮮膜包裹，平整壓于X光片下，附加增感屏，-70℃曝光合適的時間，一般2-3天。按照常規(guī)方法沖洗X光片。
Northern blot分析從不同培養(yǎng)時間的大麗輪枝菌菌絲中提取RNA，定量。樣品中加入溴乙錠，以便在電泳結(jié)束后初步觀察同時調(diào)整RNA的上樣量。每泳道加樣量為15μg總RNA，電泳使用1.2％的瓊脂糖，1×MOPS電泳緩沖液，電場強度8V/cm，至染料遷移至凝膠的一半時結(jié)束。凝膠經(jīng)20×SSC平衡45min后，加筑轉(zhuǎn)移平臺，在20×SSC中，將RNA轉(zhuǎn)移到Hybond-XL膜上(24小時)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，用鉛筆在膜上標記出加樣孔的位置，并剪去膜的左上角作為標記。膜經(jīng)6×SSC溶液短暫漂洗后，夾在兩層濾紙之間，在80℃烘烤2小時后，密封保存或直接用于雜交。探針標記和雜交同Southern blot分析。
結(jié)果
對VdNEP基因的Southern分析表明，該基因在大麗輪枝菌中為單拷貝。而Northern分析表明，該基因在震蕩培養(yǎng)條件下的表達水平不高，在第7天左右時表達量略高。
實施例7VdNEP蛋白的結(jié)構(gòu)分析用常規(guī)的Megaprimer的方法，以VdNEP基因為模板，設(shè)計不同的引物進行PCR，獲得點突變序列。同時設(shè)計引物，以VdNEP基因為模板，獲得VdNEP基因各種不同的兩端缺失序列。酶切，連接導(dǎo)入pET32a(+)質(zhì)粒，熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒，測序驗證。
誘導(dǎo)表達突變蛋白，純化后注射煙草葉片。以能否在煙草葉片上造成過敏性壞死斑為標準判斷突變蛋白的激發(fā)子活性。
結(jié)果點突變分析表明，VdNEP蛋白的3個半胱氨酸殘基以及幾個保守的氨基酸殘基(SEQ ID NO2中第C56，C82，C218和122-128位GHRHDWE)對于蛋白的激發(fā)子活性是必須的。而兩端缺失的實驗結(jié)果表明，蛋白的完整性對其激發(fā)子的活性同樣重要。只有N端跟在信號肽后面的5個氨基酸殘基可以缺失，即SEQIDNO2中第24-233位的缺失型VdNEP仍具有激發(fā)子活性。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>棉花黃萎病菌分泌型激發(fā)子基因及其應(yīng)用<130>036260<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>903<212>DNA<213>大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)<220>
<221>CDS<222>(19)..(717)<223>
<400>1gccatctgca cctgctac atg ctt ccc tcc gca gtc ttc tcg gtc ttt gcc 51Met Leu Pro Ser Ala Val Phe Ser Val Phe Ala1 510ctc gtc ggc agc gcc ttg gct cag cag ccc ccc aag gtt aac cac gac 99Leu Val Gly Ser Ala Leu Ala Gln Gln Pro Pro Lys Val Asn His Asp15 20 25agt atc aac ccc gtc cgc gat act ctg ggg ccc aac ggc gac atg atc147Ser Ile Asn Pro Val Arg Asp Thr Leu Gly Pro Asn Gly Asp Met Ile30 35 40agg aag ttc cag cct ctg ctt cac att gcc cac ggt tgc cag cct tac195Arg Lys Phe Gln Pro Leu Leu His Ile Ala His Gly Cys Gln Pro Tyr45 50 55tcc gct gtc aac acc cgc ggt gag gtc aac gcc ggt ctc caa gac agc243Ser Ala Val Asn Thr Arg Gly Glu Val Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser60 65 70 75ggt acc acc gca ggc ggc tgc aag gaa acc agc aag ggc cag acc tac291Gly Thr Thr Ala Gly Gly Cys Lys Glu Thr Ser Lys Gly Gln Thr Tyr80 85 90gcc cgc tcc atg acc ctg aac ggc cag ttc ggc atc atg tac gcc tgg339Ala Arg Ser Met Thr Leu Asn Gly Gln Phe Gly Ile Met Tyr Ala Trp95 100 105tac tgg ccc aag gac cag ccc gcc gac ggc aac ctc gcc agc ggc cac387
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Arg Asp Thr Leu Gly Pro Asn Gly Asp Met Ile Arg Lys Phe Gln Pro35 40 45Leu Leu His Ile Ala His Gly Cys Gln Pro Tyr Ser Ala Val Asn Thr50 55 60Arg Gly Glu Val Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Gly Thr Thr Ala Gly65 70 75 80Gly Cys Lys Glu Thr Ser Lys Gly Gln Thr Tyr Ala Arg Ser Met Thr85 90 95Leu Asn Gly Gln Phe Gly Ile Met Tyr Ala Trp Tyr Trp Pro Lys Asp100 105 110Gln Pro Ala Asp Gly Asn Leu Ala Ser Gly His Arg His Asp Trp Glu115 120 125Asn Val Val Ile Trp Phe Asn Ser Asn Asn Ala Asn Gln Ala Gly Ile130 135 140Leu Arg Gly Ala Ala Ser Gly His Gly Asp Tyr Lys Lys Val Asn Asn145 150 155 160Pro Gln Arg Asn Asn Asn Asn Leu His Val Glu Tyr Phe Thr Ser Leu165 170 175Gly Lys Asn His Glu Leu Gln Phe Lys Thr Ser Pro Gly Arg Thr Tyr180 185 190Trp Ile Trp Asp Trp Asp Arg Met Asp Thr Thr Val Gln Gly Ala Leu195 200 205Asn Arg Ala Asp Phe Gly Ser Ala Asn Cys Pro Phe Asn Asn Asn Asn210 215 220Phe Glu Arg Asn Met Arg Ala Ala Phe225 230
<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>引物<400>3gaattccagc agccccccaa ggtt 24<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(27)<223>引物<400>4gcggccgctt aaaacgcggc gcgcatg27<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物<400>5tcccgctcaa ccgccaaaag20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)<223>引物<400>6acggaggcac aaccaagtcg20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物<400>7cataagtgtt gcggaagtaa20<210>8<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(16)<223>引物<400>8ggcaatggaa cgaacc1權(quán)利要求
1.一種分離的VdNEP多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位所述的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有引起過敏性壞死斑功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽具有SEQ ID NO2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位的氨基酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中19-717位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-903位的序列；(c)具有SEQ ID NO1中73-717位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種VdNEP多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在表達條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出VdNEP多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的VdNEP特異性結(jié)合的抗體。
10.一種改善植物抗病性的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有VdNEP多肽DNA編碼序列，所述的VdNEP多肽具有SEQ ID NO2中第1-233位，第19-233位，或第24-233位的氨基酸序列；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使VdNEP多肽DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入VdNEP多肽DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠在棉花及其它植物上引起抗病過敏反應(yīng)的大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)非特異性激發(fā)子的基因VdNEP及其應(yīng)用。VdNEP蛋白能夠誘導(dǎo)擬南芥病程相關(guān)(PR)基因的表達。低濃度VdNEP蛋白可誘導(dǎo)棉花懸浮細胞合成植保素棉酚，高濃度VdNEP引起棉花懸浮細胞的過敏性死亡。將該蛋白注射入棉花子葉，在低濃度下同樣會出現(xiàn)過敏性壞死斑，而在高濃度條件下出現(xiàn)葉片失水萎蔫。用該蛋白處理成熟的棉花真葉葉片，則造成葉片的失水干枯。VdNEP為改善植物的抗病性提供了新的途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/31GK1609120SQ20031010807
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月22日
發(fā)明者陳曉亞, 王建營, 姜衛(wèi)紅, 林芝萍 申請人:中國科學院上海生命科學研究院