專利名稱：通過導(dǎo)入干擾rna在體內(nèi)下調(diào)靶基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于通過例如，使用siRNA雙鏈體而體內(nèi)送遞核酸，從而導(dǎo)入RNA干擾，以便在受試者體內(nèi)下調(diào)靶基因表達(dá)的方法和組合物。所述方法可用于基于基因的藥物開發(fā)的靶發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證。本發(fā)明還提供了將siRNA治療劑用于治療受試者的疾病，例如治療癌癥，感染性疾病和/或炎性疾病的臨床應(yīng)用的方法和組合物。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNAi)是轉(zhuǎn)錄后過程，其中，雙鏈RNA能以序列特異性方式抑制基因表達(dá)。所述RNAi過程至少是用兩個(gè)步驟完成的在第一個(gè)步驟中，通過內(nèi)源核糖核酸酶將較長的dsRNA裂解成較短的，長度為21-或23個(gè)核苷酸的dsRNAs，它被稱為″小的干擾RNAs″或siRNAs。在第二個(gè)步驟中，所述較小的siRNAs介導(dǎo)靶mRNA分子的降解。這種RNAi作用可以通過將較長的雙鏈RNA(dsRNA)或較短的小的干擾RNA(siRNA)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的靶序列中實(shí)現(xiàn)。最近，證實(shí)了RNAi還可以通過將能產(chǎn)生互補(bǔ)于靶基因的dsRNA導(dǎo)入質(zhì)粒而實(shí)現(xiàn)。
RNAi方法業(yè)已成功地應(yīng)用于用果蠅(20，22，23，25)，秀麗新桿線蟲(14， 15，16)以及斑馬魚(20)行的基因功能確定實(shí)驗(yàn)中。在所述模型生物中，業(yè)已報(bào)道了化學(xué)合成的較短的siRNA或體外轉(zhuǎn)錄的較長的dsRNA都能有效地抑制靶基因表達(dá)。業(yè)已報(bào)道了能夠在非人哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞培養(yǎng)物中成功地獲得RNAi作用的方法(39-56)。不過，RNAi作用在成年動(dòng)物模型中是難以觀察到的(57)。這至少是由于兩種原因造成的首先，將長的雙鏈RNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過上調(diào)干擾素基因表達(dá)啟動(dòng)了抗病毒反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和死亡，以及；其次，dsRNA向所述細(xì)胞中的送遞效率太低，特別是在動(dòng)物疾病模型中的送遞效率太低。盡管RNAi在基因靶驗(yàn)證和核酸治療兩方面都具有潛在的用途，由于將RNAi分子送遞到動(dòng)物疾病模型中的效率較低，妨礙了該技術(shù)的發(fā)展。因此，顯而易見的是，非常需要體內(nèi)送遞RNAi分子的改進(jìn)方法。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的是提供用于抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)一個(gè)或多個(gè)特定基因表達(dá)的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種或多種特定基因的表達(dá)而治療哺乳動(dòng)物疾病的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，提供了用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)下調(diào)預(yù)先選定的內(nèi)源基因的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物組織施用包括雙鏈RNA分子的組合物，其中，所述RNA分子能特異性地減少或抑制所述內(nèi)源基因的表達(dá)。內(nèi)源基因的這種下調(diào)作用可用于治療哺乳動(dòng)物的疾病，所述疾病是通過所述基因的表達(dá)導(dǎo)致或加劇的。所述哺乳動(dòng)物可以是人。
還提供用于治療與預(yù)先選定的內(nèi)源基因的不希望的表達(dá)相關(guān)的哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物的組織施用核酸組合物，并且基本上同時(shí)對所述組織施加脈沖電場，其中，所述核酸組合物能夠減少所述內(nèi)源基因在所述組織中的表達(dá)。所述疾病可以是癌癥或癌前生長，并且，所述組織可以是，例如，乳腺組織，結(jié)腸組織，前列腺組織，肺組織或卵巢組織。
所述RNA分子可以是小的干擾RNA或長的雙鏈RNA。所述小的干擾RNA分子可以具有大約21-23bp的長度。所述長的雙鏈RNA可以具有大約100-800bp的長度。所述RNA可以具有大約100個(gè)堿基對或更小的長度。
所述組合物可以直接給所述哺乳動(dòng)物的組織施用，例如，通過直接注射到所述哺乳動(dòng)物的腫瘤或關(guān)節(jié)中。
所述組合物還可以包括聚合物載體，它能夠增強(qiáng)所述RNA分子向所述哺乳動(dòng)物組織中的送遞。所述聚合物載體可以包括能夠結(jié)合所述RNA分子的陽離子聚合物。所述陽離子聚合物可以是氨基酸共聚物，包括，例如，組氨酸和賴氨酸殘基。所述聚合物可以是支化聚合物。
所述組合物可以包括導(dǎo)向的合成載體，它能增強(qiáng)所述RNA分子向所述哺乳動(dòng)物組織中的送遞。所述合成載體可以包括陽離子聚合物，親水性聚合物，和導(dǎo)向配體。所述聚合物可以是聚乙烯亞胺，所述親水性聚合物可以是聚乙二醇，和/或所述導(dǎo)向配體可以是包括RGD序列的肽。
在上述任何方法中，可以在基本上與使用所述組合物的同時(shí)對所述組織施加脈沖電場?？梢曰旧贤瑫r(shí)對所述組織施加第二種電脈沖，以便增強(qiáng)送遞。
所述內(nèi)源基因可以是突變的內(nèi)源基因，并且，所述突變基因中的至少一個(gè)突變可以在該基因的編碼區(qū)或調(diào)控區(qū)。
所述組合物可以是載體組合物，其中，所述載體編碼可操作地與調(diào)控序列連接的RNA轉(zhuǎn)錄物，所述調(diào)控序列控制所述轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄。并且，其中，所述轉(zhuǎn)錄物可以在組織中形成雙鏈RNA分子，它能特異性地減少或抑制所述內(nèi)源基因的表達(dá)。所述載體可以是病毒載體或質(zhì)粒，粘?；蚴删w載體。所述調(diào)控序列可以包括啟動(dòng)子，例如，組織選擇性啟動(dòng)子，如皮膚選擇性啟動(dòng)子或腫瘤選擇性啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可選自下組CMV，RSV LTR，MPSV LTR，SV4 AFP，ALA，OC和角蛋白特異性啟動(dòng)子。
在上述任意一種方法中，所述內(nèi)源基因可選自下組致癌基因，生長因子基因，血管發(fā)生因子基因，蛋白酶基因，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶基因，蛋白酪氨酸激酶基因，蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶基因，蛋白酪氨酸磷酸酶基因，受體基因，基質(zhì)蛋白基因，細(xì)胞因子基因，生長激素基因，和轉(zhuǎn)錄因子基因。所述基因可選自下組VEGF，VEGF-R，VEGF-R2，VEGF121，VEGF165，VEGF189，和VEGF206。
在涉及施加電脈沖的方法中，所述脈沖可以包括至少50V的矩形波脈沖，可以通過大約10-大約20分鐘將它施加在所述組織上。所述脈沖可以是單極，雙極，或多極性的。所述脈沖可以包括120V的指數(shù)式衰減脈沖，它可以用大約10-大約20分鐘時(shí)間施加在所述組織上。在上述每一種方法中，所述脈沖可以通過選自下組的電極施加卡規(guī)電極(caliper electrode)，彎曲電極(meander electrode)，針電極，微型針陣列電極，微型膜片電極(micropatch electrode)，環(huán)形電極，以及它們的組合。
所述卡規(guī)電極可以具有大約1cm2的面積。所述卡規(guī)電極可以施加在厚度大約為1mm-大約6mm的皮膚皺褶上。
通過以下詳細(xì)說明可以了解本發(fā)明的其他目的，特征和優(yōu)點(diǎn)。不過，應(yīng)當(dāng)理解的是，所述詳細(xì)說明和具體實(shí)施例盡管指明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是它們僅僅是以說明的方式提供的，因?yàn)橥ㄟ^該詳細(xì)說明，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，屬于本發(fā)明構(gòu)思和范圍的各種改變和改進(jìn)是顯而易見的。
附圖簡述

圖1表示在動(dòng)物疾病模型上進(jìn)行的電穿孔介導(dǎo)的RNAi送遞。步驟I在宿主組織中局部送遞能表達(dá)雙鏈RNA的裸露的質(zhì)粒DNA，該步驟使用雙鏈RNA的鹽溶液(大型片段-700bp，或21-23nt的寡聚體)，以及這兩者；步驟II用合適的裝置和探針進(jìn)行脈沖電場處理；步驟III生物學(xué)讀數(shù)，用于檢測導(dǎo)向的蛋白的RNAi抑制效率和治療效力。
圖2表示在異種移植腫瘤模型中RNAi介導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)的抑制作用。在三種濃度下將熒光素酶表達(dá)載體(pCI-Luc)與特異性dsRNA(Luc-dsRNA)和非特異性dsRNA(LacZ-dsRNA)直接共同送遞到腫瘤內(nèi)。在0.5μg，熒光素酶表達(dá)受到了載體表達(dá)的特異性dsRNA的顯著抑制，但是沒有受到LacZ-dsRNA的抑制。當(dāng)特異性和非特異性dsRNAs的濃度都達(dá)到5μg的劑量時(shí)，所述抑制作用成為非特異性的。
圖3表示通過電穿孔介導(dǎo)的VEGF特異性RNAi送遞進(jìn)行的血管發(fā)生因子VEGF的下調(diào)導(dǎo)致了腫瘤生長的抑制。在用VEGF165對MCF7進(jìn)行永久性轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，它變成非常具有侵襲性的腫瘤細(xì)胞系。用10μg RNAi分子進(jìn)行兩次電穿孔，均延遲了腫瘤的生長。
圖4表示使用siRNA或dsRNA的不同的抑制動(dòng)力學(xué)。盡管使用了相同的電穿孔參數(shù)、相同的送遞途徑以及相同數(shù)量的每一種形式的RNAi，所述腫瘤生長的抑制作用是不同的。DsRNA表現(xiàn)出早期的強(qiáng)的作用和由siRNA介導(dǎo)的延遲的作用。與LacZRNAi相比，對VEGF特異的dsRNA和siRNA都明確表現(xiàn)出序列特異性抑制。
圖5表示腫瘤生長的VEGFR2特異性抑制作用。小鼠VEGFR2基因業(yè)已被認(rèn)為在腫瘤血管發(fā)生和與腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)通訊中發(fā)揮重要作用。用mVEGFR2特異性RNAi進(jìn)行兩次腫瘤內(nèi)送遞然后進(jìn)行電穿孔之后，與送遞表達(dá)Luc的質(zhì)粒和非特異性RNAi相比，腫瘤生長明顯延遲。
圖6表示在通過電穿孔增強(qiáng)將siRNA雙鏈體(熒光標(biāo)記過的)送遞到腫瘤內(nèi)時(shí)，它們均勻地分布在所述腫瘤中。這一結(jié)果表明，siRNA的送遞與質(zhì)粒不同，質(zhì)粒通常僅僅局限于腫瘤內(nèi)的小的區(qū)域內(nèi)。
圖7表示將LacZ-特異性siRNA送遞到由MCF-7/VEGF165細(xì)胞形成的腫瘤內(nèi)，所述細(xì)胞業(yè)已進(jìn)行過工程改造，以便能內(nèi)源表達(dá)LacZ。結(jié)果表明，在送遞LacZ-siRNA之后24小時(shí)，20μg的siRNA獲得了β-Gal表達(dá)的＞70％的減少。
圖8.表示用VEGF-siRNA和LacZ-siRNA處理過的腫瘤組織的免疫組織化學(xué)染色。H&E染色證實(shí)了VEGF-siRNA處理過的腫瘤與LacZ-siRNA處理過的腫瘤具有明顯不同的圖像(A-B)。在用VEGF-siRNA(D)處理腫瘤時(shí)，VEGF染色(C)消失。在VEGF-siRNA處理過的腫瘤中，凋亡活性顯著上調(diào)。
圖9表示在體外的mRNA水平上的VEGF-siRNA剔除VEGF表達(dá)(左側(cè)圖片)導(dǎo)致了MDA-MB-435乳腺腫瘤生長抑制。
圖10.將熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒和Luc-siRNA共同送遞到MDA-MB-435腫瘤中，證實(shí)了Luc-siRNA獲得了熒光素酶表達(dá)的顯著剔除。
圖11.在將VEGF-siRNA送遞到腫瘤模型中時(shí)，所述腫瘤組織中VEGF的mRNA水平被下調(diào)。
圖12.在對ICT1031或April基因表達(dá)進(jìn)行RNAi剔除時(shí)，抑制了腫瘤生長?；诩?xì)胞的分析沒有顯示凋亡活性的顯著改變。
圖13.在對ICT1027或GRB2基因表達(dá)進(jìn)行RNAi剔除時(shí)，抑制了腫瘤生長，并且顯著提高了細(xì)胞凋亡活性。
圖14.在對ICT1024或EGF-AP基因表達(dá)進(jìn)行RNAi剔除時(shí)，抑制了腫瘤生長，并且顯著提高了細(xì)胞凋亡活性。
圖15.在對ICT1030基因表達(dá)進(jìn)行RNAi剔除時(shí)，加速了腫瘤生長。
圖16.與GFP-siRNA處理的腫瘤相比，PolyTran(HK聚合物)載體介導(dǎo)的ICT1003-siRNA送遞，導(dǎo)致了腫瘤抑制。
圖17.通過被稱為口腔氣管送遞的方法將熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒和luc-siRNA共同送遞到小鼠呼吸道中，導(dǎo)致了在小鼠肺中的siRNA-介導(dǎo)的熒光素酶抑制。測定了來自不同樣品的熒光素酶活性，包括首先收獲肺組織，然后在發(fā)光計(jì)中測定。
圖18.通過電穿孔將熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒和luc-siRNA共同送遞到小鼠肌肉中，在小鼠腿肌肉中導(dǎo)致了siRNA-介導(dǎo)的熒光素酶抑制。
圖19.通過電穿孔將熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒和luc-siRNA共同送遞到小鼠關(guān)節(jié)中，在小鼠腿關(guān)節(jié)中導(dǎo)致了siRNA-介導(dǎo)的熒光素酶抑制。
圖20.通過IV注射進(jìn)行siRNA送遞的系統(tǒng)方法證實(shí)了腫瘤導(dǎo)向作用。腫瘤組織用兩個(gè)圓圈標(biāo)記。
圖21.通過IV系統(tǒng)送遞使用小鼠VEGF a.mVEGFR1和mVEGFR2特異性siRNA雙鏈體，顯著減少眼前部的新生血管面積。
圖22.使用與圖21相同的方法，在RNAi-處理過的組中紅色新生血管的減少明顯比對對照組的多。
詳細(xì)說明提供了在體內(nèi)進(jìn)行有效的RNAi送遞的方法。在一種實(shí)施方案中，通過使用脈沖電場(電穿孔)，局部和系統(tǒng)將RNAi送遞到受試者體內(nèi)，例如，送遞到人類或其他動(dòng)物體內(nèi)。所述方法可以使用(1)所有形式的RNAi，例如s iRNA，dsRNA和DNA-RNA雙鏈體；(2)所有形式的RNAi有效負(fù)荷，例如合成，體外轉(zhuǎn)錄的和載體表達(dá)的RNAi；和(3)可以進(jìn)行電穿孔的所有類型的組織和器官。在其他方法中，使用聚合物載體并且通過靜脈內(nèi)(IV)送遞送遞所述RNAi。
本發(fā)明還提供了用于送遞RNAi的介質(zhì)；)被選擇用于有效送遞的途徑，以及適用于體內(nèi)電穿孔的參數(shù)。業(yè)已將本發(fā)明的方法用于實(shí)現(xiàn)與相應(yīng)的RNAi共同送遞的報(bào)道基因的下調(diào)。同樣業(yè)已將所述方法成功地用于證實(shí)在送遞不同的有效負(fù)荷形式的相應(yīng)的RNAi之后的抗腫瘤效力，例如，通過下調(diào)血管發(fā)生因子，例如VEGF和VEGFR2的表達(dá)。
本發(fā)明業(yè)已鑒定了不同形式的RNAi的某些特性，例如，動(dòng)物疾病模型中的小的干擾RNA(21-23nt)和雙鏈RNA(大約700bp)。本發(fā)明提供了在體內(nèi)獲得RNAi作用的有效工具，并且擁有應(yīng)用于功能性基因組研究和核酸治療中的各種用途的巨大潛力。
業(yè)已迅速開發(fā)了RNA干擾(RNAi)在細(xì)胞培養(yǎng)物以及在諸如果蠅，秀麗新桿線蟲，和斑馬魚的模型生物中的用途。對RNAi的研究業(yè)已發(fā)現(xiàn)了長的dsRNA是通過Dicer，一種細(xì)胞核糖核酸酶III加工的，以便產(chǎn)生具有3′突出端的大約21nt的雙鏈體，它被稱為短的干擾RNA(siRNA)，它介導(dǎo)了序列特異性mRNA降解(5)。對RNAi機(jī)制的理解及其迅速的發(fā)展應(yīng)用，代表了在過去十年中在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大突破。使用siRNA雙鏈體干擾特定基因的表達(dá)，需要了解靶可接觸性，siRNA向靶細(xì)胞中的有效送遞，以及對于某些生物學(xué)用途來說，需要了解siRNA在細(xì)胞中的長期活性。
與siRNA作為功能性基因組工具的文獻(xiàn)快速增長的同時(shí)，出現(xiàn)了將siRNA分子用作新型治療劑的興趣。成功的治療用途，取決于局部和系統(tǒng)性送遞方法的成功開發(fā)。將siRNA用作治療劑的優(yōu)點(diǎn)是由于它的特異性(3，4)，穩(wěn)定性(18)以及作用機(jī)制(5，6)。
在癌癥中，腫瘤發(fā)生過程被認(rèn)為是致癌基因，血管發(fā)生因子，生長因子，以及突變型腫瘤阻遏物的異常的超量表達(dá)的結(jié)果，盡管其他蛋白的表達(dá)不足同樣發(fā)揮著重要作用。逐漸增加的證據(jù)支持了siRNA雙鏈體能夠在體外和體內(nèi)″剔除″致瘤基因的觀點(diǎn)，導(dǎo)致了顯著的抗腫瘤作用(6)。本發(fā)明人業(yè)已證實(shí)了在MCF-7細(xì)胞，MDA-MB-435細(xì)胞和1483細(xì)胞誘導(dǎo)的異種移植腫瘤模型中人類VEGF的顯著降低，獲得了腫瘤生長的40-80％的抑制作用。預(yù)計(jì)，VEGF-siRNA誘導(dǎo)的抗血管發(fā)生作用能夠改變腫瘤內(nèi)的微血管，并且導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的激活，并且另一方面，還能夠增強(qiáng)細(xì)胞毒性化療藥物的效力。不過，為了實(shí)現(xiàn)抗血管發(fā)生劑和化療藥物的抗腫瘤效力的顯著提高，需要一種高度有效的送遞方法，以便在局部腫瘤組織中積累較高濃度的藥物。
本發(fā)明人業(yè)已披露了驗(yàn)證藥物靶的方法，該方法能確定哪些靶控制腫瘤疾病，并因此判斷抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)(參見PCT/US02/31554)。該方法通過轉(zhuǎn)基因超量表達(dá)直接在動(dòng)物腫瘤模型中驗(yàn)證靶，并且消除缺乏疾病控制的靶。該方法減少了對蛋白生成，抗體，和/或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的需要，同時(shí)提供了靶實(shí)際控制所述疾病的明確的和確切的證據(jù)。另外，所述方法提供了有價(jià)值的信息，這些信息在使用僅僅依靠細(xì)胞培養(yǎng)物而缺少導(dǎo)致疾病病理學(xué)的多種細(xì)胞類型的復(fù)雜的相互作用的方法時(shí)可能會(huì)丟失。
本發(fā)明還披露了適合向動(dòng)物腫瘤模型中進(jìn)行高通量送遞的基因送遞技術(shù)。參見WO 01/47496，該專利的內(nèi)容被以整體形式收作本文參考。所述方法能夠進(jìn)行質(zhì)粒的定向腫瘤使用，并且與″金標(biāo)準(zhǔn)″核苷酸送遞試劑相比獲得了效率的顯著提高(例如，提高7倍)。因此，所述方法提供了候選靶蛋白在腫瘤中的強(qiáng)的腫瘤表達(dá)和活性。
該平臺(tái)是用于驗(yàn)證在腫瘤組織中表達(dá)不足的基因的有效工具。不過，用于驗(yàn)證在腫瘤組織中超量表達(dá)的基因的實(shí)現(xiàn)基因沉默的方法是高度優(yōu)選的。最近，業(yè)已證實(shí)雙鏈RNA能通過被稱為RNA干擾(RNAi)的現(xiàn)象誘導(dǎo)基因特異性沉默。盡管RNAi的機(jī)制尚不完全了解，早期結(jié)果表明，這種RNAi作用可以在包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種類型的細(xì)胞中在體外獲得。
導(dǎo)向于靶mRNA的雙鏈RNA導(dǎo)致了所述靶的降解，從而導(dǎo)致了相應(yīng)基因的沉默。通過涉及酶Dicer的RNase III樣活性將大的雙鏈RNA裂解成21-23個(gè)核苷酸的較小的片段。這些被稱為siRNA(小的干擾RNA)的較短的片段被認(rèn)為介導(dǎo)了mRNA的裂解。盡管最近業(yè)已用秀麗新桿線蟲和其他低等生物研究了通過RNAi機(jī)制進(jìn)行的基因下調(diào)，它在培養(yǎng)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的作用只是到最近才得到證實(shí)。最近使用螢火蟲熒光素酶基因報(bào)道系統(tǒng)(57)在小鼠中證實(shí)了RNAi作用。
為了開發(fā)用于體內(nèi)基因功能驗(yàn)證和用于治療人類疾病的核酸治療的潛在臨床用途的RNAi技術(shù)平臺(tái)，本發(fā)明人用攜帶腫瘤的小鼠模型進(jìn)行了若干種體內(nèi)研究。在這些實(shí)驗(yàn)中，將導(dǎo)向于腫瘤相關(guān)配體(人VEGF)或受體(小鼠VEGFR2)的siRNA或dsRNA通過腫瘤內(nèi)途徑送遞到攜帶異種移植的MCF-7衍生的腫瘤或人MDA-MB-435腫瘤的裸鼠體內(nèi)。我們第一次能夠證實(shí)RNAi能夠在體內(nèi)，在腫瘤細(xì)胞中有效地使靶基因沉默，并且，其結(jié)果是抑制了腫瘤生長。
通過結(jié)合下面的實(shí)施例能夠更好地理解進(jìn)行了上述一般性說明的本發(fā)明，這些實(shí)施例是以說明的形式提供的，而不是要限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1.通過共轉(zhuǎn)染的dsRNA介導(dǎo)的熒光素酶報(bào)道基因在異種移植腫瘤中的沉默為了研究干擾RNAs是否能在小鼠腫瘤模型中抑制基因表達(dá)，我們使用了直接腫瘤內(nèi)注射，隨后進(jìn)行電穿孔，以便將裸露的dsRNA和熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒DNA共同送遞到裸鼠體內(nèi)的異種移植的人MDA-MB-435腫瘤。簡單地講，對來自螢火蟲熒光素酶基因的700bp的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且在PCR反應(yīng)中將T7啟動(dòng)子序列添加到所述DNA片段的兩端。然后將所述DNA片段用作DNA模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。所述體外轉(zhuǎn)錄是用購自New England BioLab的dsRNA制備試劑盒，按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行的。將2μg的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pCILuc，與來自熒光素酶基因或LacZ基因的0.5，2，和5μg dsRNA在30μl最終體積的生理鹽水中混合。用精密注射器(Stepper，Tridake)將存在于該鹽溶液中的DNA/dsRNA混合物直接注射到Ncr Nu/Nu異種移植到小鼠體內(nèi)的人MDA-MB-435腫瘤中。
在注射之后，立即進(jìn)行脈沖電場程序(圖1)。將一薄層導(dǎo)電性凝膠(KY Jelly)覆蓋在腫瘤表面上，以便確保平板電極和腫瘤之間的良好接觸，使用電穿孔儀(BTX ECM830，San Diego)通過放置在腫瘤每一側(cè)的兩個(gè)外部平板電極送遞電脈沖。進(jìn)行電穿孔的參數(shù)如下電壓與電極距離的比例(電場強(qiáng)度)為200-V/cm；每一次脈沖的時(shí)間為20ms；兩次脈沖之間的間隔時(shí)間為1秒(1Hz)。脈沖次數(shù)為6。在DNA注射24小時(shí)之后，在處死所述動(dòng)物之后將所述腫瘤切除。在勻漿試管(LysingMatrix D，Q-BIOgene)中用800μl的1×裂解緩沖液(Promega)對每一個(gè)腫瘤進(jìn)行勻漿，在4℃下使用Fastprep(Q-BIOgene)以4擋的速度勻漿40秒。在冰上孵育30分鐘，然后以14,000rpm的速度對勻漿物進(jìn)行離心2分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，并且使用熒光素酶分析試劑盒(Promega)和發(fā)光計(jì)(Monolight 2010，AnalyticLuminescence Lab.)，將10μl樣品用于熒光素酶活性分析。
如圖2所示，共同送遞的來自熒光素酶基因的dsRNA能夠在異種移植的腫瘤中使熒光素酶表達(dá)沉默。少到0.5μg的dsRNA就足以獲得針對2μg的共同送遞的pCILuc質(zhì)粒DNA的顯著的基因沉默。在將來自LacZ基因的5μg dsRNA與2μg的pCILuc質(zhì)粒DNA共同送遞時(shí)，觀察到了非特異性dsRNA干擾作用。在較低劑量的dsRNA(0.5μg和2μg)下，沒有觀察到非特異性作用。只是在成年小鼠體內(nèi)的異種移植的腫瘤中首次觀察到dsRNA介導(dǎo)的特異性基因沉默。
實(shí)施例2RNAi介導(dǎo)的人VEGF基因沉默能在小鼠體內(nèi)抑制人MCF-7衍生的腫瘤生長進(jìn)行體內(nèi)研究，以便證實(shí)導(dǎo)入的siRNA不僅能使共同送遞的報(bào)道基因沉默，而且還能下調(diào)內(nèi)源基因，例如VEGF的表達(dá)。當(dāng)所述靶基因是腫瘤控制基因時(shí)，所述基因的下調(diào)導(dǎo)致了治療效力腫瘤生長的抑制。人類VEGF能誘導(dǎo)血管發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并且在調(diào)控血管發(fā)生方面發(fā)揮重要作用。存在若干種人VEGF的剪接變體，包括VEGF121，VEGF165，VEGF189，和VEGF206，它們各自包括特定的外顯子添加。VEGF165是最主要的蛋白，不過，VEGF121轉(zhuǎn)錄物的含量可能更豐富。VEGF165是肝素結(jié)合糖蛋白，它是作為45kDa的同二聚體分泌的。除了內(nèi)皮細(xì)胞本身之外，大多數(shù)類型的細(xì)胞能分泌VEGF。由于最初發(fā)現(xiàn)的VEGF，即VEGF165能提高血管通透性，它又被稱為血管通透性因子。另外，VEGF能導(dǎo)致血管擴(kuò)張，在某種程度上是通過內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合成酶的刺激造成的。VEGF還能刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)移并且抑制凋亡。
將兩種動(dòng)物模型用于比較研究。第一種腫瘤模型是用MCF-7乳腺腫瘤細(xì)胞系建立的，而第二種腫瘤模型是用來自腫瘤細(xì)胞系MCF-7/VEGF165的MCF-7建立的。在注射任何類型的RNAi之前，我們觀察到了與通過MCF-7本身誘導(dǎo)的腫瘤相比，MCF-7/VEGF165誘導(dǎo)的腫瘤會(huì)導(dǎo)致更具侵襲性的腫瘤生長。業(yè)已報(bào)道了這種現(xiàn)象，并且體現(xiàn)了MCF-7/VEGF165通過血管發(fā)生促進(jìn)活性作為腫瘤生長促進(jìn)劑的作用。為了實(shí)現(xiàn)VEGF特異性下調(diào)，將10μg來自hVEGF基因的siRNA(21nt)或來自LacZ基因的siRNA直接注射到異種移植到裸鼠體內(nèi)的過量表達(dá)人VEGF165的MCF-7、VEGF165腫瘤中。設(shè)計(jì)了兩種siRNA(21nt)序列，以便導(dǎo)向人VEGF165基因。VEGFRNAi序列是5′-ucgagacccugguggacauuu-3′，VEGFRNAiB序列是5′-ggccagcacauaggagagauu-3′。兩種siRNAs都是雙鏈的，在兩端具有兩個(gè)UU突出端。為了進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射，用兩種siRNAs各5μg組成10μg的VEGF特異性siRNAs。另外，同樣通過相同的送遞方法導(dǎo)入相同數(shù)量的dsRNA(10μg)導(dǎo)向VEGF165基因。按上述方法，在siRNA注射之后，立即對腫瘤施加電脈沖。在第一次施用RNAi之后第7天第二次施用siRNA。測定腫瘤體積，作為hVEGF基因沉默的指標(biāo)。
如圖3所示，用非特異性LacZ siRNA處理的MCF-7/VEGF165誘導(dǎo)的腫瘤生長比MCF-7誘導(dǎo)的腫瘤快得多。施用VEGF特異性siRNA和dsRNA明確證實(shí)了腫瘤生長抑制作用。在第9天和第16天兩次施用RNAi，獲得了腫瘤生長的體內(nèi)抑制作用。有趣的是，用VEGF特異性siRNA和dsRNA處理，得到了不同的抑制形式。用VEGF siRNAs處理，表現(xiàn)出延遲作用，它在23天之后表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。另一方面，用VEGF dsRNA處理出現(xiàn)了更早的抑制作用，甚至是在第一次施用之后出現(xiàn)(圖4)。以上結(jié)果證實(shí)了hVEGF siRNAs和hVEGF dsRNA在處理過的腫瘤中能使hVEGF基因特異性地沉默，因此，通過抗血管發(fā)生機(jī)制延緩了腫瘤生長。
實(shí)施例3RNAi介導(dǎo)的小鼠VEGFR2基因沉默，在小鼠中能抑制人MDA-MB-435腫瘤生長為了說明RNAi介導(dǎo)的基因沉默在通過導(dǎo)向內(nèi)源腫瘤控制基因影響腫瘤生長方面的效力，進(jìn)行了一項(xiàng)體內(nèi)研究，以便使攜帶MCF-7衍生腫瘤的裸鼠中使小鼠VEGFR2基因沉默。設(shè)計(jì)了兩種siRNAi，以便導(dǎo)向小鼠VEGFR2基因。VEGFR2RNAi序列是5′-gcucagcacacagaaagacuu-3′，VGFR2RNAiB序列是5′-ugcggcgguggugacaguauu-3′。兩種siRNAs都是雙鏈的，在兩端具有兩個(gè)UU突出端。由每一種siRNA各5μg構(gòu)成了10μg用于送遞。將10μg來自VEGFR2或LacZ基因的siRNAi或10μg的pCILuc質(zhì)粒DNA直接注射到裸鼠體內(nèi)的異種移植的人MCF-7衍生的腫瘤中。按上述方法，在siRNAs/DNA注射之后立即對腫瘤施加電脈沖。第二次施用siRNAs/DNA是在第一次施用之后第7天進(jìn)行的。測定腫瘤體積，作為mVEGFR2基因沉默的指標(biāo)。如圖5所示，與用pCILuc質(zhì)粒DNA或來自LacZ基因的siRNAs處理的腫瘤相比，用來自mVEGFR2的基因的siRNAs處理過的腫瘤明顯生長更快。LacZ siRNAs處理不能抑制腫瘤生長，因此，證實(shí)了mVEGFR2 siRNAs能特異性地使處理過的腫瘤中的mVEGFR2基因沉默，因此能降低腫瘤生長速度。
為了進(jìn)一步說明RNAi介導(dǎo)的基因沉默在通過導(dǎo)向腫瘤控制基因影響腫瘤生長方面的效力，進(jìn)行了另一種體內(nèi)研究，以便在攜帶人MDA-MB-435腫瘤的裸鼠體內(nèi)使小鼠VEGFR2基因沉默。除了上述來自mVEGFR2的siRNAs之外，將10μg來自小鼠VEGFR2基因的dsRNA(長度為700nt)或來自LacZ基因的siRNAs直接注射到裸鼠體內(nèi)的人MDA-MB-435異種移植的腫瘤中。按上述方法，在dsRNA/siRNAs注射之后立即對腫瘤施加電脈沖。在第一次施用之后第3天，第二次施用dsRNA/siRNAi。將10μg特異性導(dǎo)向于小鼠VEGFR2的DNA酶用作下調(diào)mVEGFR2基因的陽性對照。測定腫瘤體積，作為mVEGFR2基因沉默的指標(biāo)。
如圖6所示，與用來自LacZ基因的siRNAs處理的腫瘤相比，用來自mVEGFR2基因的dsRNA處理的腫瘤生長的明顯更慢。另外，與用mVEGFR2 DNA酶處理的腫瘤相比，用來自mVEGFR2基因的dsRNA處理的腫瘤生長得明顯更慢。另一方面，用來自mVEGFR2的siRNAs處理的腫瘤與用mVEGFR2 DNA酶處理的腫瘤生長速度相當(dāng)，不過，與用來自LacZ基因的siRNAs處理的腫瘤相比，生長速度仍然明顯更慢(圖6)。由于所述LacZ siRNAs處理不能抑制腫瘤生長，我們的結(jié)論是，mVEGFR2dsRNA和mVEGFR2 siRNAs在處理過的MDA-MB-435腫瘤中能特異性使mVEGFR2基因沉默，并因此降低腫瘤生長速度。現(xiàn)在進(jìn)行了更多的生物化學(xué)分析，以便證實(shí)腫瘤組織中的mVEGFR2基因確實(shí)被來自mVEGFR2基因的dsRNA特異性沉默。
實(shí)施例4PolyTran-介導(dǎo)的RNAi送遞能在小鼠體內(nèi)抑制人MDA-MB-435腫瘤生長可以通過聚合物介導(dǎo)成功地送遞針對靶的RNAi，如圖16中的結(jié)果所示。使用PolyTran試劑(組氨酸-賴氨酸共聚物)將針對靶ICT1003的RNAi送遞到腫瘤細(xì)胞中。簡單地講，使用在WO 01/47496(該文獻(xiàn)的整個(gè)內(nèi)容被收作本文參考)披露的方法和試劑將RNAi送遞到上述腫瘤模型中。將GFP-siRNA用作對照。如圖16所示，與對照相比，針對ICT1003的RNAi能抑制腫瘤生長。圖16中所示出的結(jié)果是使用具有結(jié)構(gòu)[(HK)4KGK(HK)4]4K3的支化試劑HK4 b(參見WO 01/47496)獲得的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可以使用其他陽離子共聚物，并且還可以使用本領(lǐng)域所公知的其他陽離子聚合物。
實(shí)施例5使用導(dǎo)向的合成載體系統(tǒng)送遞RNAi可以將在被以它的整體形式-收作本文參考的WO 01/49324中所披露類型的導(dǎo)向的合成載體用于系統(tǒng)性送遞RNAi。簡單地講，制備PEI-PEG-RGD(聚乙烯亞胺-聚乙二醇-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)合成載體，例如，參見WO 01/49324的實(shí)施例53和56。將該載體用于通過靜脈內(nèi)注射系統(tǒng)性送遞RNAi。結(jié)果如圖20-22所示，圖中示出了，使用這種導(dǎo)向的合成載體方法能夠成功地送遞抗VEGF RNAi分子。技術(shù)人員可以理解的是，可以使用本領(lǐng)域所公知的其他導(dǎo)向的合成載體分子。例如，所述載體可以具有由核心復(fù)合物組成的內(nèi)殼，該復(fù)合物包括所述RNAi和至少一種成復(fù)合物試劑。所述載體還可以包括致融合部分，該部分可以包括錨定在所述核心復(fù)合物上的殼，或者可以直接摻入所述核心復(fù)合物中。所述載體還可以具有外殼部分，它能穩(wěn)定所述載體，并且減少與蛋白和細(xì)胞的非特異性結(jié)合。所述外殼部分可以包括親水性聚合物，和/或可以錨定在所述致融合部分上。所述外殼部分可以錨定在所述核心復(fù)合物上。所述載體可以包括導(dǎo)向部分，它能增強(qiáng)所述載體與靶組織和細(xì)胞群體的結(jié)合。合適的導(dǎo)向部分為本領(lǐng)域所公知，并且詳細(xì)披露于WO 01/49324中。
RNAi送遞的其他方法對于某些用途來說，RNAi可以作為“裸露的”試劑直接使用，采用或不采用電穿孔方法。例如，可將其用于送遞RNAi分子和編碼RNAi分子的載體，例如，通過直接注射使它進(jìn)入腫瘤組織，并且直接注射到關(guān)節(jié)中。所述RNAi可存在于合適的載體中，例如，鹽溶液或緩沖的鹽溶液。
靶驗(yàn)證藥物靶驗(yàn)證的最終目標(biāo)是證實(shí)候選靶確實(shí)能控制有關(guān)疾病?？刂萍膊〉陌惺桥袛嗨幬锇l(fā)現(xiàn)的高價(jià)值靶。藥物開發(fā)的目標(biāo)是能選擇性地導(dǎo)向于關(guān)鍵途徑的產(chǎn)物，以及所述途徑的關(guān)鍵控制因子，以便提供對有關(guān)疾病的有效的治療控制。所述關(guān)鍵途徑和因子的驗(yàn)證需要證實(shí)控制所述疾病的各個(gè)候選靶的添加或扣除，即導(dǎo)致病理學(xué)的明顯的加重或減輕。體外基于細(xì)胞的方法業(yè)已提供了有助于鑒定和選擇潛在靶的有用信息。不過，靶控制與疾病相關(guān)的體外細(xì)胞模型的能力通常不足以證實(shí)實(shí)際控制所述疾病過程的靶，即多種細(xì)胞類型的復(fù)雜的相互作用導(dǎo)致了疾病病理學(xué)。通過靶決定性地證實(shí)疾病控制，只能夠通過在真實(shí)的疾病模型中研究所述靶而獲得。
通過基因組方法業(yè)已大大加速了靶發(fā)現(xiàn)過程，不過驗(yàn)證仍然是瓶頸。第一代基因組方法業(yè)已產(chǎn)生了在所述驗(yàn)證步驟中積累的大量的候選靶。有多種方法被用于研究所述基因靶的功能，并且用于驗(yàn)證它們在疾病過程中的作用。上述很多方法盡管具有高效和高通量的優(yōu)點(diǎn)，但通常只能在確定與疾病過程的相關(guān)性或關(guān)系方面獲得成功，而不是確定控制作用。業(yè)已證實(shí)了較新的基因剔除和正向或反向基因組方法是有用的，但是，這些方法鑒定了其抑制或突變可能具有基本作用的基因，缺少來自基因超量表達(dá)的具有潛在價(jià)值的信息。另外，它們還利用了最初的體外的基于細(xì)胞的表型，它不能體現(xiàn)大部分疾病的復(fù)雜的多細(xì)胞機(jī)制，如腫瘤血管發(fā)生，因此，存在缺少相鄰的細(xì)胞途徑中的重要靶或提供沒有完整的生物學(xué)聯(lián)系的不完全的疾病關(guān)系的危險(xiǎn)。
快速確切地靶驗(yàn)證可以將本發(fā)明的方法用于驗(yàn)證癌相關(guān)的藥物靶。所述方法可以通過在腫瘤組織中使內(nèi)源基因沉默直接在動(dòng)物腫瘤模型中驗(yàn)證靶，并且可以與涉及基因超量表達(dá)的方法先后使用。參見PCT/US 02/31554。所述方法減少了對確切驗(yàn)證的高成本的和緩慢的步驟的需要，如基因克隆和測序，蛋白和抗體或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備。這兩種方法的組合大大加快了所述過程，并且，最重要的是，迅速消除了較弱的靶。另外，通過所述方法獲得的結(jié)果提供了清楚并且確切的證據(jù)，即靶確實(shí)控制有關(guān)疾病，這是進(jìn)行藥物發(fā)現(xiàn)的有價(jià)值的步驟所需要的關(guān)鍵驗(yàn)證?？梢詫⑺龇椒ㄓ糜谕瓿扇魏魏蜻x靶的驗(yàn)證，如用細(xì)胞培養(yǎng)物，模型生物，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等制備的靶。
靶發(fā)現(xiàn)捕捉在初步驗(yàn)證中缺少的靶不幸的是，另一個(gè)因素是，在采用體外或疾病相關(guān)的方法時(shí)，作為靶發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的初次“過濾”，很多很有價(jià)值的疾病控制靶可能會(huì)丟失。很多疾病控制靶可能只能在完整的疾病模型環(huán)境中出現(xiàn)。例如，控制腫瘤血管發(fā)生的靶只能在腫瘤和血管的結(jié)合部分出現(xiàn)。對于腫瘤來說，某些有價(jià)值的靶可能只能通過研究包括腫瘤和周圍組織的組合的體內(nèi)生物學(xué)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)。
高處理量靶發(fā)現(xiàn)方案我們業(yè)已提出了挑戰(zhàn)發(fā)現(xiàn)疾病控制靶的方案。該方案是通過用于以高通量操作而篩選大量的基因靶以放大所述基礎(chǔ)方法。通過在動(dòng)物腫瘤模型中放大加工多種候選基因的方法，這種方法能夠提供跳過很多場合下的初步功能性驗(yàn)證方法的機(jī)會(huì)。
腫瘤靶消除本發(fā)明方法本身或者與PCT/US 02/31554中所披露的方法組合，可以迅速測試候選靶對腫瘤生長的控制能力。由于優(yōu)選對腫瘤生長具有強(qiáng)的作用的候選物，可以將對腫瘤生長只具有弱的或微不足道的控制的候選物取消。所述腫瘤靶區(qū)別方法能快速將靶分成三種類型能促進(jìn)腫瘤生長的靶，對腫瘤生長少有作用的靶，以及能抑制腫瘤生長的靶。
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權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)下調(diào)預(yù)先選定的內(nèi)源基因的方法，包括給所述動(dòng)物的組織施用包括雙鏈RNA分子的組合物，其中，所述RNA分子能特異性地減少或抑制所述內(nèi)源基因的表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述RNA分子是小的干擾RNA。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述RNA分子是長度大約為21-23bp的小的干擾RNA分子或長的雙鏈RNA。
4.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述RNA分子是長度大約為100-800bp的長的雙鏈RNA。
5.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述組合物是直接給所述哺乳動(dòng)物的組織施用的。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中，施用是通過注射到所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤中或注射到所述哺乳動(dòng)物的關(guān)節(jié)中進(jìn)行的。
7.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述組合物還包括能增強(qiáng)所述RNA分子向所述哺乳動(dòng)物的組織中送遞的聚合物載體。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中，所述聚合物載體包括能結(jié)合所述RNA分子的陽離子聚合物。
9.如權(quán)利要求8的方法，其中，所述陽離子聚合物是氨基酸共聚物。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述聚合物包括組氨酸和賴氨酸殘基。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中，所述聚合物是支化聚合物。
12.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述組合物包括導(dǎo)向的合成載體，它能增強(qiáng)所述RNA分子向所述哺乳動(dòng)物組織中的送遞。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述載體包括陽離子聚合物，親水性聚合物，和導(dǎo)向配體。
14.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述陽離子聚合物是聚乙烯亞胺。
15.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述親水性聚合物是聚乙二醇。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述導(dǎo)向配體是包括RGD序列的肽。
17.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，基本上在施用所述組合物的同時(shí)，對所述組織施加脈沖電場。
18.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述內(nèi)源基因是突變的內(nèi)源基因。
19.如權(quán)利要求18的方法，其中，所述突變基因上的至少一個(gè)突變在所述基因的編碼區(qū)或調(diào)控區(qū)上。
20.如權(quán)利要求17的方法，還包括基本上同時(shí)對所述組織施加第二個(gè)電脈沖。
21.一種用于在哺乳動(dòng)物中下調(diào)預(yù)先選定的內(nèi)源基因的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物的組織施用載體組合物，其中，所述載體編碼可操作地與調(diào)控序列偶聯(lián)的RNA轉(zhuǎn)錄物，該調(diào)控序列調(diào)控所述轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄，并且，其中，所述轉(zhuǎn)錄物能夠在所述組織中形成雙鏈RNA分子，它能特異性地減少或抑制所述內(nèi)源基因的表達(dá)。
22.如權(quán)利要求21的方法，其中，所述載體是病毒載體或質(zhì)粒，粘?；蚴删w載體。
23.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述內(nèi)源基因選自致癌基因，生長因子基因，血管發(fā)生因子基因，蛋白酶基因，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶基因，蛋白酪氨酸激酶基因，蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶基因，蛋白酪氨酸磷酸酶基因，受體基因，基質(zhì)蛋白基因，細(xì)胞因子基因，生長激素基因，和轉(zhuǎn)錄因子基因。
24.如權(quán)利要求21的方法，其中，所述調(diào)控序列包括啟動(dòng)子。
25.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述啟動(dòng)子是組織選擇性啟動(dòng)子。
26.如權(quán)利要求25的方法，其中，所述組織選擇性啟動(dòng)子是皮膚選擇性啟動(dòng)子或腫瘤選擇性啟動(dòng)子。
27.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述啟動(dòng)子選自CMV，RSV LTR，MPSV LTR，SV40，AFP，ALA，OC和角蛋白特異性啟動(dòng)子。
28.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述電脈沖包括至少50V的矩形波脈沖，它是用大約10-大約20分鐘時(shí)間施加到所述組織上的。
29.如權(quán)利要求28的方法，其中，所述電脈沖是單極，雙極或多極性的。
30.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述電脈沖包括120V的指數(shù)式衰減脈沖，它是用大約10-大約20分鐘時(shí)間施加在所述組織上的。
31.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述電脈沖是通過選自下組的電極施加的卡規(guī)電極，彎曲電極，針電極，微型針陣列電極，微型膜片電極，環(huán)形電極，以及它們的組合。
32.如權(quán)利要求31的方法，其中，所述電極是具有大約1cm2的面積的卡規(guī)電極。
33.如權(quán)利要求32的方法，其中，所述卡規(guī)電極被應(yīng)用在厚度為大約1mm-大約6mm的皮膚皺褶上。
34.一種用于治療與不希望的預(yù)先選定的內(nèi)源基因表達(dá)相關(guān)的哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物的組織施用核酸組合物，并且基本上同時(shí)對所述組織施加脈沖電場，其中，所述核酸組合物能夠減少所述內(nèi)源基因在所述組織中的表達(dá)。
35.如權(quán)利要求34的方法，其中，所述疾病是癌癥或癌前生長。
36.如權(quán)利要求34的方法，其中，所述組織是乳腺組織，結(jié)腸組織，前列腺組織，肺組織或卵巢組織。
37.如權(quán)利要求34的方法，其中，所述核酸組合物包括小的干擾RNA，長的雙鏈RNA，或編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的多核苷酸分子，它能形成基本上為雙鏈的RNA分子。
38.如權(quán)利要求37的方法，其中，所述RNA分子是長度大約為21-23bp的小的干擾RNA分子。
39.如權(quán)利要求37的方法，其中，所述RNA分子是長度大約為100-800bp的長的雙鏈RNA。
40.如權(quán)利要求39的方法，其中，所述RNA的長度為大約100個(gè)堿基對或更少。
41.如權(quán)利要求34的方法，其中，所述核酸組合物是能夠編碼siRNA或RNAi的載體，并且，其中，所述載體是質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，或病毒載體。
42.如權(quán)利要求41的方法，其中，所述載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體。
43.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是人。
44.如權(quán)利要求34的方法，其中，所述預(yù)先選定的內(nèi)源基因選自致癌基因，生長因子基因，血管發(fā)生因子基因，蛋白酶基因，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶基因，蛋白酪氨酸激酶基因，蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶基因，蛋白酪氨酸磷酸酶基因，受體基因，基質(zhì)蛋白基因，細(xì)胞因子基因，生長激素基因，和轉(zhuǎn)錄因子基因。
45.如權(quán)利要求34的方法，其中，所述基因選自VEGF，VEGF-R，VEGF-R2，VEGF121，VEGF165，VEGF189，和VEGF206。
全文摘要
提供了通過RNA干擾在體內(nèi)下調(diào)靶基因表達(dá)的方法和組合物。該方法可用于基于基因的藥物開發(fā)的靶發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，并且用于人類疾病的治療。
文檔編號C12P19/00GK1720257SQ03823860
公開日2006年1月11日 申請日期2003年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月6日
發(fā)明者P·V·斯卡里亞, M·C·沃德爾, P·Y·盧, Q·唐, J·徐, F·Y·謝 申請人:因特拉迪格姆公司