專利名稱：用電信號(hào)檢測(cè)pcr產(chǎn)物的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種利用電信號(hào)檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物的方法。
相關(guān)技術(shù)描述代表性的生物傳感器包括酶?jìng)鞲衅饕约袄妹庖唧w系免疫應(yīng)答的免疫傳感器。但是，由于人類基因組計(jì)劃的完成得到了大量DNA信息，因此，人類遺傳疾病早發(fā)現(xiàn)和治療的可能性和期望隨之增加，DNA芯片快速出現(xiàn)成為另一種類型的生物傳感器。目前，開發(fā)生物傳感器中活躍的研究領(lǐng)域是探詢獲得低制造成本、快速、準(zhǔn)確、易操作特性、以及小型化(便攜性)的可能性。從這個(gè)角度上講，用DNA信息進(jìn)行人類疾病早期檢測(cè)的DNA傳感器也必須符合上述要求以增加國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
一種基本的遺傳檢測(cè)為PCR DNA檢測(cè)，自從其在1980年代后期發(fā)明以來已經(jīng)在臨床、生物以及遺傳實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用。
傳統(tǒng)的PCR通過在PCR反應(yīng)的終點(diǎn)對(duì)進(jìn)行凝膠電泳顯示出擴(kuò)增的DNA的定性結(jié)果，但有很多問題例如DNA定量檢測(cè)的不準(zhǔn)確。因此，實(shí)時(shí)PCR開發(fā)用來通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度定量檢測(cè)擴(kuò)增的DNA，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增的DNA濃度成比例，利用光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。
DNA的定量檢測(cè)對(duì)疾病治療和DNA表達(dá)的研究而言是必須的。例如，為了保證感染乙型肝炎病毒(HBV)的病人得到成功的醫(yī)學(xué)治療，必須定期利用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)血漿中HBV的濃度以測(cè)試HBV的藥物抗性。
常規(guī)的實(shí)時(shí)PCR需要多種光學(xué)裝置例如激光源、微型反射鏡、顯微鏡和濾鏡，以及昂貴的熒光染料。并且，因?yàn)槌Ｒ?guī)的實(shí)時(shí)PCR芯片基于熒光檢測(cè)的原理，從微型化(芯片上)和經(jīng)濟(jì)效率的角度講，存在許多缺點(diǎn)。
為了解決該問題，有人嘗試用毛細(xì)管電泳(CE)利用電學(xué)方法檢測(cè)DNA的努力[Christa L.Colyer等，Journal of Chromatography A，Volume 781，Issues 1-2，26 September 1997，pp.271-276；F.Laugere等，Sensors andActuators BChemical，Volume 83，Issues 1-3，15March 2002，pp.104-108；Pumera et al.，Anal.Chem.，2002，74(9)，pp.1968-1971)。該方法可以進(jìn)行定性分析，但進(jìn)行定量分析時(shí)存在很多問題。并且，在PCR完成后，用微型通道將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到CE檢測(cè)系統(tǒng)是一個(gè)費(fèi)力的過程，而且需要高電壓。因此，不滿足經(jīng)濟(jì)效率和微型化的要求。
Miles等提交了一項(xiàng)美國(guó)專利申請(qǐng)，其以申請(qǐng)?zhí)?002/007254A1進(jìn)行了公開，該發(fā)明申請(qǐng)的思想是在PCR過程中，隨著DNA的濃度增加，阻抗下降而傳導(dǎo)性增加。但是，Miles的關(guān)于阻抗在PCR過程中隨著DNA的濃度增加而下降的思想與本發(fā)明者證實(shí)的事實(shí)剛好相反。因此，本專利申請(qǐng)來自對(duì)PCR反應(yīng)的機(jī)理的不同理解。
在PCR過程中，dNTPs解離成dNMPs以及許多二磷酸鹽。同時(shí)，利用與模板DNA互補(bǔ)的引物dNMPs聚合成DNA。在這種情況下，Miles等的公開只考慮了副產(chǎn)物二磷酸鹽的電遷移率。但是，考慮到隨著DNA濃度的增加，由在DNA合成過程中所有帶電的dNMPs、引物和模板導(dǎo)致整體電遷移率下降，由于電遷移率的下降從而PCR反應(yīng)的阻抗升高。此外，Miles的發(fā)明涉及進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)的PCR芯片而不是實(shí)時(shí)PCR芯片。并且，也存在必須用離子化的標(biāo)記探針以檢測(cè)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的問題。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種通過測(cè)量PCR溶液中的電信號(hào)檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)PCR產(chǎn)物的方法，包括(a)在含PCR溶液的容器中，裝配至少一對(duì)電極；(b)進(jìn)行PCR；(c)在電極間產(chǎn)生電場(chǎng)；并且(d)檢測(cè)PCR溶液中的電介質(zhì)特性變化。
附圖簡(jiǎn)介本發(fā)明的上述及其他特征以及優(yōu)點(diǎn)，通過對(duì)代表性的技術(shù)方案并參考下面附圖進(jìn)行詳細(xì)的描述而變得更清楚；


圖1為裝配有電極的PCR管的視圖；圖2為一種含裝配電極PCR室的PCR芯片實(shí)例的視圖；圖3至5分別為圖2的PCR芯片的平視圖、縱向剖面圖以及橫向剖面圖；圖6和7為圖2的PCR芯片的聚合反應(yīng)室(polymerization chamber)和電極的加工方法視圖；圖8為在對(duì)照PCR循環(huán)中阻抗實(shí)部(impedance real part)為頻率的函數(shù)的變化曲線；圖9為在對(duì)照PCR循環(huán)中阻抗幅值(impedance magnitude)為頻率的函數(shù)的變化曲線；圖10為在實(shí)際PCR循環(huán)中阻抗實(shí)部為頻率的函數(shù)的變化曲線；圖11為在實(shí)際PCR循環(huán)中阻抗幅值為頻率的函數(shù)的變化曲線；圖12為在對(duì)照PCR循環(huán)中阻抗幅值的變化曲線；圖13為在實(shí)際PCR循環(huán)中阻抗幅值的變化曲線；以及圖14為經(jīng)過誤差校正的實(shí)際PCR循環(huán)中阻抗幅值變化曲線。
發(fā)明詳述依據(jù)本發(fā)明，在步驟(a)中，含PCR反應(yīng)溶液的容器包括，但不限于，常規(guī)的大體積(bulk)PCR管以及聚合微型室(polymerization microchamber)。電極以彼此相對(duì)的方式安裝在PCR反應(yīng)容器中。在大體積PCR管的情況下，電極安裝在從管底算起的預(yù)定高度位置，彼此相對(duì)。同時(shí)，在聚合微型室的情況下，電極安裝在微型室的上側(cè)和下側(cè)或左側(cè)和右側(cè)，這樣成彼此相對(duì)的方式。電極常規(guī)方法加工例如光刻方法。多種金屬電極例如銅(Cu)電極，鉻(Cr)-金(Au)電極，以及砷(As)-攙雜硅電極可用做上述的電極。
在步驟(b)的PCR反應(yīng)中，除了PCR反應(yīng)物和溶液，不需要產(chǎn)生電信號(hào)的特異標(biāo)記的探針或引物。因此，與Miles的專利不同，不需要使用離子化標(biāo)記的引物。依據(jù)本發(fā)明，PCR產(chǎn)物可不用產(chǎn)生電信號(hào)的特異標(biāo)記的探針或引物進(jìn)行檢測(cè)，但不限于這些。
在步驟(c)中，用常規(guī)交流(AC)或直流(DC)發(fā)生器產(chǎn)生電場(chǎng)，其連接到電極對(duì)上。優(yōu)選地，AC頻率范圍為1Hz～100MHz并且平均AC電壓(Vrms)范圍為1mV～10V。
在步驟(d)中，電介質(zhì)特性(dielectric property)包括，但不限于，阻抗，介質(zhì)損耗，介電常數(shù)，以及導(dǎo)納(admittance)，這些都源自電場(chǎng)。這些電(場(chǎng))相關(guān)系數(shù)可以用連接到電極的電介質(zhì)特性測(cè)量裝置測(cè)量出來，例如，可以使用可操作性地連接到電極的阻抗傳感器。
在下文中，本發(fā)明通過實(shí)施例將進(jìn)行更明確的描述。但是，下列實(shí)施例只是用于例舉說明，因此，本發(fā)明不限于或不被其所限制。
實(shí)施例實(shí)施例1裝配電極PCR管的制造在常規(guī)PCR管上打孔，將電極通過孔插入到PCR溶液的中央部位。然后，將電極連接到PCR設(shè)備然后進(jìn)行PCR的同時(shí)，每一輪PCR循環(huán)后就立即檢測(cè)電信號(hào)。在實(shí)施例1中，測(cè)量擴(kuò)增的DNA的阻抗。
詳細(xì)地，在0.2ml PCR管的兩側(cè)打孔，孔徑0.3mm，孔距離管底5mm。然后，將直徑為0.32mm的導(dǎo)線插入到孔中，作為電極。電極是Teflon絕緣的、鍍銀銅導(dǎo)線。電極固定在管壁上，使用熱環(huán)氧樹脂使電極間保持1.5mm的距離。為了降低電極的表面積，存在PCR溶液的管下部分的直徑保持到約1.5mm，并且將小號(hào)電極安裝在管壁表面(圖1)。因此，可以減少可能發(fā)生在電極表面的對(duì)酶或PCR組分的吸附，從而增加了檢測(cè)靈敏度和產(chǎn)物產(chǎn)率。
實(shí)施例2在室中具有上位和下位電極的三層結(jié)構(gòu)的PCR芯片的制造依據(jù)圖6和7顯示的方法進(jìn)行制備在室中具有上位和下位電極的PCR芯片。
首先，用熱氧化在攙雜As的n-型硅片(silicon wafer)1的上和下表面上形成約5,000?；蚋竦腟iO2層3(步驟A)。在片1的上表面的SiO2層3用光刻膠(AZ5214)5包被(步驟B)。在光刻膠上用光刻方法對(duì)上位和下位電極(區(qū)域)圖案化(patterning)后，片放入蝕刻溶液(HF)中從而去除圖案化的SiO2層。用e-束(e-beam)或噴射(sputtering)將由Cr和Au組成的膜(film)7沉積在暴露片和光刻膠的上表面，將Al膜9沉積在片的下表面(步驟C)。在上位電極上通過lift-off方法形成Au-電極(步驟D)。用光刻膠包被Al膜9以及光刻膠在Al膜9上圖案化(步驟E)后，對(duì)Al膜9進(jìn)行蝕刻，將SiO2層3和硅片1用ICP-RIE依次進(jìn)行干蝕刻(步驟F，G，H，和I)。蝕刻后，殘留的光刻膠用丙酮溶解，殘留的Al膜進(jìn)行蝕刻(步驟J和K)。
形成了上位和下位電極的硅片1陽極結(jié)合到玻璃片11，后者通過噴砂處理方法形成孔以作為PCR芯片中的反應(yīng)室。結(jié)合片切割產(chǎn)生最終的芯片。陽極結(jié)合是一種硅片與玻璃片(glass wafer)結(jié)合的方法。在陽極結(jié)合過程中，高電場(chǎng)和熱使玻璃片上陽離子(例如，Na+離子)發(fā)生遷離離開這些片界面，從而在硅片和玻璃片間造成氫鍵結(jié)合。
依據(jù)本實(shí)施例以相對(duì)電極圖案制備的上位(upper)和下位(lower)電極在三維樣式上彼此相對(duì)，與常規(guī)電極不一樣，其在二維平面一定的位置形成。因此，PCR擴(kuò)增的所有DNA可在室(chamber)中進(jìn)行檢測(cè)。
依據(jù)本實(shí)施例制備的PCR芯片顯示在圖2到5中。圖2是PCR芯片的透視圖。圖3為PCR芯片的平面圖并顯示出入口13和出口15。圖4為PCR芯片的縱向剖面圖并顯示出聚合室17和下位電極19。圖5為PCR芯片的橫向剖面圖并顯示出入口13，出口15，上位電極21，下位電極19，聚合室17，以及玻璃片11。
實(shí)施例3用硅直接結(jié)合方法制造二層結(jié)構(gòu)的PCR芯片二層結(jié)構(gòu)的PCR芯片按照實(shí)施例2同樣的方式制造，除了兩塊硅片直接相互結(jié)合。
由于玻璃片沒有用于本實(shí)施例，制造成本和室容積可很易調(diào)整。依據(jù)本方法，不使用金屬電極，在攙雜As的n型硅片的上和下表面蝕刻小面積的SiO2層后，蝕刻的SiO2層可用作電極。因此，可以防止生物分子在金屬表面的吸附，從而提高了PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率以及檢測(cè)靈敏度。
實(shí)施例4PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR產(chǎn)物實(shí)時(shí)檢測(cè)用PCR設(shè)備進(jìn)行，該設(shè)備包括實(shí)施例1中裝配電極的PCR管以及可操作性連接到電極的阻抗傳感器。
PCR反應(yīng)用質(zhì)粒DNA(323bp)作為模板并用Tag DNA聚合酶進(jìn)行。在總數(shù)35個(gè)PCR循環(huán)中，在1st，5th，10th，15th，20th，25th，30th，以及35th循環(huán)的每個(gè)1分鐘延伸反應(yīng)后分別檢測(cè)阻抗(電阻)。然后，在檢測(cè)過程中的溫度與延伸反應(yīng)中一致，在檢測(cè)過程中AC電壓為100mV，頻率為500～5，000Hz。作為對(duì)照，進(jìn)行沒有DNA模板的PCR反應(yīng)然后檢測(cè)阻抗。
結(jié)果見圖8-11。圖8顯示對(duì)照PCR循環(huán)增加中阻抗實(shí)部作為頻率的函數(shù)的變化曲線。如圖8中所示，隨著PcR循環(huán)數(shù)的增加，阻抗實(shí)部增加。同樣，隨著頻率增加，1st循環(huán)和35th循環(huán)中的阻抗實(shí)部的差值下降。
圖9顯示在對(duì)照PCR循環(huán)中阻抗幅值為頻率的函數(shù)時(shí)的變化曲線。如圖9中所示，阻抗虛部(impedance imaginary part)的變化隨PCR循環(huán)數(shù)的增加顯著下降，當(dāng)與(如圖8中所示的)阻抗實(shí)部、阻抗虛部、tangent delta等的變化相比較的時(shí)候。在約1,000Hz區(qū)，阻抗幅值隨PCR循環(huán)數(shù)的增加幾乎沒有發(fā)生變化。盡管沒有DNA擴(kuò)增，在1,077Hz時(shí)1st循環(huán)和35th循環(huán)的阻抗幅值的差值約為45Ω。這可以由電極上dNTPs，引物、以及酶的吸附以及檢測(cè)體系的內(nèi)在干擾得到解釋。這種差異在確定PCR擴(kuò)增的DNA檢測(cè)值時(shí)必須考慮。
圖10顯示在實(shí)際PCR循環(huán)中阻抗實(shí)部作為頻率的函數(shù)的變化曲線。如圖10中所示，隨PCR循環(huán)數(shù)的增加，DNA濃度增加，因此在阻抗實(shí)部中存在顯著的差異。這符合當(dāng)PCR循環(huán)數(shù)為n、被擴(kuò)增DNA的數(shù)為2n倍的理論。
圖11顯示在實(shí)際PCR循環(huán)中阻抗幅值作為頻率的函數(shù)時(shí)隨頻率的變化曲線。如圖11中所示，隨著PCR循環(huán)數(shù)目的增加，阻抗幅值顯著地增加。1st到5th循環(huán)中的阻抗幅值變化較小可以用DNA擴(kuò)增發(fā)生指數(shù)形式的變化的理論得到解釋。同時(shí)，在30th到35th循環(huán)阻抗幅值變化較小的原因是因?yàn)橛捎赑CR組分的耗盡PCR到達(dá)平臺(tái)期。
從圖8-11的結(jié)果可以看出，阻抗幅值最適合進(jìn)行DNA產(chǎn)物的定量分析，依據(jù)PCR循環(huán)數(shù)目的增加，而不是測(cè)量數(shù)值例如阻抗實(shí)部和虛部。這是因?yàn)橄到y(tǒng)干擾相對(duì)與其他測(cè)量值而言對(duì)阻抗幅值的影響最小，如圖8和9中所示。
實(shí)施例5在特定頻率下阻抗幅值隨PCR循環(huán)的變化PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)按照實(shí)施例4中相同的方式進(jìn)行，除了在特定頻率下測(cè)定阻抗幅值隨PCR循環(huán)的變化。依據(jù)實(shí)施例4，最符合PCR理論的結(jié)果在約1,000Hz的頻率?；谠摻Y(jié)果，在1,077Hz頻率時(shí)，測(cè)量擴(kuò)增的DNA和未擴(kuò)增的DNA隨PCR循環(huán)的阻抗幅值。結(jié)果顯示在圖12和13中。
圖12顯示在實(shí)時(shí)的基礎(chǔ)上在對(duì)照PCR反應(yīng)溶液中阻抗幅值的變化曲線，圖13顯示在實(shí)際PCR循環(huán)中阻抗幅值的變化曲線。在1,077Hz時(shí)候，1st循環(huán)與35th循環(huán)的阻抗幅值差值為約45Ω，如圖12中所示，與實(shí)施例4中類似。該數(shù)值是由檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)在干擾引起的誤差。如圖13中所示，阻抗幅值隨PCR循環(huán)數(shù)的增加的變化形成S曲線，該形狀表現(xiàn)出PCR產(chǎn)物的指數(shù)增加?；谏鲜鼋Y(jié)果，在實(shí)際PCR循環(huán)中，經(jīng)過45Ω誤差-校正的(error-corrected)阻抗幅值見圖14。
從上述描述可以明顯看出，依據(jù)本發(fā)明，PCR產(chǎn)物可以在PCR過程中進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量。
此外，檢測(cè)體系可通過檢測(cè)電信號(hào)而縮微化。
盡管本發(fā)明已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)的說明并參考典型的技術(shù)方案進(jìn)行了描述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解可以有很多不偏離如下述權(quán)利要求所限定的本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的形式和細(xì)節(jié)上的改變。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物的方法，包括(a)在含PCR溶液容器中裝配至少一對(duì)電極；(b)進(jìn)行PCR；(c)在電極間產(chǎn)生電場(chǎng)；以及(d)檢測(cè)PCR溶液中的電介質(zhì)特性變化。
2.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(b)中，PCR在無離子化標(biāo)記的引物存在的條件下進(jìn)行。
3.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中含PCR溶液的容器為PCR管或聚合微型室。
4.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中電介質(zhì)特性為阻抗、介質(zhì)損耗、介電常數(shù)、或?qū)Ъ{。
5.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(c)中，電場(chǎng)用1Hz～100MHz頻率的交流電產(chǎn)生。
6.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(c)中，電場(chǎng)用1mV～10V的平均AC電壓產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物的方法。所述方法包括(a)在含PCR溶液容器中裝配至少一對(duì)電極；(b)進(jìn)行PCR；(c)在電極間產(chǎn)生電場(chǎng)；以及(d)檢測(cè)PCR溶液中的電介質(zhì)特性變化。因此，PCR產(chǎn)物可以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1499194SQ03158419
公開日2004年5月26日 申請(qǐng)日期2003年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月12日
發(fā)明者李哉勛, 李在昌, 尹大成, 林根培 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社