專利名稱：芳族氨基酸代謝物或其衍生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過大腸桿菌的需氧發(fā)酵制備芳族氨基酸代謝物或其衍生物的方法，其中發(fā)酵包括生長期和生產(chǎn)期，以及在發(fā)酵期間對葡萄糖和L-酪氨酸進行控制。
在本申請中，術(shù)語″芳族氨基酸代謝物或其衍生物″是指除L-酪氨酸和來源于L-酪氨酸的產(chǎn)品外的任何代謝物，其是芳族氨基酸路徑中的一種中間體，或者是芳族氨基酸路徑中的一種最終產(chǎn)物，或者是來源于這樣的一種代謝物的產(chǎn)品。芳族氨基酸代謝物或其衍生物的例子，例如是3-脫氧-D-阿拉伯糖基-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脫氫奎尼酸、奎尼酸、氫醌、3-脫氫莽草酸、兒茶酚、己二酸、環(huán)多醇、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇丙酮酸-3-磷酸、分支酸、L-色氨酸、靛青、預苯酸、L-p-羥基苯基甘氨酸、L-苯基甘氨酸、D-p-羥基苯基甘氨酸、D-苯基甘氨酸、苯丙酮酸、L-苯基丙氨酸、D-苯基丙氨酸、鄰氨基苯甲酸、鄰氨基苯甲酸核苷酸、1-(鄰羧基苯基氨基)-1-脫氧核酮糖-5-磷酸、吲哚3-甘油磷酸、吲哚、4-羥基苯基丙酮酸。優(yōu)選地，芳族氨基酸代謝物或其衍生物是L-苯基丙氨酸、D-苯基丙氨酸、D-羥基苯基甘氨酸、D-苯基甘氨酸或莽草酸。更優(yōu)選地，芳族氨基酸代謝物或其衍生物是L-苯基丙氨酸或環(huán)多醇中的一種2，3-反-環(huán)己二烯二醇或3，4-反-環(huán)己二烯二醇。
術(shù)語″需氧發(fā)酵″是指在整個發(fā)酵期間存在氧并且對氧沒有限制。
大腸桿菌發(fā)酵中的生長期是指其中大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的生物質(zhì)濃度增加的階段。生物質(zhì)濃度可以通過在620nm(OD620)處測定發(fā)酵培養(yǎng)基的光密度進行測定。大腸桿菌發(fā)酵的生產(chǎn)期是指其中形成產(chǎn)品芳族氨基酸代謝物或其衍生物的階段。生長期和生產(chǎn)期可以輪流出現(xiàn)，但是在實踐中生長期和生產(chǎn)期是重疊在一起的。
術(shù)語″發(fā)酵培養(yǎng)基″是指含有所有組分包括大腸桿菌細胞的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
Takagi等人(1996)在Biotechnology and Bioengineering Vol.52，p 653-660中公開了一種通過大腸桿菌的需氧發(fā)酵制備芳族氨基酸代謝物或其衍生物的方法，其中發(fā)酵包括生長期和生產(chǎn)期，以及在發(fā)酵期間對葡萄糖和L-酪氨酸進行控制。所述文章描述了一種通過重組大腸桿菌AT2471的需氧發(fā)酵制備L-苯基丙氨酸的方法，在發(fā)酵期間，葡萄糖的初始數(shù)量耗盡后，發(fā)酵開始10小時后(差不多恰好開始進入生產(chǎn)期)，將發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度控制在0.1g/L，以及初始L-酪氨酸耗盡后，其在30小時后(差不多恰好在生長期的末尾)，將L-酪氨酸進料控制在每小時向體積為13.5升的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入100mg 2g/L的L-酪氨酸溶液(相當于每小時加入約0.2g L-酪氨酸)。
在Takagi(1996)等人的實驗中，通過將發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度保持在0.1g/L以下，來控制葡萄糖濃度，因為人們相信為了獲得較高的生產(chǎn)率，必須防止乙酸的累積。通常認為，為了避免乙酸的累積，需要將葡萄糖濃度控制在一個較低的水平，這一點也被其它人證實(尤其是Sakamoto等人(1994)J.Ferm.Bioeng.Vol.78，p304-309，Shiloachet等人(1996)Biotechnol.Bioeng.Vol 49，p421-428，Luli等人(1990)，Appl.Environ.Microbiol.Vol 56，p 1004-1011)。
在用一種大腸桿菌菌株發(fā)酵制備一種芳族氨基酸代謝物或其衍生物中，由大腸桿菌分泌的乙酸鹽所引起的乙酸的累積是不需要的，因為它可以引起生長速率降低、最終的細胞濃度降低[Kleman等人，1991，Appl.Environ.Microbiol.57(4)918-923]和葡萄糖吸收降低[XuB.，等人，1999 Biotechnol.Prog.15，81-90]并因此引起方法的總收率減少(產(chǎn)品/底物，以摩爾％表示)。
因此，乙酸鹽可以抑制發(fā)酵是已知的。在本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基中的細胞外乙酸鹽濃度妨礙發(fā)酵過程時被稱為起抑制作用的乙酸鹽濃度。起抑制作用的乙酸鹽濃度是隨菌株而改變的并且在本發(fā)明中被定義為有機體的最大生產(chǎn)率減半時的濃度。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道起抑制作用的乙酸鹽濃度還存在其它的定義。例如，Xu等人在Biotechn.Prog.Vol.15，1999，p 81-90中將起抑制作用的乙酸鹽濃度定義為最大細胞生長減半時的濃度并且對于來源于大腸桿菌K12菌株W3110，測定出起抑制作用的乙酸鹽濃度(k1)為9g/L。在一個優(yōu)選實施方案中，進行發(fā)酵，直到達到起抑制作用的乙酸鹽濃度為止；然后，可以根據(jù)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知的方法分離生成的產(chǎn)物。
已知L-酪氨酸通?？捎糜诜甲灏被崧窂降姆答佌{(diào)節(jié)。這種反饋調(diào)節(jié)是雙重的(1)在芳族氨基酸途徑中，它抑制某些酶，其中通過L-酪氨酸(例如3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶，亦稱為DAHP合酶)進行反饋調(diào)節(jié)和(2)它對tyrR調(diào)節(jié)子具有一種活化效應，其在L-酪氨酸的影響下產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)，其抑制一些表達在芳族氨基酸途徑中的酶必需的基因的表達。Frberg等人發(fā)現(xiàn)[(1988)J.Biotechnol.Vol 8，p291-300]，36mg/L的L-酪氨酸濃度導致86％的DAHP合酶被抑制并且L-酪氨酸濃度降低到1.8mg/升時，酶的合成被抑制到44％。
因此，存在過多的L-酪氨酸也強烈影響芳族氨基酸代謝物或其衍生物的生產(chǎn)。為了在通過大腸桿菌的需氧發(fā)酵生產(chǎn)芳族氨基酸代謝物或其衍生物期間限定L-酪氨酸存在的數(shù)量，通常使用一種大腸桿菌菌株，其對于L-酪氨酸是營養(yǎng)缺陷型的(即菌株本身不產(chǎn)生任何L-酪氨酸)。Takagi等人(1996)在初始L-酪氨酸(大約在發(fā)酵30小時后)耗盡后，將L-酪氨酸進料保持在一個恒定的數(shù)值(約0.2g/h)，因為L-酪氨酸是細胞保養(yǎng)所需要的，但是過多的L-酪氨酸導致L-苯基丙氨酸生產(chǎn)的減少。
在發(fā)酵培養(yǎng)基中控制葡萄糖低于0.1g/L的一個缺點是在大規(guī)模的發(fā)酵中，在生產(chǎn)芳族氨基酸代謝物或其衍生物中，如果葡萄糖是微生物使用的主要碳源，那么在整個發(fā)酵培養(yǎng)基中將永不會獲得最大的生產(chǎn)率。這是由下面的事實造成的，即在大規(guī)模發(fā)酵中，在整個發(fā)酵介質(zhì)中葡萄糖的分布(以及其它營養(yǎng)素)從來是不均勻的。因此，在大規(guī)模發(fā)酵中把葡萄糖的濃度控制在小于0.1g/L，將引起在發(fā)酵介質(zhì)中存在這樣的局部區(qū)域，其中該局部區(qū)域中葡萄糖濃度遠遠不足以確保由使用葡萄糖作為主要碳源的微生物產(chǎn)生的產(chǎn)品的最大生產(chǎn)率。如果葡萄糖濃度不足以確保最大生產(chǎn)率，則葡萄糖濃度被稱為受限制的。如果葡萄糖濃度是受限制的，則將減少微生物對其產(chǎn)品的選擇性，意味著將生成更多的副產(chǎn)物。副產(chǎn)物是指由葡萄糖生成的除產(chǎn)品本身(芳族氨基酸代謝物或其衍生物)外的任何其它東西。
本發(fā)明的一個目的是提供一種通過大腸桿菌需氧發(fā)酵生產(chǎn)芳族氨基酸代謝物或其衍生物的方法，其中發(fā)酵包括生長期和生產(chǎn)期，在此發(fā)酵中，葡萄糖和L-酪氨酸是受控制的，其中在發(fā)酵介質(zhì)的任何地方，葡萄糖的濃度是不受限制的，其中防止由乙酸鹽引起的抑制以及其中L-酪氨酸的抑制作用是受限制的。
本發(fā)明的目的是通過在至少部分生產(chǎn)期期間、在發(fā)酵介質(zhì)中將葡萄糖濃度控制在1-20g/L范圍內(nèi)以及在發(fā)酵介質(zhì)中控制L-酪氨酸濃度低于36mg/L而得以實現(xiàn)。
令人吃驚地是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，即使當發(fā)酵介質(zhì)中將葡萄糖的濃度控制在1g/L以上，在生產(chǎn)期內(nèi)至少10小時，乙酸鹽濃度沒有起抑制作用。
根據(jù)本發(fā)明，將發(fā)酵介質(zhì)中的葡萄糖濃度控制在1-20g/L的范圍內(nèi)，優(yōu)選控制在1-15g/L的范圍內(nèi)，更優(yōu)選控制在3-10g/L的范圍內(nèi)，最優(yōu)選控制在4-6g/L的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，葡萄糖濃度的變化在一個狹小的范圍(子范圍)內(nèi)進行改變，這個狹小的范圍落入1-20g/L的葡萄糖濃度范圍內(nèi)。優(yōu)選地，子范圍的上下限相差不超過10g/L，這意味著，例如，葡萄糖濃度被控制在3-13g/L，或者被控制在7-17g/L，或者被控制在1-11g/L。更優(yōu)選地，子范圍的上下限相差不超過5g/L，這意味著，例如，葡萄糖濃度被控制在3-8g/L，或者被控制在7-12g/L，或者被控制在1-6g/L。尤其更優(yōu)選地，子范圍的上下限相差不超過2g/L，這意味著，例如，葡萄糖濃度被控制在3-5g/L，或者被控制在16-18g/L，或者被控制在4-6g/L。最優(yōu)選地，子范圍的上下限相差不超過1g/L，這意味著，例如，葡萄糖濃度被控制在5-6g/L，或者被控制在17-18g/L，或者被控制在1-2g/L。獲得最佳結(jié)果的子范圍是3-10g/L，尤其是4-6g/L。
優(yōu)選初始葡萄糖達到所選控制范圍內(nèi)的數(shù)值后，控制發(fā)酵介質(zhì)中的葡萄糖濃度。發(fā)酵介質(zhì)中的初始葡萄糖濃度優(yōu)選在10-40g/L的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在15-35g/L的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在整個生產(chǎn)期內(nèi)控制葡萄糖。
優(yōu)選初始L-酪氨酸濃度在或低于所選L-酪氨酸極限濃度的上限后，并且優(yōu)選在初始量的L-酪氨酸被完全消耗完之前，開始控制L-酪氨酸。L-酪氨酸初始濃度優(yōu)選在100-380mg/L的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在200-300mg/L的范圍內(nèi)。開始控制L-酪氨酸的時間并不重要，但是可以在發(fā)酵3小時后，優(yōu)選在發(fā)酵4小時后，更優(yōu)選在發(fā)酵5小時后，最優(yōu)選在發(fā)酵6小時后開始控制L-酪氨酸。令人吃驚地是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，如果在發(fā)酵中，開始控制L-酪氨酸比Takagi等人(1996)描述的30小時早許多，那么產(chǎn)物/底物的收率將增加。優(yōu)選將發(fā)酵介質(zhì)中的L-酪氨酸濃度控制在低于36mg/L，更優(yōu)選低于20mg/L，尤其更優(yōu)選低于10mg/L。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，只要發(fā)酵在生長期，優(yōu)選對L-酪氨酸進行控制。當發(fā)酵不再處于生長期(通常發(fā)酵20小時后)，任選地開始恒定的L-酪氨酸進料。加入到含細胞干重濃度(CDW)為1g/L的發(fā)酵介質(zhì)的生物反應器中的L-酪氨酸的恒定數(shù)量優(yōu)選在0.01-5g酪氨酸/h的范圍內(nèi)。因此，如果含10升發(fā)酵介質(zhì)的生物反應器具有30g/L的CDW(總CDW為300g)，則L-酪氨酸每小時進料的數(shù)量優(yōu)選在0.003-1.5kg的范圍內(nèi)。CDW可以如在材料和方法中描述的那樣進行測定。
適于在本發(fā)明的方法中使用的大腸桿菌菌株全部是大腸桿菌菌株，其具有將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酪氨酸營養(yǎng)缺陷型的芳族氨基酸代謝物或其衍生物的能力。在芳族氨基酸代謝物或其衍生物的生產(chǎn)中，優(yōu)選從所需的終產(chǎn)物時起，菌株具有一種阻礙下游路徑如從所需的終產(chǎn)物開始的路徑的作用，其中下游路徑(例如在莽草酸生產(chǎn)中，產(chǎn)生莽草酸-3-磷酸鹽以及其它)將使所需的終產(chǎn)物(例如莽草酸)發(fā)生進一步轉(zhuǎn)化?；蛘撸瑢⑺杞K產(chǎn)物從生產(chǎn)細胞中分離出來。更優(yōu)選地，除了阻礙下游路徑外，產(chǎn)生其他產(chǎn)物而不是所需終產(chǎn)物的路徑(分枝路徑)也被阻礙(例如在L-苯基丙氨酸作為所需終產(chǎn)物的情況中，到L-酪氨酸的路徑)。上述所有措施的目的在于使葡萄糖物流高效率地轉(zhuǎn)化為所需的終產(chǎn)物(芳族氨基酸代謝物或其衍生物)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員清楚地知道可能存在不是上面所述的其它路徑獲得類似的結(jié)果。
合適的大腸桿菌菌株的例子例如是生產(chǎn)L-苯基丙氨酸的菌株，其是基于大腸桿菌K12的菌株，優(yōu)選大腸桿菌W3110，更優(yōu)選大腸桿菌LJ110(Zeppenfeld等人(2000)，J.Bacteriol.Vol 182，p4443-4452。能夠生產(chǎn)例如L-色氨酸、3-脫氫莽草酸和D-苯基丙氨酸的大腸桿菌菌株的其它例子是描述在Bongaertset等人(2001)Metabolic Engineering(2001)vol.3，p 289-300中。
能夠從芳族氨基酸路徑生產(chǎn)一種產(chǎn)物，更具體地說，從葡萄糖生產(chǎn)莽草酸3-磷酸鹽，以及其中使莽草酸3-磷酸鹽進一步轉(zhuǎn)化成5-烯醇丙酮?；?莽草酸-3-磷酸鹽的下游路徑被阻斷的大腸桿菌菌株的一個例子，是大腸桿菌菌株AB2829(CGSC-strain，Pittard等人(1966)JBacteriol.Vol 92，p 1494-1508)。此菌株在負責使莽草酸3-磷酸鹽轉(zhuǎn)化成5-烯醇丙酮?；?莽草酸-3-磷酸鹽的編碼5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸鹽合酶(EPSP-合酶)的基因(aroA)上具有一個缺失。
具有從葡萄糖生產(chǎn)L-苯基丙氨酸能力并且其中產(chǎn)生不同產(chǎn)物的分枝路徑已經(jīng)被阻斷的大腸桿菌菌株的其它例子是大腸桿菌K12菌株4pF26和4pF69，其在編碼分支酸變位酶/預苯酸脫氫酶的基因(tyrA)上具有一個缺失，其在正常的環(huán)境下造成預苯酸轉(zhuǎn)化為4-羥苯基丙酮酸(一種生產(chǎn)L-酪氨酸的前體)。
為了限制L-酪氨酸的抑制作用，將大部分野生型(WT)基因aroFWT(編碼L-酪氨酸反饋調(diào)節(jié)的3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶)從大腸桿菌的基因組中刪去并在大腸桿菌菌株中，例如在載體上修補，或者用抗L-酪氨酸反饋(FBR)的基因aroFFBR的變體插入基因組中等。
令人吃驚地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明中，使用含有野生型aroF-基因(aroFWT)的大腸桿菌菌株，要比使用刪去了aroFWT-基因并且用aroFFBR修補的大腸桿菌菌株，產(chǎn)生更高產(chǎn)物產(chǎn)率葡萄糖生產(chǎn)L-苯基丙氨酸的收率(以摩爾％表示)。因此，在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，使用一種大腸桿菌菌株，其中aroFWT例如在一種載體上或在大腸桿菌基因組中表達。
本發(fā)明方法的反應條件是通常在大腸桿菌需氧發(fā)酵所選擇的反應條件下進行并且是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的，溫度在10-70℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選在25-40℃的范圍內(nèi)，最優(yōu)選在33-37℃的范圍內(nèi)，pH值在5-9的范圍內(nèi)，優(yōu)選在6-8的范圍內(nèi)，最優(yōu)選在6.6-6.8的范圍內(nèi)。培養(yǎng)基的組成也是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的；所使用的一種非常合適的培養(yǎng)基是M9培養(yǎng)基(Sambrook等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
可以合適地對葡萄糖濃度進行監(jiān)控，例如直接用在材料和方法中描述的方法進行監(jiān)控，因此可以對葡萄糖進行調(diào)節(jié)。
L-酪氨酸濃度可以合適地通過測量與L-酪氨酸濃度線性或非線性相關(guān)的可測量的變量(例如廢氣信號，例如CO2排放率或氧吸收率)而間接地進行監(jiān)控。可以憑經(jīng)驗建立相關(guān)性，并因此可以用來調(diào)節(jié)L-酪氨酸的進料，以便使L-酪氨酸的濃度保持在所選設(shè)定值之下以及使芳族氨基酸代謝物或其衍生物的收率最佳化。
在本發(fā)明的一種特殊的實施方案中，根據(jù)下面的線性方程(1)來調(diào)節(jié)L-酪氨酸的濃度Vtyr[gLh]=A[mmolLh]-k[mmolLh]m[mmolg]---(1)]]>L-酪氨酸(Vtyr)的進料可以根據(jù)A(其是測定的氧吸收率(OUR)，或者CO2排放率(CER))進行調(diào)節(jié)，以使L-酪氨酸濃度保持在所選的控制濃度之下。在方程式1中，m和k表示可以調(diào)節(jié)的控制參數(shù)，例如通過增加m或k值，來增加L-酪氨酸的限制范圍。應該最好地選擇控制參數(shù)，以便使芳族氨基酸代謝物或其衍生物的產(chǎn)率最佳化。m值通常在0.1-4的范圍內(nèi)；k值通常在20-40的范圍內(nèi)。最佳的m和k值可以憑經(jīng)驗確定。當使用此方法對L-酪氨酸濃度進行有效控制時，其它狀態(tài)變量如pH值、溫度或(DO)應該保持不變。
本發(fā)明通過下列實施例進行說明。但是，這些實施例并不是對本發(fā)明進行限制。
實施例材料和方法下列材料和方法在所有實施例中使用。實施例III和/或IV與實施例I和II的差別表示在本文中。
培養(yǎng)基組成發(fā)酵培養(yǎng)基3.0g/L MgSO4x7H2O、0.015g/L CaCl2xH2O、3.0g/LKH2PO4、1.0g/L NaCl、5.0g/L(NH4)2SO4、0.075/0.1g/L FeSO4x7H2O/檸檬酸鈉、0.075g/L硫胺素、0.3g/L L-酪氨酸、0.1g/L氨芐青霉素、15g/L葡萄糖和1.5mL/L的含2.0g/L Al2(SO4)3x18H2O、0.75g/L CoSO4x7H2O、2.5g/L CuSO4x5H2O、0.5g/L H3BO3、24g/LMnSO4xH2O、3.0g/L Na2MoO4x2H2O、2.5g/L NiSO4x6H2O和15.0g/LZnSO4x7H2O的微量元素溶液。預培養(yǎng)培養(yǎng)基除了下面改變外，相同的培養(yǎng)基用于發(fā)酵0.3g/L的MgSO4x7H2O、0.1g/L的NaCl、0.0075g/L的硫胺素xHCl、0.08g/L的L-酪氨酸、5.0g/L葡萄糖和額外的12g/L的K2HPO4(最終pH值為7.2)。除額外量的0.08g/L的L-苯丙氨酸以及10g/L(而不是實施例I和II中的5g/L)的葡萄糖的總量外，在實施例III和IV中使用相同的預培養(yǎng)培養(yǎng)基。除使用額外量的0.6g/L的L-苯丙氨酸外，在實施例III中使用相同的發(fā)酵培養(yǎng)基(在實施例IV中使用0.5g/L的L-苯丙氨酸)以及在實施例III和IV中只使用10g/L的葡萄糖。除使用額外量的0.6g/L的L-苯丙氨酸外，在實施例III中使用相同的發(fā)酵培養(yǎng)基(在實施例IV中使用0.5g/L的L-苯丙氨酸)以及在實施例III和IV中只使用10g/L的葡萄糖。
預培養(yǎng)在-80℃將冷凍培養(yǎng)物儲存在含50％甘油的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中。將250ml(在實施例III和IV中為120ml)預培養(yǎng)培養(yǎng)基裝入到1000ml的搖瓶中，向其中接種1.0ml(在實施例III和IV中為0.3ml)原料，在37℃下在搖瓶培養(yǎng)箱中以145rpm培養(yǎng)16h(在實施例III和IV中為160rpm)。
培養(yǎng)在合成培養(yǎng)基中葡萄糖被用作唯一的碳源。通過25％的氨水滴定控制pH值。將葡萄糖和L-酪氨酸(由于是L-酪氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株)加入到生物反應器以保證在分批階段期間細胞的生長。另外，對于實施例III和IV，還加入L-苯丙氨酸(由于是苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株)。分兩次加料L-Tyr(25g/L的L-酪氨酸進料，溶于5％的氨水中)，或者對于實施例III和IV為混合的L-酪氨酸/L-苯丙氨酸進料(25g/L的酪氨酸和30g/L的L-苯丙氨酸，溶于20％的氨水中)和葡萄糖(700g/L(對于實施例III為500g/L))后，然后開始延長生長期。兩種底物的進料速度通過控制策略自動地進行調(diào)適，在過程控制系統(tǒng)中完成。當開始進料階段時，通過加入IPTG(最終濃度為100μM)促使生成產(chǎn)物(L-苯丙氨酸、2，3-反環(huán)己二烯二醇或3，4-環(huán)己二烯二醇)。通過L-Tyr限制(對于實施例I和II，在約OD620≈80處，對于實施例III和IV，在約OD620≈50處)停止細胞生長，以150mg/h的進料速度(實施例III和IV是20mg/h)確保用于細胞維持的不間斷的酪氨酸(以及在實施例III和IV的情況中是L-苯丙氨酸)供應，直到發(fā)酵結(jié)束為止。
培養(yǎng)在20.0L的生物反應器(ISF 200，infors；Switzerland)(實施例III和IV在7.5L的生物反應器中(L1532，Bioengineering，Switzerland)中進行，接種10％；初始體積為7.5L(對于實施例III和IV為3.5L)，培養(yǎng)溫度為37℃，pH值為6.5。生物反應器和外圍設(shè)備滅菌后，校準pH值傳感器、DO傳感器和尾氣分析儀，將6.75L(實施例III和IV中為3.15L)發(fā)酵培養(yǎng)基通過死端微量過濾裝置(截止值為2μm，Satorbran，Satorius，Germany)直接過濾到生物反應器中。
脫機分析以1.5-2.5h間隔(對于實施例III和IV，間隔為1.0-2.0h)采樣，進行脫機分析。進行適當稀釋后，使用分光光度計(ShimadzuUV-160，Germany)在620nm處測定細胞濃度。通過讓2.5-10.0ml的發(fā)酵培養(yǎng)基通過一個預稱重的微量過濾器(0.2μm cut off，Schleicher & Schuell；Germany)來過濾細胞干重(CDW)。在80℃下干燥過濾器24h后，稱重后，計算細胞干重。取樣后，進行合適的稀釋后，立即通過基于酶的生物傳感器裝置Accutrend(HoffmannLaRoche Diagnostics；Switzerland)測定葡萄糖。通過HPLC(Sycam；Germany)使用離子排斥柱(AminexHPX-87H，BioRad；Germany)和分光光度檢測器(S3300，Sycam；Germany)在215nm處測定乙酸濃度。氨基酸濃度(L-苯丙氨酸和L-酪氨酸)通過下面方法進行測定用氨基特異性的反應物鄰苯二甲醛(OPA)和巰基-乙醇進行預衍生化，接著使用反相柱(Lichrospher 100 RP 18-5 EC，Merck；Germany)和熒光檢測器(RF-535，Shimadzu；Germany)進行HPLC(Sycam；Germany)測定。通過反相HPLC(HP 1100 System，Hewlett Packard Company，Palo Alto，USA)使用LichrospherC8柱(CS ChromatographieService GmbH，Langerwehe，Germany)和預柱(Lichrospher 100 RP18-5EC，CS Chromatographie Service GmbH，Langerwehe，Germany)進行測定產(chǎn)物2，3反-環(huán)己二烯二醇濃度。2，3反-環(huán)己二烯二醇是通過光電二極管矩陣檢測器(DAD)在275nm處進行測定的。
所有1H NMR光譜記錄在Bruker AMX300 FT-NMR光譜儀(300MHz)上。關(guān)于1H NMR，將0.4mL培養(yǎng)物上清液在真空離心機中濃縮至干，將其重新溶解在含4mM的3-(三甲基甲硅烷基)-2，2，3，3-d4-丙酸、TSP的鈉鹽的重水中(D2O)。通過比較代謝物的積分與TSP標準信號(‰)0ppm)的積分，計算NMR樣品中3，4-反-環(huán)己二烯二醇的2，3-反-環(huán)己二烯二醇的濃度。
聯(lián)機葡萄糖測定使用三個蠕動泵(U501和U101，對于實施例III和IV，U504和U101，Watson & Marlow；Germany)以確保連續(xù)取樣。流速為800ml/min的發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)由一個含交叉流空心纖維超濾裝置(500kDa截止值，23cm2過濾面積(對于實施例III和IV為20cm2)Schleicher& Schuell，Germany)的旁路(總體積≈20mL，平均滯留時間≈2s)泵送。以1.0-2.0ml/min的速度排出無細胞滲透液，并泵送至順序聯(lián)機的葡萄糖測定系統(tǒng)(OLGA，IBA GmbH；Germany)的歧管中，其中每120s排出10μL樣品用于分析。未使用的滲透液循環(huán)回到生物反應器中。因此，在發(fā)酵期間，不超過100ml滲透液用于聯(lián)機葡萄糖測定。整個取樣系統(tǒng)用1M的NaOH在50℃下滅菌30分鐘(對于實施例III和IV，為120分鐘)。
實施例I和II的過程控制通過Infors(Switzerland)裝置控制標準工藝參數(shù)。通過與MEDUSA(IBT軟件)和OLGA控制系統(tǒng)連接的LabView(NationalInstruments；U.S.A.)獲得主數(shù)據(jù)。聯(lián)機葡萄糖測定的信號由OLGA通過LabView發(fā)送到MEDUSA，其中由卡爾曼濾波器和最小方差控制器(Bastin et al.，1984)組成的控制系統(tǒng)估算最佳的葡萄糖進料速率以滿足預定的葡萄糖設(shè)定值。在加料系統(tǒng)(Satorius；Germany)的幫助下，自動地調(diào)節(jié)葡萄糖的進料速率。通過測定尾氣中O2-/CO2(Binos100 2M，Leybold，Germany)、生物反應器的重量和氣流速率，聯(lián)機估計體積特異性的氧吸收速度(OUR)，從而在生長期期間間接地控制酪氨酸。在MEDUSA中估算體積特異性的L-酪氨酸消耗速率，在加料系統(tǒng)(Satorius；Germany)的幫助下，使用含25g/L的進料進行調(diào)節(jié)。
實施例III和IV的過程控制通過生物工程(Switzerland)裝置控制標準工藝參數(shù)。通過與OLGA控制系統(tǒng)連接的LabView(National Instruments；U.S.A.)獲得主數(shù)據(jù)。聯(lián)機測定的葡萄糖信號由OLGA發(fā)送到LabView，其中由預報和反饋控制算法(Kleman et al.，1991)估算葡萄糖進料速率以滿足預定的葡萄糖設(shè)定值。在加料系統(tǒng)(Satorius；Germany)的幫助下，自動地調(diào)節(jié)葡萄糖的進料速率。通過測定尾氣(Oxynos100和Binos100，Leybold，Germany)中O2-/CO2、生物反應器的重量和氣流速率(方程式1)，聯(lián)機估計體積特異性的氧吸收速度(OUR)，從而在生長期期間間接地控制L-酪氨酸。在LabView(National Instruments；U.S.A.)中估算體積特異性的L-酪氨酸消耗速率，在加料系統(tǒng)(Satorius；Germany)的幫助下，使用含25g/L的進料進行調(diào)節(jié)。
在實施例I和II中生產(chǎn)L-苯丙氨酸的生物系統(tǒng)基于大腸桿菌K12LJ110(Zeppenfeld et al.2000)，使用質(zhì)粒pJF119EH(Furste et al.，1986)，構(gòu)建兩個生產(chǎn)菌株，分別為大腸桿菌aroF-fbr(為基因型Δ(pheA tyrA aroF)/pJF119EH aroFfbrpheAfbraroLwt編碼)和大腸桿菌aroF-wt(為基因型Δ(pheA tyrAaroF)/pJF119EH aroFwtpheAfbraroLwt編碼)。在兩種菌株中，在染色體中缺失了基因pheA(編碼分支酸變位酶/預苯酸脫水酶)、tyrA(編碼分支酸變位酶/預苯酸脫氫酶)和aroF(編碼DAHP-合酶(3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸鹽))。在大腸桿菌中，三種同工酶AroF(被酪氨酸反饋抑制)、AroG(被苯丙氨酸反饋抑制)和AroH(被色氨酸反饋抑制)使DAHP-合酶具有活性。在大腸桿菌中，aroF-fbr，一種DAHP-合酶的抗酪氨酸衍生物(aroFfbr)被插入到質(zhì)粒上。大腸桿菌的質(zhì)粒aroF-wt包含對酪氨酸敏感的aroFwt而不是aroFfbr。另外，抗苯丙氨酸反饋的pheAfbr和天然aroLwt(編碼莽草酸激酶II)被插入到pJF119EH上，以避免受到苯丙氨酸的PheA反饋抑制以及增加AroL活性。由于ΔtyrA，生產(chǎn)的菌株是酪氨酸營養(yǎng)缺陷型的。由于使用了表達載體pJF119EH，菌株具有氨芐青霉素抗性并且是可IPTG-誘導的(使用耐葡萄糖的tac-促進劑)。
在實施例III中生產(chǎn)2，3-反-環(huán)己二烯二醇的生物系統(tǒng)基于大腸桿菌K12LJ110(Zeppenfeld et al.2000)，使用質(zhì)粒pJF119EH(Furste et al.，1986)，構(gòu)建生產(chǎn)菌株大腸桿菌F82(編碼基因型Δ(pheA tyrA aroF)::kanΔ(entCEBA)::cat/pJF119EHaroFwtaroBwtaroLwtentB entC)。在此菌株中，在染色體中缺失了基因pheA(編碼分支酸變位酶/預苯酸脫水酶)、tyrA(編碼分支酸變位酶/預苯酸脫氫酶)和aroF(編碼DAHP-合酶(3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸))。另外，整個entCEBA操縱子是滅活的。EntCEBA代表含有entC、entE、entB和entA的操縱子。另外，天然aroFwt(編碼DAHP合成酶)、aroLwt(編碼草莽酸激酶II)和aroBwt(編碼脫氫奎尼酸合酶)被插入到pJF119EH上以增加AroF、AroL和AroB的活性。由于pheA的缺失，生產(chǎn)的菌株同樣是L-苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型的。
在實施例IV中生產(chǎn)3，4-反環(huán)己二烯二醇的生物系統(tǒng)作為生產(chǎn)菌株，使用大腸桿菌pC22F82(編碼基因型Δ(pheA tyrAaroF)::kanΔ(entCEBA)::cat/pJF119EH aroFwtaroBwtaroLwtentB)，其不同于在實施例III中被用于2，3-反環(huán)己二烯二醇生產(chǎn)的生產(chǎn)菌株，因為在這種情況下，大腸桿菌菌株沒有表達entC的活性。
實施例I.L-苯丙氨酸的生產(chǎn)用大腸桿菌aro F-fbr菌株進行發(fā)酵。在開始發(fā)酵約10小時時，當初始葡萄糖濃度降低到選定的葡萄糖控制值(0.1；5.0；15.0；30.0)時，開始控制葡萄糖。在開始發(fā)酵6小時的時候開始通過聯(lián)機檢測OUR以及相應地調(diào)節(jié)L-酪氨酸進料，來控制酪氨酸，以使發(fā)酵培養(yǎng)基中的L-酪氨酸的濃度保持在20mg/L以下。在620nm(OD620)處的光密度達到10-15后，加入100M的IPTG，以誘導L-苯丙氨酸生產(chǎn)(在開始發(fā)酵約6小時后)。在停止通過聯(lián)機檢測OUR以及相應地停止調(diào)節(jié)L-酪氨酸的進料控制L-酪氨酸，開始以100mg/h的速度連續(xù)進料L-酪氨酸溶液，該溶液含有25g/L的L-酪氨酸，溶于5％的氨水中。通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度為0.1、5、15和30g/L以及控制L-酪氨酸小于36mg/L，而獲得的不同時間點的發(fā)酵培養(yǎng)基中的L-苯丙氨酸(L-Phe)濃度和乙酸鹽(Ac)濃度列于表1。
表1在控制葡萄糖(10小時后開始)和酪氨酸(6小時后開始)的情況下，發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸。
實施例II.含有野生型aroF的菌株或含有抗反饋aroF的菌株的L-苯丙氨酸生產(chǎn)根據(jù)材料和方法中描述的方法，用4pF69菌株(含有野生型aroF)和4pF26菌株(含有抗反饋aroF)進行發(fā)酵。在開始發(fā)酵約10小時時，當初始葡萄糖濃度降低到發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為5g/L時，開始控制葡萄糖。在開始發(fā)酵后6小時的時候開始通過聯(lián)機檢測OUR以及相應地調(diào)節(jié)L-酪氨酸進料，來控制酪氨酸，以使發(fā)酵培養(yǎng)基中的L-酪氨酸濃度保持在20/L以下。選擇2個不同的m-值(m＝1.0，m＝1.5)，將K值設(shè)定為30。達到在620nm處的光密度(OD620)后，加入100μM的IPTG以誘導L-苯丙氨酸生產(chǎn)。在停止通過聯(lián)機檢測OUR和相應地停止調(diào)節(jié)L-酪氨酸進料控制L-酪氨酸后，開始以100mg/h的速度連續(xù)進料L-酪氨酸溶液，該溶液含有25g/L的L-酪氨酸，溶于5％的氨水中。對于不同m-值和不同菌株，在不同時間點的發(fā)酵培養(yǎng)基中的L-苯丙氨酸(L-Phe)濃度列于表2中。
表2在控制酪氨酸和葡萄糖的情況下，在使用aroF野生型菌株和arof抗反饋菌株進行的發(fā)酵中，L-苯丙氨酸的收率，其中葡萄糖的控制值按照方程式1用不同的m-值計算得到。
實施例III.2，3-反環(huán)己二烯二醇的生產(chǎn)根據(jù)材料和方法中描述的，使用上述F82pC20菌株進行發(fā)酵。在開始發(fā)酵約5小時時，當初始葡萄糖濃度降低到發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為4g/L時，開始控制葡萄糖。葡萄糖控制在約5g/L的設(shè)定值。在開始發(fā)酵7.5小時的時候開始通過聯(lián)機檢測OUR以及相應地調(diào)節(jié)L-酪氨酸進料，來控制酪氨酸，以使發(fā)酵培養(yǎng)基中的L-酪氨酸濃度保持在約20/L以下。當光密度達到8-9(OD620nm)(在開始發(fā)酵約6小時后)后，加入100μM的IPTG，以誘導2，3-反-環(huán)己二烯二醇的生產(chǎn)。在停止通過聯(lián)機檢測OUR以及相應地停止調(diào)節(jié)L-酪氨酸/L-苯丙氨酸進料控制L-酪氨酸后。(開始發(fā)酵16小時后)，為了控制L-酪氨酸濃度小于36mg/L以及為了使L-苯丙氨酸的濃度達到飽和(大于100mg/L)，開始以20mg/h的速度連續(xù)進料L-酪氨酸/L-苯丙氨酸溶液，該含有12.5g/L的L-酪氨酸和15g/L的L-苯丙氨酸，溶于10％的氨水中。該發(fā)酵的結(jié)果列于下圖3中
表3在控制葡萄糖(5小時后開始)和酪氨酸(7.5小時后開始)的情況下，發(fā)酵生產(chǎn)2，3-反-環(huán)己二烯二醇。
*用HPLC測定。
**由1H-NMR計算得到。
實施例IV.3，4-反環(huán)己二烯二醇的生產(chǎn)用F82pC22菌株進行發(fā)酵。在開始發(fā)酵約7小時時，當初始葡萄糖濃度降低到發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為5g/L時，開始控制葡萄糖。葡萄糖控制在約3.5g/L的設(shè)定值。在開始發(fā)酵9小時的時候開始通過聯(lián)機檢測OUR以及相應地調(diào)節(jié)L-酪氨酸進料，來控制L-酪氨酸，以使發(fā)酵培養(yǎng)基中的L-酪氨酸濃度保持在約20/L以下。當光密度(OD620nm)達到8-9后(約為開始發(fā)酵6.5小時后)，加入100μM的IPTG以誘導3，4-反-環(huán)己二烯二醇的生產(chǎn)。在停止通過聯(lián)機檢測OUR以及相應地停止調(diào)節(jié)L-酪氨酸/L-苯丙氨酸進料控制L-酪氨酸后(開始發(fā)酵16小時后)，為了將L-酪氨酸濃度限制在檢測極限以下以及為了飽和L-苯丙氨酸的濃度(大于100mg/L)，開始以20mg/h的速度連續(xù)進料L-酪氨酸/L-苯丙氨酸溶液，其含有12.5g/L的L-酪氨酸和15g/L的L-苯丙氨酸，溶于10％的氨水中。該發(fā)酵的結(jié)果列于下圖4中
表4在控制葡萄糖(7小時后開始)和酪氨酸(9小時后開始)的情況下，發(fā)酵生產(chǎn)3，4-反-環(huán)己二烯二醇。
**由1H-NMR計算得到。
權(quán)利要求
1.通過大腸桿菌需氧發(fā)酵制備芳族氨基酸代謝物或其衍生物的方法，其中發(fā)酵包括生長期和生產(chǎn)期，并且在發(fā)酵中，對葡萄糖和L-酪氨酸進行控制，其特征在于在至少部分生產(chǎn)期期間，將發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度控制在1-20g/L的范圍內(nèi)，以及將發(fā)酵培養(yǎng)基中的L-酪氨酸濃度控制在小于36mg/L。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于將葡萄糖濃度控制在3-10g/L的范圍內(nèi)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于葡萄糖濃度在1-20g/L的范圍內(nèi)或葡萄糖濃度在3-10g/L的范圍內(nèi)，將葡萄糖濃度控制在上下限相差不超過5g/L的子范圍內(nèi)。
4.權(quán)利要求1-2的任意一項的方法，其特征在于將葡萄糖濃度控制在4-6g/L的范圍內(nèi)。
5.權(quán)利要求1-2或4的任意一項的方法，其特征在于將L-酪氨酸濃度控制在小于20mg/L。
6.權(quán)利要求1、2、4或5中任意一項的方法，其特征在于進行發(fā)酵，直到作為發(fā)酵的副產(chǎn)物而生產(chǎn)的乙酸鹽的濃度達到起抑制作用的乙酸鹽濃度為止。
7.權(quán)利要求1、2、4-6中任意一項的方法，其特征在于在整個生產(chǎn)期期間對葡萄糖進行控制。
8.權(quán)利要求1、2、4-7中任意一項的方法，其特征在于只要發(fā)酵處于生長期，就對發(fā)酵培養(yǎng)基中的酪氨酸濃度進行控制。
9.權(quán)利要求1、2、4-8中任意一項的方法，其特征在于在停止對酪氨酸濃度的控制后，開始持續(xù)地進料酪氨酸。
10.權(quán)利要求1、2、4-9中任意一項的方法，其特征在于選擇持續(xù)的酪氨酸進料，使得每小時每細胞干重濃度的L-酪氨酸進料的數(shù)量為0.01-5g。
11.權(quán)利要求1、2、4-10中任意一項的方法，其特征在于通過使用一個憑經(jīng)驗建立的一種可測變量之間的相關(guān)性來調(diào)節(jié)酪氨酸進料，并因此調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基中的酪氨酸濃度，從而控制培養(yǎng)基中的酪氨酸濃度。
12.權(quán)利要求1、2、4-11中任意一項的方法，其特征在于在培養(yǎng)基中的酪氨酸濃度是通過按照下列方程調(diào)節(jié)酪氨酸進料而進行控制的V·tyr[gLh]=A[mmolLh]-k[mmolLh]m[mmolg]---(1)]]>其中A表示發(fā)酵中的氧吸收速率(OUR)或CO2排放速率(CER)，Vtyr表示酪氨酸進料以及其中k和m表示控制參數(shù)。
13.權(quán)利要求1、2、4-1 2中任意一項的方法，其特征在于使用大腸桿菌W3110。
14.權(quán)利要求1、2、4-13中任意一項的方法，其特征在于芳族氨基酸代謝物或其衍生物是L-苯丙氨酸、2，3-反-環(huán)己二烯二醇或3，4-反-環(huán)己二烯二醇。
15.根據(jù)14的方法，其特征在于在大腸桿菌中，aroFWT被表達。
16控制酪氨酸濃度的方法，它通過使用一個憑經(jīng)驗建立的一種可測變量之間的相關(guān)性以調(diào)節(jié)酪氨酸進料，并因此調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基中的酪氨酸濃度。
17.權(quán)利要求16的方法，其特征在于按照下列方程式調(diào)節(jié)酪氨酸進料V·tyr[gLh]=A[mmolLh]-k[mmolLh]m[mmolg]---(1)]]>其中A表示發(fā)酵中的氧吸收速率(OUR)或CO2排放速率(CER)，Vtyr表示酪氨酸進料以及其中k和m表示控制參數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過大腸桿菌需氧發(fā)酵生產(chǎn)芳族氨基酸代謝物或其衍生物的方法，其中發(fā)酵包括生長期和生產(chǎn)期，并且在此發(fā)酵中，對葡萄糖和L－酪氨酸進行控制，其中在至少部分生產(chǎn)期期間，將發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度控制在1－20g/L的范圍內(nèi)以及將發(fā)酵培養(yǎng)基中的L－酪氨酸濃度控制在小于36mg/L。
文檔編號C12P13/22GK1617933SQ02827652
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月5日
發(fā)明者M·R·格里克, L·J·R·M·拉文, G·斯倫格, R·塔科斯, C·旺德雷伊 申請人:Dsm Ip財產(chǎn)有限公司, Dsm生物技術(shù)股份有限公司, 于利奇研究中心有限公司