專利名稱：調(diào)節(jié)酒酵母中的尿素降解的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是微生物生物化學(xué)領(lǐng)域。在一方面，本發(fā)明涉及對參與生物體中氮分解代謝的生物化學(xué)途徑的操作，所述生物體具有發(fā)酵碳水化合物以產(chǎn)生乙醇的能力。在選定的實施方式中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生酒和其它發(fā)酵產(chǎn)物的培養(yǎng)物和方法。
背景技術(shù)：
精氨酸是葡萄汁中存在的主要氨基酸之一(Henschke和Jiranek，1993)。精氨酸被認(rèn)為通過GAP1基因編碼的普通氨基酸通透酶(Jauniaux和Grenson，1990)或通過CAN1基因編碼的精氨酸通透酶(Hoffmann，1985)轉(zhuǎn)運到酵母細(xì)胞中。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )中，據(jù)報道通過CAR1基因產(chǎn)物，即，精氨酸酶將精氨酸降解為尿素和鳥氨酸(Middelhoven，1964；Sumrada和Cooper，1982)。
DUR1，2基因編碼雙功能酶，脲羧化酶-脲基甲酸酯水解酶(Dur1，2；脲酰胺裂解酶)，該酶可以將尿素降解為氨和CO2。在來源于綠藻的酶中單獨地編碼脲羧化酶功能，其催化反應(yīng)ATP+尿素+CO2＝ADP+磷酸+尿素-1-羧酸(EC 6.3.4.6；系統(tǒng)名稱尿素二氧化碳連接酶(ADP-形成)；其它名稱脲酶(ATP-水解)；脲羧化酶(水解)；ATP-脲酰胺裂解酶；CAS登記號9058-98-4；Roon等，1970；Roon和Levenberg，1972；Sumrada和Cooper，1982)。在來源于綠藻的酶中也單獨地編碼脲基甲酸酯水解酶功能，其催化反應(yīng)尿素-1-羧酸+H2O＝2 CO2+2 NH3(EC 3.5.1.54；系統(tǒng)名稱尿素-1-羧酸酰胺水解酶；其它名稱脲基甲酸酯裂解酶；CAS登記號79121-96-3；Maitz等，1982；Roon，等.，1972；Sumrada和Cooper，1982)。
在釀酒酵母(S.cerevisiae)中，通過葡萄汁中存在的優(yōu)選氮源，DUR1，2基因受到氮分解代謝物抑制(Nitrogen catabolite repression，NCR)(Genbauffe和Cooper，1991)。沒有降解的尿素可以通過酵母細(xì)胞分泌到發(fā)酵的葡萄汁中。分泌的尿素可以與葡萄汁中的乙醇反應(yīng)以形成氨基甲酸乙酯，已經(jīng)證明氨基甲酸乙酯可以在各種試驗動物中引起各種良性和惡性腫瘤(Mirvisch，1968)，因此可以認(rèn)為它是人類健康的潛在威脅。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及如下認(rèn)識在發(fā)酵的葡萄汁、酒或蒸餾酒精飲料中，尿素濃度可以通過調(diào)節(jié)釀酒酵母(S.cerevisiae)中編碼脲羧化酶和脲基甲酸酯水解酶活性的DUR1，2基因的氮分解代謝物抑制來控制。因此，在一方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化的酵母菌株，所述轉(zhuǎn)化導(dǎo)致可以降低發(fā)酵條件下酵母菌株表達(dá)的編碼尿素降解酶活性的基因的氮分解代謝物抑制。例如，可以用包含編碼尿素降解酶活性的編碼序列的重組核酸或者用適應(yīng)于在發(fā)酵條件下介導(dǎo)尿素降解酶活性表達(dá)的啟動子轉(zhuǎn)化酵母菌株。在一些實施方式中，本發(fā)明利用了與釀酒酵母(S.cerevisiae)DUR1，2啟動子及編碼序列同源的天然或修飾的序列。本發(fā)明的酵母菌株和核酸可以例如，用在生產(chǎn)發(fā)酵的酒精飲料，如酒和其它發(fā)酵產(chǎn)品的方法中。
附圖的簡要說明

圖1顯示DUR1，2基因的上游區(qū)域，該上游區(qū)域結(jié)束于DUR1，2編碼序列的起始處。圖中信息來源于公開的釀酒酵母(S.cerevisiae)染色體II的完整染色體序列(Genbank LOCUS NC-001134，ACCESSION NC-001134，REGIONcomplement(635670..643177)，VERSION NC_001134.2，G114270686；Feldmann，H.，Aigle，M.，Aljinovic，G.，Andre，B.，Baclet，M.C.，Barthe，C.，Baur，A.，Becam，A.M.，Biteau，N.，Boles，E.等，″酵母染色體II的完整DNA序列，″EMBO J.13(24)，5795-5809(1994)；Goffeau，A.，Barrel，B.G.，Bussey，H.，Davis，R.W.，Dujon，B.，F(xiàn)eldmann，H.，Galibert，F(xiàn).，Hoheisel，J.D.，Jacq，C.，Johnston，M.，Louis，E.J.，Mewes，H.W.，Murakami，Y.，Philippsen，P.，Tettelin，H.和Oliver，S.G.，″具有6000個基因的生命，″Science 274(5287)，546(1996))。
圖2顯示了DUR1，2基因上游區(qū)域的部分序列，其在DUR1，2起始密碼子ATG處終止。突出顯示了兩個推定的NCR元件GATAA(G)盒子(一個盒子在-54到-58位置，另一個盒子在-320到-324位置)及推定的TATAA盒子。
圖3顯示在用DUR1，2表達(dá)盒子基因工程改造的酵母中DUR1，2轉(zhuǎn)錄和翻譯的上調(diào)。(A)利用α32P-dATP標(biāo)記的DUR1，2探針，通過總RNA的Northern分析比較含有(泳道2)或缺乏(泳道1)DUR1，2 cDNA的轉(zhuǎn)化GVY400細(xì)胞中DUR1，2的表達(dá)。編碼組蛋白4的HHFI用作RNA上樣標(biāo)準(zhǔn)。(B)通過從轉(zhuǎn)化體提取的總蛋白質(zhì)中存在的生物素化蛋白質(zhì)的Western印跡，觀察在含有(泳道3)或缺乏(泳道2)DUR1，2 cDNA的轉(zhuǎn)化GVY400細(xì)胞中尿素酰胺裂解酶的表達(dá)。利用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白，通過化學(xué)發(fā)光，在X-射線膠片上進(jìn)行檢測。將高分子量生物素化標(biāo)準(zhǔn)品(每泳道5μg)包含作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物(泳道1)。
圖4是根據(jù)DI/TRISEC方法(Dietmaler和Fabry，1995)，克隆DUR1，2基因到pHVX2質(zhì)粒中以產(chǎn)生PJC1的策略示意圖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Ausubel等，1995)，從釀酒酵母(S.cerevisiae)TCY1制備獲得基因組DNA。利用ExTaq(Takara)DNA聚合酶，通過PCR擴(kuò)增DUR1，2基因的編碼序列。所用的引物是對于基因5′末端5TTAAAAAAATGACAGTTAGTTCCGATACA3′，和對于基因3′末端5TCGAAAAAGGTATTTCATGCCAATGTTATGAC3′黑體字指明起始密碼子和終止密碼子的互補(bǔ)序列。用T4 DNA聚合酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物以除去3’側(cè)翼末端的一些核苷酸。當(dāng)需要時，通過添加足夠的核苷酸終止酶的3′-5′外切核酸酶活性。通過EcoR1和BgIIII限制酶切割質(zhì)粒pHVX2(VolschenK等，1997)，然后用大腸桿菌(E.coli)聚合酶I的Klenow片段處理。在dATP和dGTP存在的情況下部分補(bǔ)平限制性位點以有和插入克隆相匹配的序列。
圖5是將腐草霉素抗性基因盒子克隆到含有DUR1，2基因的pJC1(標(biāo)注的pHVX2或pRUR1，2)中的示意圖。利用標(biāo)準(zhǔn)重組方法構(gòu)建pJC2(標(biāo)注的pHVX2phleo或pDUR1，2phleo)(Ausubel等，1995)。
圖6是質(zhì)粒pJC2/DUR1，2 phleo(在圖中標(biāo)注為pDUR1，2 phleo)的示意圖，其是來源于pJC2phleo載體的多拷貝游離型釀酒酵母-大腸桿菌(S.cerevisiae-E.coli)穿梭質(zhì)粒，其中DUR1，2基因插在酵母磷酸甘油酸激酶(PGK1)基因的調(diào)節(jié)序列(啟動子和終止子序列)之間。LEU2標(biāo)記有利于亮氨酸營養(yǎng)缺陷型轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的篩選。質(zhì)粒也含有組成型TEF1酵母啟動子和CYC1酵母終止子驅(qū)動的Tn5B1e基因。帶有這種盒子的酵母細(xì)胞變得對腐草霉素有抗性。這種陽性篩選標(biāo)記可能特別適合于與不帶有營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的工業(yè)轉(zhuǎn)化酵母菌株一起應(yīng)用。
圖7是表示本發(fā)明轉(zhuǎn)化酵母降低培養(yǎng)基中尿素濃度的能力的圖示。用pJC2/DUR1，2phleo質(zhì)?；蛘邲]有DUR1，2基因的pJC2phleo質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DUR1，2染色體座位被破壞的單倍體實驗室酵母菌株。這種突變菌株的應(yīng)用允許在缺少由于尿素酰胺裂解酶內(nèi)源活性導(dǎo)致的背景的情況下評估此菌株的性能。在含有0.1％谷氨酰胺的基本培養(yǎng)基中生長轉(zhuǎn)化細(xì)胞，收獲并用于接種新鮮培養(yǎng)基。1小時后，添加33mg/L的尿素。每隔2小時收獲等份的培養(yǎng)物，在有玻璃珠的培養(yǎng)基中破壞打開細(xì)胞，通過離心除去細(xì)胞碎片。一旦收集上清液后，加熱使酶失活，測定樣品中存在的尿素。該方法有利于同時測定細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的尿素，從而允許區(qū)分細(xì)胞攝取的尿素和細(xì)胞代謝的尿素。此外，有規(guī)律地測定600nm吸收值以檢查每個培養(yǎng)物的生長階段。標(biāo)準(zhǔn)差n＝6。用實心圓形表示的數(shù)據(jù)是用pJC2phleo轉(zhuǎn)化的實驗室菌株接種的培養(yǎng)基中的尿素濃度。用實心方形表示的數(shù)據(jù)是用pJC2/DUR1，2phleo轉(zhuǎn)化的實驗室菌株接種的培養(yǎng)基中的尿素濃度。用空心圓形表示的數(shù)據(jù)是pJC2phleo菌株的600nm吸收值。用空心方形表示的數(shù)據(jù)是pJC2/DUR1，2phleo菌株的600nm吸收值。左側(cè)Y軸是以mg/L表示的尿素。右側(cè)Y軸是600nm的吸收值。X軸是接種后的小時數(shù)。
發(fā)明的詳細(xì)描述在各個方面，本發(fā)明涉及基因的修飾和重組基因的用途。在本上下文中，術(shù)語“基因”以其通常定義使用，意指一組可操作連接的核酸序列。本發(fā)明上下文中基因修飾可以包括對基因中可操作連接的各個序列中任一序列的修飾?！翱刹僮鬟B接”意指特定序列直接或間接地相互作用以實現(xiàn)它們預(yù)期的功能，如基因表達(dá)的介導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用?？刹僮鬟B接的序列的相互作用可以通過例如蛋白質(zhì)介導(dǎo)，而該蛋白質(zhì)又與這些序列相互作用。
基因的表達(dá)通常涉及由部分基因編碼的多肽的產(chǎn)生。該過程通常包括至少兩步編碼序列轉(zhuǎn)錄以形成RNA，該RNA本身可以有直接的生物作用或者可以由其中部分mRNA翻譯為多肽。盡管還沒有完全理解轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程，但是認(rèn)為DNA的幾個區(qū)域控制DNA序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。每個區(qū)域都是具有期望順序的一系列堿基(即，包含腺苷(A)，胸苷(T)，胞苷(C)，和鳥苷(G)的一系列核苷酸殘基)。
基因中通常存在的區(qū)域包括啟動子序列，該啟動子序列具有引起RNA聚合酶和其它轉(zhuǎn)錄因子與DNA啟動子片段結(jié)合的區(qū)域。在起始轉(zhuǎn)錄前，RNA聚合酶通常沿著啟動子的間插區(qū)域移動，到達(dá)可以引導(dǎo)RNA聚合酶開始mRNA合成的轉(zhuǎn)錄起始序列位置。據(jù)認(rèn)為，RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄起始序列外的適當(dāng)距離處，如約20到約30個堿基處開始mRNA合成。前述序列一起稱作基因的啟動子區(qū)域，其可以包括其它可以修飾基因表達(dá)的元件。這種復(fù)雜啟動子可以含有一個或多個參與基因誘導(dǎo)或抑制的序列。
在本發(fā)明上下文中，“啟動子”意指當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域可操作地連接目的序列時，能夠介導(dǎo)或調(diào)節(jié)目的核苷酸序列以期望的空間或時間模式及期望的程度轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域和目的序列“可操作地連接”是指這兩個序列功能性地連接，由此使得轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域可以介導(dǎo)或調(diào)節(jié)目的序列的轉(zhuǎn)錄。在一些實施方式中，為了可操作地連接，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域可以和目的序列位于相同的鏈上。在一些實施方式中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域可以位于目的序列的5’。在這種實施方式中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域可以直接是目的序列的5’或這些區(qū)域間可以存在間插序列。在一些實施方式中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可以位于目的序列的3’。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域和目的序列的可操作連接可能需要適當(dāng)?shù)姆肿?如轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì))結(jié)合到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域上，因此本發(fā)明包括體外或體內(nèi)提供這種分子的實施方式。
可以被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄為信使RNA的DNA序列通常始于不翻譯成蛋白質(zhì)的序列，該序列稱作mRNA鏈5’非翻譯末端，其可以結(jié)合核糖體。此非翻譯序列(帽子)可以在基因轉(zhuǎn)錄后添加。在遇到“起始密碼子”之前mRNA一直移動穿過核糖體。起始密碼子通常是AUG三堿基系列；很稀少地，密碼子GUG可以引起翻譯的起始。
基因中下一個堿基序列通常稱作編碼序列或結(jié)構(gòu)序列。起始密碼子引導(dǎo)核糖體開始通過肽鍵將一系列氨基酸相互連接形成多肽，該多肽從形成多肽氨基末端的甲硫氨酸開始(隨后，甲硫氨酸殘基可以通過其它酶從多肽上除去)。AUG起始密碼子后面接著的堿基被分成3個一組，每一組是一個密碼子?！伴喿x框架”由起始密碼子確定，其規(guī)定了堿基如何聚在一起形成3個一組。每個密碼子編碼一個將添加到形成中的多肽上的特定氨基酸。三種密碼子(UAA，UAG和UGA)通常是“終止”密碼子；當(dāng)終止密碼子到達(dá)核糖體的翻譯機(jī)器時，形成的多肽將脫離核糖體，之前最后一個氨基酸殘基成為多肽的羧基末端。
位于單順反子基因中終止密碼子3’側(cè)的mRNA區(qū)域稱為3’-非翻譯區(qū)。在該區(qū)域轉(zhuǎn)錄后，該區(qū)域可以參與mRNA的加工、穩(wěn)定性和/或轉(zhuǎn)運。該區(qū)域也可以包含可被細(xì)胞中酶識別的聚腺苷酸化信號，該聚腺苷酸化信號被所述酶識別后，該酶可以將相當(dāng)多數(shù)量的腺苷殘基添加到mRNA分子上形成poly-A尾巴。
本發(fā)明的各種基因和核酸序列可以是重組序列。術(shù)語“重組”意指重新組合的一些東西，因此提到核酸構(gòu)建體時此術(shù)語指由通過分子生物學(xué)技術(shù)在某一點連接在一起或形成的核酸序列組成的分子。當(dāng)與蛋白質(zhì)或多肽一起提到術(shù)語“重組”時指利用通過分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的重組核酸構(gòu)建體表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽分子。當(dāng)與遺傳組成一起提到術(shù)語“重組”時指具有新的等位基因組合的配子或子代或細(xì)胞或基因組，且這種新的等位基因組合在天然存在的親代基因組中不存在。重組核酸構(gòu)建體可以包括與如下核酸序列連接或通過操作以和此核酸序列連接的核苷酸序列，所述核酸序列在自然界中沒有與該核苷酸序列連接，或者在自然界中所述核苷酸序列在不同位置與該核酸序列連接。因此，稱核酸構(gòu)建體為“重組體”是指利用基因工程通過人為干預(yù)操作的核酸分子。
重組核酸構(gòu)建體可以例如，通過轉(zhuǎn)化引入宿主細(xì)胞。這種重組核酸構(gòu)建體可以包括已經(jīng)分離出來并重新引入宿主物種細(xì)胞中的來源于相同宿主細(xì)胞物種或來源于不同宿主細(xì)胞物種的序列。
作為宿主細(xì)胞最初轉(zhuǎn)化的結(jié)果或者作為隨后重組和/或修復(fù)事件的結(jié)果，重組核酸序列可以整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組。可替代地，重組序列可以作為染色體外元件保持。這種序列例如，可以利用生物體如轉(zhuǎn)化的酵母菌株來復(fù)制，而所述菌株可以作為菌株改良方法的起始菌株，并通過突變、混合交配(mass mating)或原生質(zhì)體融合實現(xiàn)所述的菌株改良。如術(shù)語“重組”在本文的使用，由此得到的保留了本發(fā)明重組序列的菌株本身被認(rèn)為是“重組”的。
在本發(fā)明的各個方面，可以利用例如在Itakura等，美國專利號4,598，049；Caruthers等，美國專利號4,458,066；和Itakura美國專利號4,401,796和4,373,071中公開的技術(shù)化學(xué)合成核酸分子。如這里所用的術(shù)語，這種合成的核酸本質(zhì)就是“重組”的(是用于將分子的各組成部分組合在一起的連續(xù)步驟的產(chǎn)物)。
轉(zhuǎn)化是通過在細(xì)胞中摻入一個或多個外源核酸從而改變細(xì)胞帶有的遺傳物質(zhì)的過程。例如，可以利用各種方法轉(zhuǎn)化酵母(Gietz等，1995)。通過將外源核酸摻入到細(xì)胞遺傳物質(zhì)中，或者利用由細(xì)胞暴露于外源核酸引起的細(xì)胞內(nèi)源遺傳材料的改變可以實現(xiàn)這種轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)化細(xì)胞是通過對外源核酸的攝取已被遺傳改變的細(xì)胞或細(xì)胞后代。如本文所用，這些術(shù)語適用于通過隨后的細(xì)胞世代保持了期望的遺傳改變的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代，并與同樣可以存在于隨后的細(xì)胞世代中的其它突變或改變無關(guān)。
在可替代的方面，本發(fā)明涉及用在發(fā)酵中以產(chǎn)生各種產(chǎn)品，如酒、啤酒、生面團(tuán)、乙醇或醋的酵母菌株。在可替代的實施方式中，本發(fā)明可以利用例如釀酒酵母(S.cerevisiae)菌株，貝酵母(S.bayanus)菌株，或者裂殖酵母(Schizosaccharomyces)菌株。例如，用在釀酒中的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可以包括釀酒酵母(S.cerevisiae)菌株或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)菌株，如Bourgovin(RC 212釀酒酵母)，ICV D-47釀酒酵母，71 B-1122釀酒酵母，K1V-1116釀酒酵母，EC-1118貝酵母，Vin13，Vin7，N96，和WE352。有多個商業(yè)來源可獲得酵母菌株，如加拿大魁北克省蒙特利爾Lallemand Inc.。
在一些實施方式中，本發(fā)明的一些方面可以利用有尿素降解活性，如DUR1，2的脲羧化酶和脲基甲酸酯水解酶活性的內(nèi)源或外源酶。例如，這些酶可以與DUR1，2或有相關(guān)活性的DUR1，2區(qū)域同源。
當(dāng)兩序列(如天然DUR1，2蛋白質(zhì)或天然DUR1，2核酸序列和可替代用在本發(fā)明中的蛋白質(zhì)或核酸序列)最優(yōu)聯(lián)配(align)時，序列間同源性程度可以表示為同一性百分比，意指序列間精確匹配的出現(xiàn)?？梢岳酶鞣N算法，如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math 2482的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443的同源性聯(lián)配算法，Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444的相似性檢索方法，和這些算法的計算機(jī)化執(zhí)行程序(如，在Wisconsin GeneticsSoftware Package(Genetics Computer Group，Madison，WI，U.S.A.)中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA)進(jìn)行序列最優(yōu)聯(lián)配以實現(xiàn)同一性比較。也可以利用Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10(利用公開的默認(rèn)設(shè)置值)中所述的BLAST算法進(jìn)行序列聯(lián)配。從National CenterFor Biotechnology Information(通過互聯(lián)網(wǎng)在http//www.ncbi.nlm.nih.gov)可以得到進(jìn)行BLAST分析的軟件。BLAST算法涉及首先通過鑒定查詢序列中的短長度的字W來鑒定高得分序列對(HSP)，其中所述字當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字聯(lián)配時將匹配或滿足一定的正閾值分?jǐn)?shù)T。T被稱為相鄰字得分閾值。最初的相鄰字命中點作為種子被用來起始檢索以便發(fā)現(xiàn)更長HSP。字命中點沿著每個序列向兩個方向延伸，只要累積的聯(lián)配記分可以增加即可。在每個方向上當(dāng)下面的參數(shù)滿足時，字命中點的延伸停止累積聯(lián)配得分從它的最大獲得值降低了量X；由于一個或多個負(fù)得分殘基聯(lián)配的累積，累積得分趨向零或更低值；或者達(dá)到任一個序列的末端。BLAST算法參數(shù)W，T和X決定了聯(lián)配的靈敏度和速度。對于雙鏈核酸比較，BLAST程序可以利用如下作為默認(rèn)值字符長度(W)11、BLOSUM62記分矩陣(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)、聯(lián)配(B)50，期待值(E)10(在可替代的實施方式中其可以改變?yōu)?或0.1或0.01或0.001或0.0001；盡管遠(yuǎn)高于0.1的E值不可能鑒定功能相似的序列，但是它可以用于檢查具有較低顯著性的命中，0.1和10間的E值可以用于短區(qū)域的相似性)，M＝3，N＝4。對于蛋白質(zhì)比較，BLASTP可以利用如下默認(rèn)值G＝11(空位開放罰分)；E＝1(空位延伸罰分)；E＝10(在該設(shè)置下的期待值，即，預(yù)期具有等于或好于定義的聯(lián)配分?jǐn)?shù)S的得分的10個命中點可以偶然出現(xiàn)在與所檢序列具有相同大小的數(shù)據(jù)庫中；可以增加或減少E值以改變檢索的嚴(yán)格性)；和W＝3(字長，對于BLASTN，默認(rèn)值是11，對于其它blast程序是3)。BLOSUM矩陣向聯(lián)配中的每個位置賦予概率分?jǐn)?shù)，該概率分?jǐn)?shù)基于在相關(guān)蛋白質(zhì)的共有序列模塊間出現(xiàn)置換的已知頻率。在BLAST2.0中默認(rèn)使用BLOSUM62(空位存在罰分＝11；每個殘基的空位罰分＝1；λ比率＝0.85)置換矩陣。各種其它矩陣可以用作BLOSUM62的替代，該替代矩陣包括PAM30(9，1，0.87)；PAM70(10，1，0.87)；BLOSUM80(10，1，0.87)；BLOSUM62(11，1，0.82)和BLOSUM45(14,2，0.87)。利用BLAST算法，對兩個序列間統(tǒng)計學(xué)相似性的一個測量是最小和概率(smallest sumprobability，P(N))，其指示了兩個核苷酸或氨基酸序列間偶然出現(xiàn)匹配的概率。在本發(fā)明可替代實施方式中，如果在所檢測序列的比較中，最小和概率小于大約1，優(yōu)選小于約0.1，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為核苷酸或氨基酸序列基本等同。
在一些實施方式中，本發(fā)明的核酸序列可以基本相同，如與DUR1，2蛋白質(zhì)或DUR1，2核酸序列基本相同。當(dāng)最佳聯(lián)配時，這些序列的基本同一性可以用同一性百分比反映，例如，這些同一性百分比可以是大于50％，80％到100％，至少80％，至少90％或至少95％，在基因?qū)ぐ械孜锏那闆r下，其可以指基因?qū)ぐ械孜锏囊徊糠趾桶行蛄械囊徊糠值耐恍裕渲型恍缘某潭扔欣谕磁鋵椭亟M和/或修復(fù)。兩個核酸基本相同的可替代指標(biāo)是在中等嚴(yán)格條件下，或優(yōu)選嚴(yán)格條件下兩個序列互相雜交。例如，在中等嚴(yán)格條件下，可以在0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，1mM EDTA中，在65℃進(jìn)行與結(jié)合濾膜的序列的雜交，并在0.2×SSC/0.1％SDS中及在42℃下洗滌(參見Ausubel等，(編輯)，1989，Current Protocols in Molecular Blology，1卷，Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley & Sons，Inc.，New York，在2.10.3頁)?？商娲兀?，在嚴(yán)格條件下，可以在0.5M NaHPO4，7％SDS，1mM EDTA中，在65℃進(jìn)行與結(jié)合濾膜的序列的雜交，并在0.1×SSC/0.1％SDS中在68℃洗滌(參見Ausubel等，(編輯)，1989，同上引文)。根據(jù)目的序列，利用已知方法可以修改雜交條件(參見Tijssen，1993，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic A cidProbes，Part I，Chapter 2，＂核酸探針試驗的策略和雜交原則的概覽″，Elsevier，New York)。通常，在限定的離子濃度和pH下，選擇的嚴(yán)格條件為對于特定序列而言比其熱熔點低約5℃。洗滌，例如，對于嚴(yán)格雜交而言，可以為至少15分鐘，30分鐘，45分鐘，60分鐘，75分鐘，90分鐘，105分鐘或120分鐘。
正如本領(lǐng)域熟知的，可以在多肽，如DUR1，2的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行一些修改和改變，而基本不改變該肽的生物學(xué)功能，從而獲得生物學(xué)上等同的多肽。在本發(fā)明的一方面，具有脲羧化酶和/或脲基甲酸酯水解酶活性的蛋白質(zhì)可以包括通過保守氨基酸替代而不同于天然DUR1，2序列的蛋白質(zhì)。如這里所用，術(shù)語“保守氨基酸替代”指在蛋白質(zhì)給定位置上用一個氨基酸對另一個氨基酸進(jìn)行替代，其中可以進(jìn)行這種替代而不實質(zhì)上造成相關(guān)功能的損失。在進(jìn)行這種改變時，可以基于側(cè)鏈取代基，例如，它們的大小、電荷、疏水性、親水性等的相對類似性進(jìn)行類似氨基酸殘基的替代，并且通過常規(guī)測定可以檢測這種替代對蛋白質(zhì)功能的影響。
在一些實施方式中，可以進(jìn)行將一個氨基酸殘基替代為另一個有類似疏水性值(例如，在加或減2.0的值之內(nèi))的氨基酸殘基的保守氨基酸替代，其中下面可以是有約-1.6親水指數(shù)的氨基酸殘基，如Tyr(-1.3)或Pro(-1.6)。氨基酸殘基被賦予如下疏水性值(如美國專利號4,554,101中所詳述，這里將其并為參考文獻(xiàn))Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；和Trp(-3.4)。
在可替代的實施方式中，可以進(jìn)行將一個氨基酸殘基替代為另一個有類似親水指數(shù)(例如，在加或減2.0的值之內(nèi))的氨基酸殘基的保守氨基酸替代。在這種實施方式中，可以基于每個氨基酸殘基的疏水性和電荷特性來確定氨基酸殘基的親水指數(shù)，如下Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。
在可替代實施方式中，可以進(jìn)行將一個氨基酸殘基替代為同類的另一個氨基酸殘基的保守氨基酸替代，其中將氨基酸分成非極性、酸性、堿性和中性類，如下非極性Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Pro，Met；酸性Asp，Glu；堿性Lys，Arg，His；中性Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr。
在可替代實施方式中，保守氨基酸改變包括根據(jù)親水性或疏水性、大小或體積或電荷考慮的改變。通常可以將氨基酸表征為疏水性或親水性，這主要取決于氨基酸側(cè)鏈的特性。根據(jù)Eisenberg等(J.Mol.Bio.179125-142，184)的標(biāo)準(zhǔn)化的共有疏水性標(biāo)度(consensus hydrophobicityscale)，疏水性氨基酸顯示大于零的疏水性，而親水性氨基酸顯示小于零的疏水性。遺傳編碼的疏水性氨基酸包括Gly，Ala，Phe，Val，Leu，Ile，Pro，Met和Trp，遺傳編碼的親水性氨基酸包括Thr，His，Glu，Gln，Asp，Arg，Ser和Lys。非遺傳編碼的疏水性氨基酸包括叔丁基丙氨酸，而非遺傳編碼的親水性氨基酸包括瓜氨酸和高半胱氨酸。
根據(jù)疏水性和親水性氨基酸的側(cè)鏈特性可以進(jìn)一步細(xì)分它們。例如，芳香族氨基酸是具有包含至少一個芳香環(huán)或雜芳香環(huán)的側(cè)鏈的疏水性氨基酸，所述環(huán)可以含有一個或多個取代基，如-OH，-SH，-CN，-F，-Cl，-Br，-I，-NO2，-NO，-NH2，-NHR，-NRR，-C(O)R，-C(O)OH，-C(O)OR，-C(O)NH2，-C(O)NHR，-C(O)NRR等，其中R獨立地是(C1-C6)烷基，取代的(C1-C6)烷基，(C1-C6)鏈烯基，取代的(C1-C6)鏈烯基，(C1-C6)炔基，取代的(C1-C6)炔基，(C5-C20)芳基，取代的(C5-C20)芳基，(C6-C26)烷芳基，取代的(C6-C26)烷芳基，5-20元雜芳基，取代的5-20元雜芳基，6-26元烷雜芳基(alkheteroaryl)或取代的6-26元烷雜芳基。遺傳編碼的芳香族氨基酸包括Phe，Tyr和Tryp。
非極性氨基酸是具有如下側(cè)鏈的疏水性氨基酸，該側(cè)鏈在生理pH不帶電荷并且有這樣的化學(xué)鍵，在該化學(xué)鍵中通常兩個原子中每個原子平均占有兩個原子共用的電子對(即，側(cè)鏈不是極性的)。遺傳編碼的非極性氨基酸包括Gly，Leu，Val，Ile，Ala和Met?？梢詫⒎菢O性氨基酸進(jìn)一步細(xì)分為包括脂肪氨基酸，其是有脂肪烴側(cè)鏈的疏水性氨基酸。遺傳編碼的脂肪族氨基酸包括Ala，Leu，Val和Ile。
極性氨基酸是具有如下側(cè)鏈的親水性氨基酸，該側(cè)鏈在生理pH不帶電荷，但是其具有這樣的化學(xué)鍵，在該化學(xué)鍵中兩個原子之一更近地占有兩個原子共用的電子對。遺傳編碼的極性氨基酸包括Ser，Thr，Asn，和Gln。
酸性氨基酸是具有pKa值小于7的側(cè)鏈的親水性氨基酸。通常，酸性氨基酸在生理pH下由于氫離子的失去具有帶負(fù)電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸包括Asp和Glu。堿性氨基酸是具有pKa值大于7的側(cè)鏈的親水性氨基酸。通常，堿性氨基酸在生理pH下由于水合氫離子的結(jié)合具有帶正電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸包括Arg，Lys和His。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，上述分類不是絕對的，可以將一個氨基酸分在一種以上的類別中。此外，可以基于給定試驗或與以前鑒定的氨基酸比較根據(jù)特征性化學(xué)、物理或生物學(xué)特性和/或已知行為，將氨基酸分類。
在本發(fā)明的各方面，可以調(diào)節(jié)宿主的尿素降解活性，以使得它在發(fā)酵條件，如酒發(fā)酵條件下處于期望水平。術(shù)語“發(fā)酵條件”指在該條件下，生物體，如釀酒酵母(S.cerevisiae)通過發(fā)酵產(chǎn)生能量，即，發(fā)生發(fā)酵的培養(yǎng)條件。廣義地定義，發(fā)酵是厭氧反應(yīng)的總和，在缺乏氧氣的情況下該厭氧反應(yīng)可以為微生物生長提供能量。底物水平的磷酸化提供了發(fā)酵中的能量。在發(fā)酵中，一種有機(jī)化合物(能量源)起到電子供體的作用，而另一有機(jī)化合物是電子受體。各種有機(jī)底物如，碳水化合物、氨基酸、嘌呤和嘧啶均可以用于發(fā)酵。在一方面，本發(fā)明涉及具有發(fā)酵碳水化合物以產(chǎn)生乙醇的能力的生物體，如酵母。
在酒發(fā)酵中，新酒(must)的培養(yǎng)條件來源于用作原料的果汁。例如，葡萄汁的主要組分是葡萄糖(通常約75到150g/l)，果糖(通常約75到150g/l)，酒石酸(通常約2到10g/l)，蘋果酸(通常約1到8g/l)和游離的氨基酸(通常約0.2到2.5g/l)。然而，在主要反應(yīng)是將碳水化合物轉(zhuǎn)化成乙醇的方法中，實際上可以將任何水果或含糖的植物體汁液加工成酒精飲料。
酒酵母通常在pH約4到4.5的范圍中生長和發(fā)酵，并且需要約0.85的最小水活性(或者約88％的相對濕度)?？梢宰尠l(fā)酵自發(fā)進(jìn)行，或者通過用先前發(fā)酵的新酒接種以開始發(fā)酵，在這種情況下，可以用約106到約107cfu/ml果汁的酵母群接種果汁?？梢越o新酒通氣以增大酵母群。一旦發(fā)酵開始，二氧化碳的快速產(chǎn)生通常將維持厭氧條件。發(fā)酵的溫度通常是10℃到30℃，發(fā)酵的持續(xù)時間可以例如，延長至幾天到幾周。
在一個方面，本發(fā)明提供了能夠降低發(fā)酵的酒精飲料中氨基甲酸乙酯濃度的酵母菌株。例如，本發(fā)明可以用于提供具有小于40ppb(μg/L)，35ppb，30ppb，25ppb，20ppb，15ppb，10ppb或5ppb(或50ppb和1ppb間的任何整數(shù)值)氨基甲酸乙酯濃度的酒。在可替代實施方式中，本發(fā)明可以用于提供具有小于約500ppb，400ppb，300ppb，200ppb，150ppb，100ppb，90ppb，80ppb，70ppb，60ppb，50ppb，40ppb，30ppb，20ppb或10ppb(或500ppb和10ppb間的任何整數(shù)值)氨基甲酸乙酯濃度的加度酒或精餾酒精。
在可替代實施方式中，本發(fā)明可以提供能夠在葡萄汁中維持降低的尿素濃度的酵母菌株。例如，尿素濃度可以維持在約15mg/l，10mg/l，5mg/l，4mg/l，3mg/l，2mg/l或1mg/l以下。
在一方面，本發(fā)明提供了篩選發(fā)酵條件下具有期望水平的尿素降解活性的發(fā)酵生物體的天然突變體的方法。例如，可以篩選缺少DUR1，2的NCR的酵母菌株。酵母突變和篩選方法的一個例子參見2000年10月31日發(fā)給Mortimer等的美國專利號6,140,108。在該方法中，可以用誘變劑如乙基甲磺酸、亞硝酸或羥胺處理酵母菌株，產(chǎn)生具有堿基對替代的突變體。可以例如，通過在適合培養(yǎng)基上涂平板篩選具有改變的尿素降解活性的突變體。
在可替代的實施方式中，可以利用定點誘變改變宿主中尿素降解活性的水平。例如，利用定點誘變可以從DUR1，2啟動子中除去NCR介導(dǎo)元件。例如，可以通過替代修飾或缺失如圖2所示的天然DUR1，2啟動子序列中的GATAA(G)盒子。在一個實施方式中，例如，可以通過將G替代為T修飾一個或兩個GATAA(G)盒子，這樣序列變?yōu)門ATAA。例如，在Rothstein，1991；Simon和Moore，1987；Winzeler等，1999；和Negrittoet等，1997中公開了定點誘變的方法。在可替代實施方式中，也可以突變釀酒酵母(S.cerevisiae)中介導(dǎo)NCR的編碼Gln3p和Gatlp的基因以調(diào)節(jié)NCR。
可以相對于非轉(zhuǎn)化的親本菌株測定本發(fā)明酵母菌株的相對尿素降解酶活性。例如，可以篩選本發(fā)明的轉(zhuǎn)化酵母菌株以在發(fā)酵條件下比親本菌株具有更高的尿素降解活性，或者在相同發(fā)酵條件下，活性以一定比例大于親本菌株的活性，如活性為親本菌株活性的至少150％，200％，250％，300％，400％或500％。類似地，可以相對于本發(fā)明重組核酸所來源的非重組序列，利用類似的活性倍數(shù)確定本發(fā)明重組核酸表達(dá)或編碼的酶活性。
在本發(fā)明的一方面，可以提供包含具有DUR1，2編碼序列或其同系物的重組核酸分子的載體，所述核酸分子處于可以介導(dǎo)調(diào)節(jié)DUR1，2多肽表達(dá)的異源啟動子序列的控制下。為了提供這種載體，可以將來源于釀酒酵母(S.cerevisiae)的DUR1，2可讀框(ORF)插入含有可調(diào)節(jié)重組DUR1，2基因表達(dá)的表達(dá)盒子的質(zhì)粒中?？梢詫⒅亟M分子引入選定的酵母菌株以提供具有改變的尿素降解活性的轉(zhuǎn)化菌株。在可替代的實施方式中，也可以通過用其它啟動子置換天然啟動子實現(xiàn)宿主，如釀酒酵母(S.cerevisiae)中天然DUR1，2編碼序列同系物的表達(dá)。利用內(nèi)源編碼序列時，也可以用其它調(diào)節(jié)元件構(gòu)建重組表達(dá)盒子?？梢詫⒅亟M基因或表達(dá)盒子整合進(jìn)入宿主如釀酒酵母(S.cerevisiae)的染色體DNA中。
可以從適宜的天然釀酒酵母(S.cerevisiae)啟動子篩選用在本發(fā)明的可替代方面中的啟動子，如PGK1或CAR1啟動子。這種啟動子可以與其它調(diào)節(jié)元件如PGK1或CAR1終止子一起使用。可以利用各種天然或重組啟動子，其中篩選或構(gòu)建啟動子以便在選定的條件下，如釀酒條件下，其可以介導(dǎo)尿素降解活性，如DUR1，2活性的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了利用宿主，如酵母菌株發(fā)酵碳水化合物的方法，如發(fā)酵酒的方法，其中所述宿主用可以調(diào)節(jié)宿主尿素降解活性的重組核酸轉(zhuǎn)化。例如，在酒釀造酵母菌株中，可以調(diào)節(jié)DUR1，2基因的NCR以增強(qiáng)尿素降解為氨和二氧化碳。根據(jù)本發(fā)明的該方面，可以利用酵母菌株進(jìn)行葡萄汁發(fā)酵以引起有限量的氨基甲酸乙酯產(chǎn)生。
在一個實施方式中，利用標(biāo)準(zhǔn)重組方法(Ausubel等，1995)，將腐草霉素抗性基因盒子克隆進(jìn)入酵母穿梭載體，產(chǎn)生稱為pJC2phleo的質(zhì)粒。通過PCR擴(kuò)增DUR1，2基因的可讀框(ORF)，并將其克隆進(jìn)入pJC2phleo質(zhì)粒，以產(chǎn)生稱為pJC2/DUR1，2phleo的載體。pJC2/DUR1，2phleo載體是多拷貝游離型釀酒酵母—大腸桿菌穿梭質(zhì)粒，其中DUR1，2編碼序列插在酵母磷酸甘油酸激酶(PGK1)基因的調(diào)節(jié)序列間，以致PGK1啟動子和終止子序列可操作地連接DUR1，2編碼序列。LEU2標(biāo)記允許亮氨酸營養(yǎng)缺陷型的轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的篩選。pJC2/DUR1，2phleo質(zhì)粒還含有組成型TEFI酵母啟動子和CYC1終止子驅(qū)動的Tn5Ble基因。轉(zhuǎn)化體的體內(nèi)分析表明，通過對培養(yǎng)基中尿素濃度的測定，與用pJC2phleo轉(zhuǎn)化的細(xì)胞比較，用pJC2/DUR1，2phleo質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的釀酒酵母(S.cerevisiae)細(xì)胞的尿素降解能力顯著增加。
盡管這里公開了本發(fā)明的各種實施方式，但是可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識在本發(fā)明范圍內(nèi)進(jìn)行許多改變和修改。這種修改包括為了達(dá)到相同的效果以基本相同的手段對本發(fā)明任一方面進(jìn)行已知等同物的替代。數(shù)字范圍包含定義范圍的數(shù)字在內(nèi)。在說明書中，詞“包含”用作開放式術(shù)語，基本上等同于短語“包括，但不限于”，并且詞“包括”有相應(yīng)的意思。這里對參考文獻(xiàn)的引用不應(yīng)該理解為承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。這里通過參考文獻(xiàn)形式并入本說明書中引用的所有公開出版物，包括但不限于專利和專利申請，就如同特異單獨地指明在此通過參考文獻(xiàn)形式并入每一份單獨出版物并且如同每一份出版物均在此進(jìn)行了完全的陳述。本發(fā)明包括參考實施例和附圖基本如此前所述的所有實施方式和變體。
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序列表<110>英屬哥倫比亞大學(xué)(THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA)<120>調(diào)節(jié)酒酵母中的尿素降解<130>80021-398<140>WO PCT/CA02/01719<141>2002-11-06<150>US 60/330,993<151>2001-11-06<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列＝引物<400>1ttaaaaaaat gacagttagt tccgataca 29<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列＝引物<400>2tcgaaaaagg tatttcatgc caatgttatg ac 32<210>3<211>1020<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>3tgacagtaaa aaattagttt tgactttaaa taacactgat attttttcta taaagataaa60aaatagaaaa tataattaca tttaacttta aaccacatat agtcgacgag gtgactatat120aattatattc gaatattttt gaactcggat atactaggat cttttttttt cgaatcgatt180ctctcggact ataagtcttc actcgctcat atgtttagag tgtggagtag acgagatcac240aaatttatgt ttgtaagtta aaggttgttg cagattgttt cgagctaagt ttaattcttc300gtcctttttc gttttgtaga cgcacagaat agagttaccg aacgcgattg acgcttgtct360cacgggatac tttatcccct tacttgcgta taaccaaagt aatatctcgc agttagttct420ttctccgtgg tttgatattt gcgtgtaaag agccatcccg atccttgcga aaggacgaat480agaatagact tcgaataaat aacaagcaaa aaaatagaat agactattcc cctttttcgg540accttttcgc gcatttacta ctccgcttta cgtcggtttc tacgcacggc aacgtcaatc600gattgttgga ccgcaagccg ctagcggtat tctctagacg gttaaaattt ttcccataac660
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1.一種轉(zhuǎn)化的酵母菌株，其中，所述轉(zhuǎn)化降低發(fā)酵條件下酵母菌株表達(dá)的尿素降解酶活性的氮分解代謝物抑制。
2.權(quán)利要求1所述的酵母菌株，其中尿素降解酶活性是脲羧化酶或脲基甲酸酯水解酶活性。
3.權(quán)利要求1或2所述的酵母菌株，其中用包含編碼序列的重組核酸轉(zhuǎn)化該菌株，該編碼序列編碼尿素降解酶活性。
4.如權(quán)利要求1或2所述的酵母菌株，其中用含有適應(yīng)于介導(dǎo)發(fā)酵條件下尿素降解酶活性表達(dá)的啟動子的重組核酸轉(zhuǎn)化該菌株。
5.如權(quán)利要求3所述的酵母菌株，其中編碼序列包含與DUR1，2可讀框同源的可讀框。
6.如權(quán)利要求1至5任一項所述的酵母菌株，其中在發(fā)酵條件下酵母菌株發(fā)酵碳水化合物以產(chǎn)生乙醇。
7.如權(quán)利要求1至6任一項所述的酵母菌株，其中酵母菌株是釀酒酵母(S.cerevisiae)菌株。
8.如權(quán)利要求1至7任一項所述的酵母菌株，其中在發(fā)酵條件下酵母菌株產(chǎn)生具有小于30ppb濃度氨基甲酸乙酯的酒。
9.參考實施例和附圖基本如此前所述的酵母菌株。
10.權(quán)利要求1至9任一項所述的酵母菌株在生產(chǎn)發(fā)酵的酒精飲料中的用途。
11.制備發(fā)酵的酒精飲料的方法，包括在發(fā)酵條件下維持權(quán)利要求1至9任一項所述的酵母菌株。
12.權(quán)利要求10或11中所述的發(fā)酵的酒精飲料。
13.如權(quán)利要求12所述的發(fā)酵的酒精飲料，其中飲料是酒或蒸餾的酒精飲料。
14.如權(quán)利要求13所述的發(fā)酵的酒精飲料，其中飲料是酒，并且所述酒具有小于30ppb的氨基甲酸乙酯濃度。
15.權(quán)利要求1至9任一項所述的酵母菌株在生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品中的用途。
16.制備發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包括在發(fā)酵條件下維持權(quán)利要求1至9任一項所述的酵母菌株。
17.權(quán)利要求15或權(quán)利要求16中所述的發(fā)酵產(chǎn)品。
18.修飾酵母菌株的方法，包括轉(zhuǎn)化酵母菌株以降低發(fā)酵條件下酵母菌株表達(dá)的尿素降解酶活性的氮分解代謝物抑制。
19.分離的核酸，其包含當(dāng)與天然DUR1，2啟動子序列最佳聯(lián)配時有95％同一性的啟動子序列，其中該啟動子序列在宿主細(xì)胞中發(fā)酵條件下不介導(dǎo)可操作連接的編碼序列的氮分解代謝物抑制。
20.分離的核酸序列，其包含當(dāng)與天然DUR1，2編碼序列最佳聯(lián)配時有80％同一性的編碼序列，其中該編碼序列可操作地連接啟動子序列，該啟動子序列在宿主細(xì)胞中發(fā)酵條件下不介導(dǎo)編碼序列的氮分解代謝物抑制。
全文摘要
本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化的酵母菌株，其中，所述轉(zhuǎn)化降低發(fā)酵條件下酵母菌株表達(dá)的編碼尿素降解酶活性的基因的氮分解代謝物抑制。例如，提供具有在酒發(fā)酵條件下增強(qiáng)的DUR1，2脲羧化酶－脲基甲酸酯水解酶活性的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。
文檔編號C12G1/022GK1578839SQ02821490
公開日2005年2月9日 申請日期2002年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月6日
發(fā)明者H·J·J·范維倫, A·隆沃, J·庫隆, D·英格利斯 申請人:英屬哥倫比亞大學(xué)