專利名稱：抗蚜蟲轉(zhuǎn)基因小麥高效轉(zhuǎn)化再生體系的建立技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物新技術(shù)，特別是轉(zhuǎn)基因小麥高效轉(zhuǎn)化再生體系的建立方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，自1987年抗蟲轉(zhuǎn)基因植株公開報(bào)道以來，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)殺蟲基因成為綜合防治害蟲的重要途徑之一。成功的研究是利用B.t(Bacillus thuringicnsis)殺蟲蛋白基因來防治鱗翅目和鞘翅目害蟲，而有許多同翅目害蟲，如蚜蟲、稻飛虱、葉蟬等在世界范圍內(nèi)對(duì)作物危害嚴(yán)重。
小麥?zhǔn)侨A北地區(qū)種植面積最大的作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有主導(dǎo)地位。麥蚜是小麥主要害蟲之一，其取食和分泌粘液不僅引進(jìn)作物的直接損失和降低光和作用，而且口器刺入時(shí)產(chǎn)生傷口，傳播十余種植物病毒，會(huì)造成嚴(yán)重的損失。目前，小麥轉(zhuǎn)基因研究與應(yīng)用相對(duì)滯后，遠(yuǎn)不如同為禾本科的水稻、玉米等作物品種，尤其是小麥栽培品種，普遍存在著愈傷組織胚性差，再生率低等特點(diǎn)，造成轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生困難。這是目前限制小麥轉(zhuǎn)基因研究與應(yīng)用的主要因素之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提高小麥細(xì)胞轉(zhuǎn)化再生率，提供一種轉(zhuǎn)基因小麥高效轉(zhuǎn)化再生體系。
本發(fā)明的目的通過以下措施實(shí)現(xiàn)本技術(shù)包括小麥胚性愈傷組織和懸浮細(xì)胞系的建立技術(shù)、小麥細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)及抗蟲轉(zhuǎn)基因小麥的研制技術(shù)，抗蚜蟲轉(zhuǎn)基因小麥高效轉(zhuǎn)化再生體系的建立方法如下(1)供試材料為冬小麥(Tritum aestivum)栽培品種“石4185”、“河農(nóng)859”、“河農(nóng)326”等的幼穗、幼胚、花藥、種子；麥長(zhǎng)管蚜(Macrosiphum avevae)采集于田間。
(2)表達(dá)載體構(gòu)建用Sal I和Sac II內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，從pIP840質(zhì)粒上分離出GNA基因片段(505bp)，插入到pBY505載體的Sma位點(diǎn)上，構(gòu)建成質(zhì)粒pBC98。GNA基因位于Act-1啟動(dòng)子的調(diào)控之下，選擇基因?yàn)閎ar基因。構(gòu)建的pBC98質(zhì)粒全長(zhǎng)7.6Kb，宿主菌為E.Coli DH5a。
(3)小麥胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)取小麥幼穗，滅菌后，用無菌鑷子剝出幼穗，切成0.3-0.5cm長(zhǎng)度的小段，或取二核期小孢子(花藥)、剝離受粉10-15天的幼胚接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25±1暗培養(yǎng)20-25天。誘導(dǎo)出的愈傷組織3-5周繼代一次。
基因型和培養(yǎng)基是影響小麥花藥、幼胚和幼穗培養(yǎng)效果的兩個(gè)重要因素。我們選取了67個(gè)雜交組合和5個(gè)當(dāng)前推廣品種，主要利用C17、W14、N6、K3為基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率多為10％-20％，最高可達(dá)96.6％。綠苗分化率一般為25％-45％，最高達(dá)92％。綠苗誘導(dǎo)率與愈傷組織誘導(dǎo)率呈正相關(guān)。
對(duì)“石4185”、“中麥9”、“河農(nóng)859”、“河農(nóng)326”等7個(gè)品種的幼穗、幼胚進(jìn)行培養(yǎng)，供試材料均有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)80％以上，綠苗分化率多在70％以上，2，4-D是誘導(dǎo)愈傷組織所必需的。
小麥種子愈傷組織誘導(dǎo)率受基因型影響較大，一般為40％-60％之間。誘導(dǎo)出的愈傷組織一般比較松軟，不適于懸浮培養(yǎng)或轉(zhuǎn)化，必須對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)。
一般而言，在附加2，4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生的小麥愈傷組織較松軟，大部分外層細(xì)胞是長(zhǎng)彎型，原生質(zhì)少，愈傷組織內(nèi)部有一些較小的硬核，由細(xì)胞質(zhì)不太濃、近等徑型的細(xì)胞組成。此類愈傷組織胚性差、分化率低，不能建立真正的胚性細(xì)胞系。另一類愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密、生長(zhǎng)慢、易分化。這兩類愈傷組織均難以建立重復(fù)性強(qiáng)的高效率轉(zhuǎn)化再生體系。所以必須對(duì)誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行調(diào)節(jié)，使之形成結(jié)構(gòu)松脆、顆粒狀胚性愈傷組織，獲得理想的胚性細(xì)胞系。通過研究，小麥愈傷組織誘導(dǎo)與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)有以下特點(diǎn)a.激素2，4-D是小麥愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)所必需的。
b.降低2，4-D濃度可使外軟內(nèi)硬的愈傷組織向顆粒型方向轉(zhuǎn)變，胚性增強(qiáng)。升高2，4-D濃度(2-8mg/L范圍)可使結(jié)構(gòu)緊密、生長(zhǎng)緩慢的愈傷組織生長(zhǎng)加快。
c.培養(yǎng)基中附加低濃度細(xì)胞分裂素可使愈傷組織向顆粒型方面發(fā)展。
d.含較低NH4+水平的培養(yǎng)基可明顯抑制愈傷組織的過旺生長(zhǎng)。
e.在培養(yǎng)基中增加KCL(1000-2000mg/l)可增加愈傷組織活力。
f.在培養(yǎng)基中附加水解酶蛋白、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸等可以改善愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)。
g.用葡萄糖做碳源繼代愈傷組織比用蔗糖效果好。
誘導(dǎo)出的愈傷組織通過幾次調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的繼代培養(yǎng)，逐漸形成顆粒狀愈傷組織。在繼代培養(yǎng)過程中應(yīng)注意挑選那些顆粒特點(diǎn)明顯，松脆型的愈傷組織?；ㄋ幷T導(dǎo)的愈傷組織，開始就有顆粒特點(diǎn)，2-3個(gè)月就可以建立起胚性細(xì)胞系。在實(shí)際轉(zhuǎn)基因研究中，主要用花藥和幼胚愈傷組織作為轉(zhuǎn)化的供試材料。
挑取繼代3-5次，分散性好的顆粒胚性愈傷組織進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，建立了“石4185”、“河農(nóng)859”等的胚性細(xì)胞懸浮系。經(jīng)過多種培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得了主要小麥品種的胚性無性系，轉(zhuǎn)化后保持了較高的再生頻率。
(4)胚性愈傷組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化；利用基因槍法轉(zhuǎn)化小麥細(xì)胞。轟擊前4小時(shí)將愈傷組織接種在高滲培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理。高滲培養(yǎng)基為在繼代培養(yǎng)基中，分別加入甘露醇0.4mol/L、山梨醇0.4mol/L、甘露醇0.2mol/L+山梨醇0.2mol/L。
取25μl鎢粉載體于Eppendorf管中，加入5μl質(zhì)粒DNA(1μg/μl)，振蕩混勻后加入25μl CaCl2(2.5mol/L)，振蕩，然后加入10μl亞精胺，離心去小清。用70％的乙醇80μl沉淀DNA，離心去小清后，重懸于15μl無水乙醇中備用。參照PDS1000/He型基因槍(Bio-Rad)說明對(duì)愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行轟擊，每培養(yǎng)皿2次，氦氣壓力在1200Psi左右。
(5)轉(zhuǎn)化后的愈傷組織細(xì)胞的培養(yǎng)與再生基因槍轟擊后的細(xì)胞16小時(shí)后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上，恢復(fù)培養(yǎng)7天，取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的愈傷組織轉(zhuǎn)到含有除草劑Bialaphos的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分化培養(yǎng)基為MS+KT2.0mg/L+NAA0.1mg/L，MS+ZT2.0mg/L+NAA0.1mg/L。
轉(zhuǎn)化前愈傷組織的高滲處理對(duì)再生率有明顯影響，其中又以山梨醇0.2mol/L+甘露醇0.2mol/L的效果好。但由于高滲培養(yǎng)會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此，轟擊后16小時(shí)必須將愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+2，4-D2.0mg/L的繼代培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)。
經(jīng)基因槍轉(zhuǎn)化后的小麥愈傷組織或細(xì)胞在含有8.0mg/L除草劑Bialaphos的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，少量愈傷組織細(xì)胞可以繼續(xù)生長(zhǎng)，并再生出完整植株。將再生植株植入土壤，待植株長(zhǎng)至20-30cm時(shí)，用1％Basta除草劑進(jìn)行葉片涂抹，一周后，處理過的未轉(zhuǎn)化植株的葉片變黃死亡，而轉(zhuǎn)化后的植株表現(xiàn)對(duì)Basta的抗性。具有抗性的植株可以視為轉(zhuǎn)基因植株。通過篩選得到了百余株(lines)小麥轉(zhuǎn)基因株系。
(6)轉(zhuǎn)基因植株的PCR和Southern雜交分析為了測(cè)定抗Basta小麥轉(zhuǎn)基因植株是否含有整合的GNA基因片段，對(duì)葉片染色體DNA進(jìn)行了PCR和Southern雜交分析。
根據(jù)GNA基因的編碼序列設(shè)計(jì)引物引物1TCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCCTG引物2GAATTCCAACAAGTCCGGTGTGAGTTCCAG
結(jié)果擴(kuò)增得到了372bp的GNA基因片斷，用在32p標(biāo)記的0.5kbGNA cDNA探針雜交，結(jié)果92％的轉(zhuǎn)化植株為雜交陽性證實(shí)小麥轉(zhuǎn)基因植株中整合了DNA基因。
(7)轉(zhuǎn)基因植株抗蟲試驗(yàn)取轉(zhuǎn)化植株的新鮮葉片分別放入試管中，每試管接入蚜蟲若蟲10頭，25溫室培養(yǎng)。每隔半天取來源于同一編號(hào)植株的葉片將之替換，使試管內(nèi)葉片保持新鮮，做3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)3-5天后，在成蟲尚未繁殖之前，統(tǒng)計(jì)試管內(nèi)蟲體死亡的個(gè)數(shù)。也可以將25頭麥蚜成蟲培養(yǎng)在轉(zhuǎn)基因小麥植株上，培養(yǎng)25-30天后，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株上的麥蚜數(shù)量，用此檢測(cè)麥蚜在轉(zhuǎn)基因植株上繁殖系數(shù)的差異。
以下結(jié)合實(shí)施例敘述本技術(shù)包括小麥胚性愈傷組織和懸浮細(xì)胞系的建立技術(shù)、小麥細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)及抗蟲轉(zhuǎn)基因小麥的研制技術(shù)，抗蚜蟲轉(zhuǎn)基因小麥高效轉(zhuǎn)化再生體系的建立方法如下(1)供試材料為冬小麥(Tritum aestivum)栽培品種“石4185”，麥長(zhǎng)管蚜(Macrosiphum avevae)采集于田間。
(2)表達(dá)載體構(gòu)建用Sal I和Sac II內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，從pIP840質(zhì)粒上分離出GNA基因片段(505bp)，插入到pBY505載體的Sma位點(diǎn)上，構(gòu)建成質(zhì)粒pBC98。GNA基因位于Act-1啟動(dòng)子的調(diào)控之下，選擇基因?yàn)閎ar基因。構(gòu)建的pBC98質(zhì)粒全長(zhǎng)7.6Kb，宿主菌為E.Coli DH5a。
(3)小麥胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)取小麥幼穗，滅菌后，用無菌鑷子剝出幼穗，切成0.5cm長(zhǎng)度的小段，或取二核期小孢子(花藥)、剝離受粉15天的幼胚接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25±1暗培養(yǎng)25天。誘導(dǎo)出的愈傷組織4周繼代一次。
基因型和培養(yǎng)基是影響小麥花藥、幼胚和幼穗培養(yǎng)效果的兩個(gè)重要因素。我們選取了67個(gè)雜交組合和5個(gè)當(dāng)前推廣品種，主要利用C17為基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率多為10％，可達(dá)96.6％。綠苗分化率為35％。
對(duì)“石4185”供試材料均有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)80％以上，綠苗分化率為75％，2，4-D是誘導(dǎo)愈傷組織所必需的。
(4)胚性愈傷組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化；利用基因槍法轉(zhuǎn)化小麥細(xì)胞。轟擊前4小時(shí)將愈傷組織接種在高滲培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理。高滲培養(yǎng)基為在繼代培養(yǎng)基中，分別加入甘露醇0.4mol/L、山梨醇0.4mol/L、甘露醇0.2mol/L+山梨醇0.2mol/L。
取25μl鎢粉載體于Eppendorf管中，加入5μl質(zhì)粒DNA(1μg/μl)，振蕩混勻后加入25μl CaCl2(2.5mol/L)，振蕩，然后加入10μl亞精胺，離心去小清。用70％的乙醇80μl沉淀DNA，離心去小清后，重懸于15μl無水乙醇中備用。參照PDS1000/He型基因槍(Bio-Rad)說明對(duì)愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行轟擊，每培養(yǎng)皿2次，氦氣壓力在1200Psi左右。
(5)轉(zhuǎn)化后的愈傷組織細(xì)胞的培養(yǎng)與再生基因槍轟擊后的細(xì)胞16小時(shí)后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上，恢復(fù)培養(yǎng)7天，取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的愈傷組織轉(zhuǎn)到含有除草劑Bialaphos的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分化培養(yǎng)基為MS+KT2.0mg/L+NAA0.1mg/L，MS+ZT2.0mg/L+NAA0.1mg/L。
轉(zhuǎn)化前愈傷組織的高滲處理對(duì)再生率有明顯影響，其中又以山梨醇0.2mol/L+甘露醇0.2mol/L的效果好。但由于高滲培養(yǎng)會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此，轟擊后16小時(shí)必須將愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+2，4-D2.0mg/L的繼代培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)。
(6)轉(zhuǎn)基因植株的PCR和Southern雜交分析為了測(cè)定抗Basta小麥轉(zhuǎn)基因植株是否含有整合的GNA基因片段，對(duì)葉片染色體DNA進(jìn)行了PCR和Southern雜交分析。
根據(jù)GNA基因的編碼序列設(shè)計(jì)引物引物1TCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCCTG
引物2GAATTCCAACAAGTCCGGTGTGAGTTCCAG結(jié)果擴(kuò)增得到了372bp的GNA基因片斷，用在32p標(biāo)記的0.5kbGNA cDNA探針雜交，結(jié)果92％的轉(zhuǎn)化植株為雜交陽性證實(shí)小麥轉(zhuǎn)基因植株中整合了DNA基因。
(7)轉(zhuǎn)基因植株抗蟲試驗(yàn)取轉(zhuǎn)化植株的新鮮葉片分別放入試管中，每試管接入蚜蟲若蟲10頭，25溫室培養(yǎng)。每隔半天取來源于同一編號(hào)植株的葉片將之替換，使試管內(nèi)葉片保持新鮮，做3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)3-5天后，在成蟲尚未繁殖之前，統(tǒng)計(jì)試管內(nèi)蟲體死亡的個(gè)數(shù)。也可以將25頭麥蚜成蟲培養(yǎng)在轉(zhuǎn)基因小麥植株上，培養(yǎng)25-30天后，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株上的麥蚜數(shù)量，用此檢測(cè)麥蚜在轉(zhuǎn)基因植株上繁殖系數(shù)的差異。
部分試驗(yàn)結(jié)果見表。
小麥轉(zhuǎn)基因植株田間抗蟲試驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)基因植株麥蚜數(shù)量降低率轉(zhuǎn)基因植株麥蚜數(shù)量 降低率編號(hào) (頭) (％)編號(hào) (頭) (％)N859-04 38.9 77.97 S4185-67 65.6 60.81N859-14 76.1 56.91 S4185-78 61.3 63.38N859-21 79.3 55.10 S4185-83 34.6 79.33N859-30 69.8 60.48 S4185-104 70.1 58.12S4185-3756.3 66.37 S4185-112 28.5 82.97S4185-3829.7 82.25 H326-128 43.6 76.06S4185-4231.6 81.12 H326-132 41.5 77.21S4185-5245.4 72.88 H326-138 71.0 61.01S4185-5842.9 74.37注N859-CK植株上的麥蚜數(shù)量為176.6頭；S4185-CK植株上的麥蚜數(shù)量為167.4頭；H326-CK植株上的麥蚜數(shù)量為182.1頭。
權(quán)利要求
1.一種抗蚜蟲轉(zhuǎn)基因小麥高效轉(zhuǎn)化再生體系的建立技術(shù)，其特征是包括小麥胚性愈傷組織和懸浮細(xì)胞系的建立技術(shù)、小麥細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)及抗蟲轉(zhuǎn)基因小麥的研制技術(shù)(1)供試材料為小麥栽培品種“石4185”、“河農(nóng)859”、“河農(nóng)326”等，麥長(zhǎng)管蚜采集于田間；(2)表達(dá)載體構(gòu)建用Sal I和Sac II內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，從pIP840質(zhì)粒上分離出GNA基因片段(505bp)，插入到pBY505載體的Sma位點(diǎn)上，構(gòu)建成質(zhì)粒pBC98，GNA基因位于Act-1啟動(dòng)子的調(diào)控之下，選擇基因?yàn)閎ar基因構(gòu)建的pBC98質(zhì)粒全長(zhǎng)7.6Kb，宿主菌為E.Coli DH5a；(3)小麥胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)取小麥幼穗，用無菌鑷子剝出幼穗，切成0.3-0.5cm長(zhǎng)度的小段，或取二核期小孢子(花藥)、剝離受粉10-15天的幼胚接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25±1暗培養(yǎng)20-25天，誘導(dǎo)出的愈傷組織3-5周繼代一次；(4)胚性愈傷組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化利用基因槍法轉(zhuǎn)化小麥細(xì)胞，轟擊前4小時(shí)將愈傷組織接種在高滲培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理；(5)轉(zhuǎn)化后的愈傷組織細(xì)胞的培養(yǎng)與再生基因槍轟擊后的細(xì)胞16小時(shí)后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上，恢復(fù)培養(yǎng)7天，取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的愈傷組織轉(zhuǎn)到含有除草劑的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(6)轉(zhuǎn)基因植株的PCR和Southern雜交分析為了測(cè)定抗小麥轉(zhuǎn)基因植株是否含有整合的GNA基因片段，對(duì)葉片染色體DNA進(jìn)行了PCR和Southern雜交分析；(7)轉(zhuǎn)基因植株抗蟲試驗(yàn)將轉(zhuǎn)化植株的新鮮葉片分別放入試管中，每試管接入蚜蟲若蟲10頭，25℃溫室培養(yǎng)，每隔半天取來源于同一編號(hào)植株的葉片將之替換，使試管內(nèi)葉片保持新鮮，做3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)3-5天后，在成蟲尚未繁殖之前，統(tǒng)計(jì)試管內(nèi)蟲體死亡的個(gè)數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗蚜蟲轉(zhuǎn)基因小麥高效轉(zhuǎn)化再生體系的建立技術(shù)，其特征是轉(zhuǎn)基因植株抗蟲實(shí)驗(yàn)的方法為將25頭麥蚜成蟲培養(yǎng)在轉(zhuǎn)基因小麥植株上，培養(yǎng)25-30天后，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株上的麥蚜數(shù)量，用此檢測(cè)麥蚜在轉(zhuǎn)基因植株上繁殖系數(shù)的差異。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗蚜蟲轉(zhuǎn)基因小麥高效轉(zhuǎn)化再生體系的建立技術(shù)，包括小麥胚性愈傷組織和懸浮細(xì)胞系的建立技術(shù)、小麥細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)及抗蟲轉(zhuǎn)基因小麥的研制技術(shù)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1415753SQ0215379
公開日2003年5月7日 申請(qǐng)日期2002年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月6日
發(fā)明者朱寶成, 楊學(xué)舉, 梁玉玲, 韓繼剛, 溫樹敏, 曲占良, 郎明林, 趙建軍, 王建輝, 燕飛, 薛慶林, 陳榮敏, 谷維娜, 杜俊嶺 申請(qǐng)人:河北大學(xué)