專利名稱：納米微粒與親和素標記探針及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因檢測技術，更具體地說，涉及納米或膠體微粒與親和素復合物標記探針及其制備方法，以及該探針聯(lián)合銀增強/金增強的檢測DNA的方法。
基因檢測一般采用直接測序或雜交檢測。雜交檢測有放射法、酶標法、化學發(fā)光標記法等。放射法靈敏度高，但因其對環(huán)境有污染，正逐漸被非放射法所取代。酶標法由于反應過程復雜，酶催化底物反應過快，顯色區(qū)域不集中，限制了它的使用，特別是不適合生物芯片領域的應用。熒光檢測存在著過程復雜、檢測儀器昂貴、操作人員需經培訓，從而難于推廣和應用等缺點。
化學發(fā)光標記法、普通銀染法及一些其它的標記方法則由于靈敏度較低而使其應用受到很大限制。迄今，比較成熟的基因芯片檢測方法是激光掃描共聚焦顯微鏡法，但其程序復雜，檢測設備昂貴，難于推廣和應用。
中國專利CN1339609A公開了一種納米微粒標記的基因探針及其在基因檢測中的應用，該技術由于制備獲得的鈉米顆粒不穩(wěn)定，易聚集等原因，存在著制作成本高、穩(wěn)定性差以及使用不便的缺陷。
目前，某些生物分子與其他分子間特定的結合能力已被醫(yī)藥、生物技術人員廣泛應用于不同的診斷和篩選芯片。當一種生物分子具有與另一種生物分子的特異性結合力時，這兩個分子就能形成有效的配體-受體連接，如發(fā)生于親和素與小分子生物素間的非共價結合。這種生物素和親和素之間的作用被廣泛的用于DNA、RNA和蛋白的定量和純化。這些技術被應用于細胞、組織中抗原的定位、免疫檢測、DNA雜交技術。但是，由于納米顆粒與DNA間的連接問題及其保存問題還沒有根本解決，因此其推廣使用還存在實際的困難。如CN1339609A專利所公開的技術。
本發(fā)明的技術構思是這樣的鏈霉親和素是一種四聚體蛋白，其每個單體通過親水鍵和范德華力與一個生物素結合后兩者間形成的鏈穩(wěn)定且難斷裂。因此，利用生物素和鏈霉親和素間的親和力，用一個生物素標記的探針與樣品反應，再利用標記好的抗生物素蛋白或鏈霉親和素的檢測探針反應，本發(fā)明將表面合成化學、生物化學及生物化學技術有機結合起來制備親和素/鏈霉親和素/抗生物素-納米/膠體微粒復合物，利用生物素和親和素間的形成的較穩(wěn)定的鍵，以解決納米顆粒與DNA間的連接問題。提供銀粒子/金粒子著色進行微量DNA檢測與信號放大的最新工藝，解決目視法檢測的關鍵問題。根據T.Andrew Taton等在Scanmetric DNAArray Detection with nanoparticle Probes(science，289，2000)中提到采用納米微粒-探針復合物時，DNA的特異性結合率與單堿基錯配率的比值在一個較窄溫度范圍內發(fā)生巨大變化。因此，可利用DNA-生物素-親和素/鏈霉親和素/抗生物素-納米/膠體微粒復合物特有的物理性質用于突變體的檢測。
本發(fā)明的技術方案本發(fā)明的納米微粒與親和素標記探針為一種復合物，由納米或膠體微粒與親和素、鏈霉親和素或抗生物素構成，親和素、鏈霉親和素或抗生物素通過CNHO基團與納米或膠體微粒相接合。
所述及的納米或膠體微粒的化學組分包括金、銀、鐵等，其粒徑為5-160nm。
本發(fā)明的基因探針的制備方法包括如下步驟(1)膠體金或納米粒子的制備膠體金或納米粒子的制備可采用常規(guī)的氯金酸溶液煮沸還原法，通過添加還原劑和攪拌速度來控制粒徑，也可采取其他方法來制備。如可采用CNI1339609A專利所披露的方法，該技術為常規(guī)的技術，本發(fā)明不再贅述。
(2)復合物的制備復合物的自組裝與封閉只有嚴格控制反應條件，才能使親和素/鏈霉親和素/抗生物素牢牢地結合到納米金或納米粒子上，并使用牛血清白蛋白分閉多余的活性位點。
用K2CO3(碳酸鉀)或Tris堿(三羥甲基氨基甲烷堿)調節(jié)膠體金或納米粒子溶液的pH至選定值6-8，離心去除沉淀物，將親和素、鏈霉親和素或抗生物素加入到膠體金或納米粒子溶液中，親和素/鏈霉親和素/抗生物素與膠體金或納米粒子的重量比為親和素/鏈霉親和素/抗生物素∶膠體金或納米粒子＝1∶1～1∶3；室溫放置10-40分鐘后加入牛血清白蛋白分閉多余的活性位點，再室溫放置2～6小時后，16000～25000/分鐘轉離心20～60分鐘，取上清，加入含PBS(磷酸緩沖液)和穩(wěn)定劑如甘油的溶液重懸，可重復數次，以除去不穩(wěn)定的納米金/膠體金、游離的蛋白質等雜質，將其加入濃度為0.1～0.2M的氯化鈉，20～60mM磷酸緩沖液，0.1～0.5wt％的BSA(牛血清白蛋白)，0.05～0.15wt％的疊氮鈉的溶液體系中，該體系的pH值為6～8，即獲得本發(fā)明的納米微粒與親和素標記探針，4℃保存。
本發(fā)明的納米微粒與親和素標記探針可用于DNA突變及非突變的檢測，檢測方法包括如下步驟(1)含biotin(生物素)標記的寡核苷酸，與固定在固相載體上檢測探針進行雜交。該步驟為常規(guī)步驟，本發(fā)明不再贅述。
(2)復合物與雜交物反應①對于檢測Tm值相差較小的突變體，雜交后用PBS，0.1％Tween-20洗滌后加入用1×PBS(磷酸緩沖液)，0.1～0.5wt％BSA(牛血清白蛋白)溶液稀釋的Avidin/streptavidin-Au的復合物，室溫溫浴0.5～1小時后用高嚴緊度的洗液(如SSC或SSPE溶液)在30～60的溫度下洗脫。再用PBS洗滌后，加入銀增強劑或金增強劑來增強檢測信號，最后用蒸餾水多次洗滌，自然干燥。
②對于其他雜交檢測，則可在雜交后直接洗脫，再與復合物溫浴，PBS洗滌后，加入銀增強劑或金增強劑來增強檢測信號，(3)結果判定凡是著色很深、呈斑點，與背景反差強者判為強陽性；著色較深，與背景反差強者判為陽性；著色較淡，與背景反差小者判為弱陽性；不著色者判為陰性。
本發(fā)明提供的檢測方法有如下優(yōu)點①靈敏度高、特異性好，簡便、快速、廉價。
②可進行高通量、低成本的篩選，完全以手工完成而不用昂貴的液體操作機械手?？蓪ν蛔凅w進行檢測，只需目視判別結果，無需利用昂貴的檢測設備。
③既可用于單基因檢測，也可用于多基因集成檢測，如多種傳染性微生物病原體的臨床檢測、癌癥早期診斷、遺傳病產前診斷與在體外常規(guī)體檢，基因表達調控研究，特征基因表達譜檢測，基因文庫篩選等，尤其適用于低集成度基因芯片檢測，有很好的臨床使用價值。
最后加入終濃度為0.15M NaCl，20mM磷酸緩沖液，0.1％BSA，0.05％疊氮鈉的溶液體系中，4℃保存。如

圖1所示。
實施例2結核分枝桿菌對利福平抗藥性檢測將固定好的固相載體置于雜交管中，加入含堿變性后的PCR擴增產物的6×SSPE/0.5％SDS雜交液45～60℃雜交2小時。將雜交后的固相載體取出，用1×PBS、吐溫-20室溫洗滌10分鐘后置于用1×PBS/0.1％BSA溶液200倍稀釋的實施例1的溶液中，室溫溫浴1-2小時。再將固相載體置于雜交管中，用1×SSPE洗脫液50-65℃洗脫10-20分鐘。
取出固相載體用1×PBS洗滌3次，每次5分鐘，加入配置好的銀增強劑(現配的硝酸銀和還原劑構成的混合物)，反應10分鐘，最后用蒸餾水多次洗滌后自然干燥。結果判定凡是著色很深、呈斑點，與背景反差強者判為強陽性；著色較深，與背景反差強者判為陽性；著色較淡，與背景反差小者判為弱陽性；不著色者判為陰性。
權利要求
1.一種納米微粒與親和素標記探針，其特征在于由納米或膠體微粒與親和素、鏈霉親和素或抗生物素構成，親和素、鏈霉親和素或抗生物素通過CNHO基團與納米或膠體微粒相接合。
2.根據權利要求1所述的探針，其特征在于所述及的納米或膠體微粒的化學組分包括金、銀或鐵。
3.根據權利要求2所述的探針，其特征在于納米或膠體微粒的粒徑為5-160nm。
4.根據權利要求1、2或3所述的探針的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)膠體金或納米粒子的制備；(2)復合物的制備用K2CO3或三羥甲基氨基甲烷堿調節(jié)膠體金或納米粒子溶液的pH至選定值6-8，離心去除沉淀物，將親和素、鏈霉親和素或抗生物素加入到膠體金或納米粒子溶液中，親和素/鏈霉親和素/抗生物素與膠體金或納米粒子的重量比為親和素/鏈霉親和素/抗生物素∶膠體金或納米粒子＝1∶1～1∶3；加入牛血清白蛋白分閉多余的活性位點，再室溫靜置2～6小時后，16000～25000/分鐘轉離心分離20～60分鐘，取上清，加入含磷酸緩沖液和穩(wěn)定劑溶液重懸，除去雜質，將其加入濃度為0.1～0.2M的氯化鈉，20～60mM磷酸緩沖液，0.1～0.5wt％的牛血清白蛋白，0.05～0.15wt％的疊氮鈉的溶液體系中，該體系的pH值為6～8，即獲得本發(fā)明的納米微粒與親和素標記探針。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，室溫放置10-40分鐘后加入牛血清白蛋白分閉多余的活性位點。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，加入牛血清白蛋白分閉多余的活性位點，再室溫靜置2～6小時后，16000～25000轉/分鐘離心分離20～60分鐘。
7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，加入牛血清白蛋白分閉多余的活性位點，再室溫靜置2～6小時后，16000～25000轉/分鐘離心分離20～60分鐘。
8.根據權利要求1、2或3所述的探針的應用，其特征在于用于DNA突變及非突變的檢測。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于檢測方法包括如下步驟(1)含biotin(生物素)標記的寡核苷酸，與固定在固相載體上檢測探針進行雜交；(2)復合物與雜交物反應①對于檢測Tm值相差較小的突變體，雜交后用PBS，0.1％Tween-20洗滌后加入用1×PBS(磷酸緩沖液)，0.1～0.5wt％BSA(牛血清白蛋白)溶液將Avidin/streptavidin-Au的復合物稀釋至工作濃度(以納米金上結合的streptavidin量計為0.1ng/ml-20ng/ml)，室溫溫浴0.5～2小時后用高嚴緊度的洗液在室溫～60的溫度下洗脫，再用PBS洗滌后，加入銀增強劑或金增強劑來增強檢測信號，最后用蒸餾水多次洗滌，自然干燥；②對于其他雜交檢測，則可在雜交后直接洗脫，再與復合物溫浴，PBS洗滌后，加入銀增強劑或金增強劑來增強檢測信號；(3)結果判定凡是著色很深、呈斑點，與背景反差強者判為強陽性；著色較深，與背景反差強者判為陽性；著色較淡，與背景反差小者判為弱陽性；不著色者判為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種納米微粒與親和素標記探針及其制備方法和應用。該探針由納米或膠體微粒與親和素、鏈霉親和素或抗生物素構成。本發(fā)明的基因探針的制備方法包括(1)膠體金或納米粒子的制備和(2)復合物的制備。本發(fā)明的探針可用于DNA的突變及非突變檢測，檢測時加入銀增強劑或金增強劑來增強檢測信號。本發(fā)明的方法靈敏度高、特異性好，簡便、快速、廉價，可進行高通量、低成本的篩選，用于單基因檢測或多基因集成檢測，如多種傳染性微生物病原體的臨床檢測、癌癥早期診斷、遺傳病產前診斷與在體外常規(guī)體檢，基因表達調控研究，特征基因表達譜檢測，基因文庫篩選等，尤其適用于低集成度基因芯片檢測，有很好的臨床使用價值。
文檔編號C12Q1/68GK1415759SQ02137418
公開日2003年5月7日 申請日期2002年10月14日 優(yōu)先權日2002年10月14日
發(fā)明者蘇蓓, 胡志能, 費西, 金維榮, 趙國屏 申請人:上海華冠生物芯片有限公司