專利名稱：Hiv－1蛋白酶elisa檢測(cè)方法及用于多靶位篩選hiv－1抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類免疫缺陷病毒復(fù)制酶ELISA檢測(cè)方法及其在HIV-1抑制劑篩選中的應(yīng)用。技術(shù)背景
艾滋病自1981年發(fā)現(xiàn)以來(lái)在全世界傳播，死亡率高，成為現(xiàn)代瘟疫。我國(guó)自1985年發(fā)現(xiàn)第1例病人，至今已有85萬(wàn)感染者。每年以30％速度增長(zhǎng)，嚴(yán)重危害人類健康。尋找防治藥物以扼制流行是刻不容緩的任務(wù)。免疫缺陷病毒(HIV)是艾滋病的病原，其基因結(jié)構(gòu)，復(fù)制周期和感染機(jī)制等已被闡明。HIV-pol基因表達(dá)的3種復(fù)制酶HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV RT)，蛋白酶(HIV PR)和整合酶(HIV IN)是病毒復(fù)制繁殖的關(guān)鍵酶。
以HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶復(fù)制酶為靶位已成功地發(fā)展了10種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和6種蛋白酶抑制劑作為治療艾滋病的藥物。HIV整合酶的抑制劑也在臨床試驗(yàn)中，目前尚未批準(zhǔn)成藥物。由于這些藥物作用靶位和結(jié)構(gòu)類型單一，雖能抑制病毒復(fù)制，但病毒極易產(chǎn)生耐藥性和交叉耐藥性。聯(lián)合應(yīng)用現(xiàn)有地兩種酶抑制劑或用其復(fù)方進(jìn)行高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)，可提高療效，控制病情發(fā)展，延長(zhǎng)生命，但不能清除病毒，病人仍不能免于死亡，且價(jià)格昂貴，毒副作用大，難于普及推廣。
聯(lián)合應(yīng)用HIV的3種復(fù)制酶的篩選方法，進(jìn)行高通量篩選，將為尋找多靶位作用于HIV復(fù)制酶的新型抗艾滋病病毒藥物開辟道路。發(fā)明要點(diǎn)
本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用HIV的3種復(fù)制酶(即HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，HIV-1整合酶，HIV-1蛋白酶)的篩選方法，進(jìn)行高通量篩選HIV-1抑制劑。除現(xiàn)有的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶3H摻入法和新引進(jìn)建立的整合酶ELISA檢測(cè)法可以適用外，現(xiàn)用的HIV蛋白酶抑制制劑高壓液相(HPLC)檢測(cè)方法技術(shù)復(fù)雜，周期長(zhǎng)。最近國(guó)外所用的熒光檢測(cè)法需要熒光檢測(cè)儀特殊設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室不具備。為此本發(fā)明建立我國(guó)HIV-1病毒株的蛋白酶ELISA檢測(cè)法，以用于高通量篩選HIV-1抑制劑。
本發(fā)明的重點(diǎn)在于首次采用我國(guó)分離的HIV-1C/B型重組病毒的pol基因，以pMAL-c2載體構(gòu)建我國(guó)HIV-1蛋白酶重組質(zhì)粒pMAL-c2-PR，表達(dá)可溶性HIV-蛋白酶，一步純化，建立ELISA快速檢測(cè)方法。
本發(fā)明的另一種點(diǎn)在于首次聯(lián)合應(yīng)用我國(guó)HIV蛋白酶ELISA檢測(cè)方法與現(xiàn)有的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶3H摻入法和HIV-1整合酶ELISA法進(jìn)行3種HIV-1復(fù)制酶多靶位篩選，可篩出作用不同的單一或多靶位的HIV-1抑制劑，為發(fā)展多靶位作用的抗HIV新藥奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的又一重點(diǎn)在于聯(lián)合HIV-1三種復(fù)制酶檢測(cè)方法篩選HIV-1復(fù)制抑制劑發(fā)現(xiàn)對(duì)HIV-1三種復(fù)制酶有廣譜抑制作用的化合物9833、黃芩甙元鈉、丹參提取物CEH、CEHL和中藥提取物ELB1，有進(jìn)一步開發(fā)價(jià)值。
本發(fā)明的再一重點(diǎn)在于應(yīng)用HIV-1三種復(fù)制酶檢測(cè)方法，可以研究有效化合物的構(gòu)效關(guān)系，示蹤中約分離提取的單一成分，探索藥物作用機(jī)制以及測(cè)定動(dòng)物體內(nèi)約物血清動(dòng)態(tài)。技術(shù)方案
本發(fā)明的技術(shù)方案可通過(guò)以下實(shí)施例加以說(shuō)明，但不以此限制本發(fā)明。實(shí)施例1我國(guó)C/B重組HIV-1病毒蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒HIV-1pMAL-c2-PR的構(gòu)建
質(zhì)粒pC54-pol-T(HIV-1 CN54C/B重組毒株pol全長(zhǎng)基因插入Teasy載體)由我國(guó)衛(wèi)生部艾滋病預(yù)防與控制中心邵一鳴教授惠增。載體pMALTM-c2購(gòu)自Biolabs公司。HIV-1 CN54毒株是從我國(guó)新疆HIV感染者體內(nèi)分離的HIV-1C/B型重組株，它在Genbank中的序列號(hào)及名稱為AF286226，HIV-1，97CN001。引物設(shè)計(jì)因考慮利用pMAL-c2表達(dá)載體的多克隆酶切位點(diǎn)EcoR I和BamH I位點(diǎn)，結(jié)合HIV-1 CN54蛋白酶基因序列設(shè)計(jì)引物為上游引物(Primer 3)5′-ACT GAA TTC CCT CAA ATC ACT CTT-3′下游引物(Primer 2)5′-GCC GGA TCC TTA AAA ATT TAA AGT GCA ACC AAG-3′重組HIV-1蛋白酶表達(dá)載體pMAL-c2-PR的克隆(圖1)
1)PCR擴(kuò)增HIV-PR片段并純化以含有HIV-1 pol基因的質(zhì)粒pC54-pol-T為模板，用Primer2和Primer3為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，同時(shí)做空白對(duì)照，DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，與DNA分子對(duì)照表明，可擴(kuò)增出目的片段(約300bp)(圖2)。
2)EcoR I和BamH I雙酶切質(zhì)粒pMAL-c2及PCR產(chǎn)物，并純化。
3)連接。
4)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
5)篩選及鑒定陽(yáng)性克隆
a)監(jiān)白斑篩選，挑取白斑進(jìn)行下一步驗(yàn)證。
b)限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定用EcoR I和BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察可以看見pMAL-c2-PR可切出兩條帶分別與pMAL-c2空載體(6.6kb)及蛋白酶基因(297bp)大小完全一致，說(shuō)明此pMAL-c2-PR載體有外源蛋白酶基因的插入(圖3)。
c)PCR鑒定分別以pC54-pol-T，pMAL-c2-PR為模板及Primer2和Primer3為物進(jìn)行PCR反應(yīng)，(同時(shí)設(shè)空白對(duì)照)，DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示兩種模板均可擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明pMAL-c2-PR載體有外源蛋白酶基因的插入(圖2)。
d)陽(yáng)性克隆的測(cè)序分析利用pMAL-c2的通用引物M13/PUC Sequencing Primer(-47)，在上海生工用ABI PRISM 377-96測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，利用DNASTAR分析軟件進(jìn)行分析，序列與在基因Bank中查到的HIV-1 CN54的蛋白酶基因完全一致(圖4)，說(shuō)明pMAL-c2-PR載體外源蛋白酶基因的插入正確。實(shí)施例2HIV-1蛋白酶的表達(dá)
1)、將pMAL-c2-PR轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落于LB+氨芐青霉素(Amp)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，次日1/100擴(kuò)增于1000ml LB+Amp培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A600為0.5-0.6時(shí)，加入終濃度為0.3mmol/L IPTG；
2)、37℃繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，5000×g離心20分鐘收集菌體，稱量菌體濕重，以g/ml的比例為1/10重懸于預(yù)冷的裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.2mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT)中；
3)、-20℃冷凍過(guò)夜，取出凍存的菌體于冰水浴中融化，超聲波破碎儀裂解細(xì)胞；
4)、9000×g離心30分鐘，收集上清，用裂解緩沖液1∶5稀釋。以1ml/min的流速上樣到Amylose樹脂柱；
5)、用含有10mmol/L麥芽糖的緩沖液洗脫，部分收集儀收集洗脫液，收集合并目的蛋白峰，對(duì)透析緩沖液(20mml/LMES pH6.0，40％甘油，1mmol/LDTT)透析過(guò)夜，濃縮蛋白。-70℃凍存；
6)、SDS-PAGE電泳驗(yàn)證蛋白酶的表達(dá)(圖5)，從圖中可見轉(zhuǎn)化了pMAL-c2-PR的菌體誘導(dǎo)后在分子量約53 000位置可見一明顯蛋白條帶，而且主要在可溶性胞質(zhì)部分，未誘導(dǎo)菌未見此蛋白的表達(dá)。對(duì)圖中第三條帶(表達(dá)的總蛋白)用gelpro凝膠分析軟件進(jìn)行分析(圖6)，第2峰為目的蛋白峰，占菌體含量的15.1％。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量對(duì)照測(cè)得該條帶的分子量大致為53 273，與計(jì)算所得的N端融合有MBP的HIV-1蛋白酶分子量符合。
7)、純化后的蛋白用Bradford法(考馬斯亮藍(lán)G-250染色法)定量蛋白質(zhì)，純化的HIV-1融合蛋白酶的濃度為0.15mmol/L，每升培養(yǎng)液最終可純化出34mgHIV-1融合蛋白酶。實(shí)施例3HIV-1蛋白酶ELISA檢測(cè)方法底物Ac-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Lys-biotin(分子量1558.13)為美聯(lián)(西安)
生物科技有限公司合成。
ELISA活性檢測(cè)方法
1)在96孔板中，每孔加入1μl 10×反應(yīng)緩沖液(0.5mol/L磷酸鈉緩沖液，2mol/L NaCl，10mmol/L EDTA，10mmol/L DTT)，1μl 860μmol/L的底物，1μl雙蒸餾水(DDW)或二甲基亞砜(DMSO)(根據(jù)所測(cè)藥物的溶劑情況選擇)或待測(cè)樣品，7μl HIV-1蛋白酶，同時(shí)設(shè)不加酶的空白對(duì)照，混勻，37℃反應(yīng)60分鐘；
2)每孔加入2倍體積的DMSO混勻，終止反應(yīng)，每孔取出4μl到一塊新板中，向每孔加入6μl碘乙酸鈉，混勻，37℃反應(yīng)45分鐘；
3)每孔加入5μl 2mg/ml的地高新-3-氧-甲羰基-ε-氨基己酸-N-羥基琥珀酸酯(Digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-ε-aminocaproic acid-N-hydroxy-succinimide ester，Dig-NHS)，混勻，37℃反應(yīng)50分鐘，標(biāo)記切割的蛋白氨基端；
4)每孔加入15μl 0.5mol/L的甘氨酸(pH8.5)混勻，37℃反應(yīng)60分鐘中斷標(biāo)記反應(yīng)；
5)從上述反應(yīng)混合液中取10μl加入鏈親和素標(biāo)記的96孔板中，同時(shí)加入90μl Buffer W(50mmol/L磷酸鈉緩沖液pH8.5，0.01％ NP 40)，混勻，室溫放置60分鐘，將底物結(jié)合到酶標(biāo)板上；
6)300μl Buffer W洗板一次，300μl TBS(25mmol/L Tris緩沖液，pH7.4)洗板一次，每孔加入100μl 1×阻斷劑，室溫放置50分鐘；
7)300μl TBS洗板3次，每孔加入100μl抗地高辛抗體Fab片段，室溫1hr；
8)300μl TBS洗板3次，每孔加入200μl顯色底物(6.7mmol/L pNPP，0.1mol/L NaHCO3pH9.5，2mmol/L MgCl2)；
9)顯色30分鐘后加入50μl 1N NaOH終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀405nm測(cè)A值。重組HIV-1蛋白酶活性的驗(yàn)證
為了確定表達(dá)的重組HIV-1蛋白酶是否具有同天然蛋白酶一致的活性，用經(jīng)典的HPLC方法檢測(cè)了重組酶的活性和動(dòng)力學(xué)。底物為合成的11肽，包含了HIV-1 P17-P24的切割所必須的位點(diǎn)，序列為Ac-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Lys-biotin，其中Tyr-Pro鍵為HIV-1蛋白酶特異性水解的肽鍵。11肽底物的保留時(shí)間約為13分鐘，被HIV-1蛋白酶切割成的2個(gè)小肽(6肽及5肽)可在HPLC上看見兩個(gè)新增的峰，保留時(shí)間分別約為8.9和10.5分鐘。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)或是酶量的增加，兩個(gè)產(chǎn)物峰的峰面積逐步增加，而底物峰的峰面積逐步減少，90分鐘內(nèi)產(chǎn)物的量與時(shí)間呈直線關(guān)系(圖7)。不同底物濃度時(shí)檢測(cè)酶活性做雙倒數(shù)圖(圖8)，Km值為0.114±0.034mmol/L，與文獻(xiàn)報(bào)道的Km值(0.05-7mmol/L)有一致性[Biochem Biophy Res Com 1989，159(2)，420-425；Biochemistry.1994，339351-9357]，說(shuō)明表達(dá)的重組HIV-1蛋白酶具有特異性切割底物的功能和正確的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，可用于酶活性以及抑制劑的研究。ELISA方法酶反應(yīng)時(shí)間曲線的測(cè)定
在不同的重組HIV-1蛋白酶濃度0，6，3，1.5μmol/L，不同反應(yīng)時(shí)間30，60，90，120分鐘時(shí)檢測(cè)底物的A405值，以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物的A405為縱坐標(biāo)做反應(yīng)時(shí)間曲線(圖9)，在60分鐘內(nèi)均呈現(xiàn)直線反應(yīng)，因此選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為60分鐘。ELISA方法的酶量反應(yīng)速度曲線
選擇反應(yīng)時(shí)間為60分鐘，以1g酶濃度為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物A405為縱坐標(biāo)，作圖(圖10)，酶濃度在3μmol/L以下與速度呈線性關(guān)系。ELISA方法檢測(cè)HIV-1蛋白酶活性的穩(wěn)定性重現(xiàn)性評(píng)價(jià)在最佳反應(yīng)條件時(shí)(50mmol/L PBS pH 6.4，0.2M NaCl，1mmol/L EDTA，1mM DTT，3μmol/L蛋白酶，37℃反應(yīng)60分鐘)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，同批實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次，平均P/N值為3.38±0.157，批內(nèi)變異系數(shù)為4.64％；不同的10批重復(fù)實(shí)驗(yàn)，平均P/N值為3.61±0.1998，批間變異系數(shù)為5.54％(表1)。說(shuō)明此方法結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可用于抑制劑的研究。
表1ELISA方法重現(xiàn)性穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
P/N平均標(biāo)準(zhǔn)差變異
P/N 系數(shù)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1
比值 (s) (CV％
0
(x))批內(nèi) 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3.3.38 0.1574.64In a lot 12 29 60 41 45 48 56 25 22 46批間 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3.3.61 0.1998 5.54Among 91 89 34 29 61 57 58 59 8 47the lotsELISA方法用于抑制劑研究的特異性
選用2個(gè)已知的的蛋白酶抑制劑Saquinavir和Indinavir為陽(yáng)性對(duì)照，以及HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑PFA，膜融合抑制劑T-20作為陰性對(duì)照，用ELISA方法檢測(cè)其活性，結(jié)果Saquinavir和Indinavir對(duì)HIV-1蛋白酶的IC50分別為1.869±0.24nmol/L和3.695±0.5nmol/L，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[Drugs，1996，51(5)701-712.]。而PFA和T-20均不能抑制蛋白酶，驗(yàn)證了ELISA方法檢測(cè)HIV-1蛋白酶活性的特異性。ELISA與HPLC方法對(duì)比，證明ELISA方法用于酶活性及抑制劑研究的可靠性ELISA方法與HPLC法測(cè)定HIV-1蛋白酶Km值的比較
在確定的最佳ELISA酶反應(yīng)條件下，3μmol/L蛋白酶，37℃反應(yīng)60分鐘，測(cè)定不同底物濃度下產(chǎn)物生成速度，作雙倒數(shù)圖，直線回歸(圖11)。Km值為0.0819±0.04mmol/L，與HPLC方法的Km值(0.114±0.034mmol/L)有可比性。說(shuō)明ELISA方法同HJPLC方法一樣完全能正確反應(yīng)酶的動(dòng)力學(xué)。
比較ELISA方法和HPLC方法檢測(cè)已知HIV-1蛋白酶抑制劑Saquinavir和Indinavir的符合性
分別用ELISA和HPLC方法檢測(cè)Saquinavir和Indinavir對(duì)HIV-1蛋白酶的抑制作用，ELISA方法測(cè)得的IC50與HPLC方法測(cè)得的IC50的比較基本平行(表2)。
表2saquinavir和indinavir對(duì)HIV-1 PR活性的ELISA和HPLC方法比較實(shí)施例4三種HIV-1復(fù)制酶活性檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用HIV-1蛋白酶PR的制備和藥物抑制試驗(yàn)(見本發(fā)明第一部分)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶RT約物抑制實(shí)驗(yàn)引進(jìn)HIV-1 RTp66/51質(zhì)粒(美國(guó)哈佛大學(xué)R.T.D’Aguila惠贈(zèng))，本所在大腸桿菌中表達(dá)，純化。用3H摻入法測(cè)定酶活性(A.A.C.，1988，5，684；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，1990，12(6)，391-395。)HIV-1整合酶IN的制備和約物抑制試驗(yàn)
引進(jìn)HIV-1整合酶質(zhì)粒(美國(guó)NIH NIDDK的Robert Craigie博士贈(zèng)送)。在大腸桿菌中表達(dá)，整合酶融合蛋白。經(jīng)鎳熬合柱親和層析純化后，建立ELISA檢測(cè)方法(1994，Nucleicacids Research，22(6)，1121-1122；2002，中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，16(2)，119。)。實(shí)施例5廣譜抑制三種HIV-1復(fù)制酶的物質(zhì)9833中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所王琳教授合成(圖12)，黃芩甙元鈉鹽中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所劉大寬付教授合成。丹參提取物CEH由美國(guó)Johns Hopkins大學(xué)黃周汝吉教授提供，CEHL本所新抗一室李寶
義脫色。貓眼草提取物ELB1本所李建農(nóng)提取。萘醌類化合物9833，黃芩甙元衍生物BCLE-Na及中約粗提物(CEH，CEHL，ELB1)對(duì)3種或2種復(fù)制酶有抑制活性，結(jié)果見表3。
表3.對(duì)HIV-1 RT，IN和PR有抑制活性的化合物，中藥成分及其衍生物有效物質(zhì)半數(shù)抑制濃度(IC50)
HIV-1 RT HIV-I IN HIV-1 PR9833 (mmol/L) 0.081±0.0088 0.0372±0.00928 0.0096±0.0019BCLE-Na(μg/ml) 31.39±8.49 4.18±0.59 16.72±3.36CEH(μg/ml) 6.34±6.3010.38±0.71 19.00±4.21CEHL (μg/ml) 2.23±0.787.45±0.15 4.29±2.21ELB1 (μg/ml) 14.14±7.87 20.22±1.72實(shí)施例6化合物構(gòu)效關(guān)系的研究萘醌類化合物NQ-1對(duì)HIV-1整合酶活性低，結(jié)構(gòu)改變后，NQ-2新衍生物9833(圖12)對(duì)HIV-逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV-1-RT)，蛋白酶(HIV-1-PR)和整合酶(HIV-IN)三種酶的抑制作用均bi比其母體強(qiáng)，結(jié)果見表4-1。
表4-1 萘醌類化合物對(duì)HIV-1 RT，-1N和-PR的抑制活性化合物 半數(shù)抑制濃度(IC50mmol/L)
HIV-1 RT HIV-1IN HIV-1PRNQ-1 0.169±0.0087 ＞1.899 0.055±0.0064NQ-2 0.474±0.0028 0.0785±0.00045 0.048±0.00469833 0.081±0.0088 0.0372±0.00928 0.0096±0.0019黃酮類化合物的抑制作用
黃芩甙元(BCLE)及其衍生物黃芩甙元鈉鹽(BCLE-Na)，對(duì)HIV-1-IN的抑制作用較強(qiáng)，BCLE對(duì)HIV-1蛋白酶效果較差，但BCLE-Na對(duì)HIV-PR也有一定的抑制作用(表4-2)。
表4-2黃芩甙元及其衍生物對(duì)HIV-1 RT，-IN和-PR的活性實(shí)施例7示蹤中藥或生物藥物成分分離中約的提取分離
用HIV-1復(fù)制酶方法對(duì)中約提取分離物進(jìn)行示蹤測(cè)活，發(fā)現(xiàn)單參粗提物CEH和CEHL對(duì)三種復(fù)制酶均具有較強(qiáng)的抑制作用，丹參其它不同分離提取物對(duì)HIV-1三種復(fù)制酶有不同抑制活性(表5)。
表5中藥丹參不同提取分離物對(duì)HIV-1 RT，-IN和-PR的活性結(jié)果丹參提取物 IC50(μg/ml)
HIV-1 RT HIV-1 IN HIV-1 PRCEH 6.34±6.30 10.38±0.7119.0±4.20CEHL 2.23±0.78 7.45±0.15 4.29±2.21AK124011.68±10.22 6.23±0.86 11.31±1.22QIN8 65.25±1.228.96±6.87 113.8±16.4QIN9 20.61±0.395.87±2.90 116.08±21.09QIN10 6.11±0.11 4.48±087.15±14.88QIN11 35.01±0.073.585±0.3339.78±8.9QIN12 73.19±0.179.76±0.13 139.31±26.35實(shí)施例8HIV-1復(fù)制酶抑制劑作用機(jī)制的研究HIV-1整合酶ELISA分步方法檢測(cè)藥物作用性質(zhì)方法文獻(xiàn)(1994，Nucleic acids Research，22(6)，1121-1122)NQ-1和9833及CEHL的作用性質(zhì)
化合物NQ-2和9833主要抑制HIV-1整合酶的鏈轉(zhuǎn)移活性，但9833的分步活性結(jié)果對(duì)裝配和鏈轉(zhuǎn)移均有較強(qiáng)的抑制作用，比NQ-2強(qiáng)10-45倍。CEHL主要抑制HIV-1整合酶的鏈轉(zhuǎn)移活性，IC50為1.14μg/ml(表6)。
表6萘醌類抑制劑，CEHL對(duì)HIV-1 IN的分步活性化合物IC50
總活性過(guò)程 裝配 鏈轉(zhuǎn)移NQ-278.5±0.45μM 96.97±15.21μM168±98μM 49.8±3.6μM983337.2±9.28μM 8.48±0.71μM 6.9±0.054μM 1.1±0.073μMCEHL8.17±2.26μg/ml 10.79±1.71μg/ml 15.82±4.97μg/ml 1.14±0.2μg/ml實(shí)施例9用HIV-RT抑制法檢測(cè)藥物在小鼠體內(nèi)血清活性動(dòng)態(tài)
中約丹參提取物CEH，口服劑量20g/kg；腹腔注射劑量0.7g/kg；AZT口服劑量10mg/kg。實(shí)驗(yàn)方法小鼠口服或腹腔注射CEH，或口服AZT后，分別于0分鐘，30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)取血，分離血清，56度30分鐘滅活后，進(jìn)行HIV-逆轉(zhuǎn)錄酶抑制實(shí)驗(yàn)。結(jié)果正常小鼠血清對(duì)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶有非特異抑制作用，稀釋75倍后抑制作用下降。小鼠給約后不同時(shí)間取的血清，為清除小鼠血清非特異抑制作用，稀釋75倍后測(cè)定HIV-RT的抑制作用。結(jié)果小鼠腹腔注射CEH0.7g/kg一次后，30分鐘至2小時(shí)都可檢出明顯的抑制作用(p＜0.01)，血約濃度2小時(shí)達(dá)高峰，4小時(shí)下降(表7，圖13)。小鼠口服CEH20g/kg，30分鐘及1小時(shí)后血清有活性(p＜0.05)，2小時(shí)后下降至正常血清水平(圖13)，說(shuō)明CEH腹腔注射吸收優(yōu)于口服約100倍左右。
陽(yáng)性對(duì)照藥AZT在體外實(shí)驗(yàn)對(duì)HIV-1 RT無(wú)抑制作用，在小鼠體內(nèi)磷酸化為3磷酸活性化合物。小鼠口服10mg/kg一次，30分鐘至4小時(shí)血清中都可檢出對(duì)HIV-1 RT的抑制作用，30分鐘最高，逐步下降(表7，圖13)。
表7CEH和AZT小鼠體內(nèi)血清活性動(dòng)態(tài)發(fā)明效果
本發(fā)明首次采用我國(guó)分離的HIV-1C/B別重組病毒的pol基因，以pMAL-c2載體構(gòu)建我國(guó)HIV-1蛋白酶重組質(zhì)粒pMAL-c2-PR，表達(dá)可溶性HIV-1蛋白酶，一步純化獲得純HIV-1蛋白酶。而國(guó)際上報(bào)道的HIV蛋白酶大多是以包涵體形式表達(dá)[J Biol Chem 1988 Oct15；263(29)14617-14620；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1989，861841-1845；Biochemistry.1990，29264-269；Eur.J.Bioche.1991，199361-369；Biochem Molecu Bio Inter.1995，35(4)899-912；Appl Biochem Biotechnol.1996，6197107；Appl Microbiol Biotechnol.1997，47241-245.]，需經(jīng)變性、復(fù)性之后再純化，技術(shù)繁瑣，周期長(zhǎng)，酶活易損失。本發(fā)明酶制備方法較為簡(jiǎn)便易行，在此基礎(chǔ)上建立了ELISA快速檢測(cè)方法；首次聯(lián)合應(yīng)用我國(guó)HIV-1蛋白酶ELISA檢測(cè)方法與現(xiàn)有的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶3H摻入法和HIV-1整合酶ELISA法進(jìn)行三種復(fù)制酶多靶位篩選，可篩出作用不同的單一或多靶位的HIV-1抑制劑，為發(fā)展多靶位作用的抗HIV新藥奠定了基礎(chǔ)；聯(lián)合三種復(fù)制酶檢測(cè)法篩出了對(duì)HIV-1三種復(fù)制酶有廣譜抑制作用的化合物9833、黃芩甙元鈉、丹參提取物CEH、CEHL、和中藥提取物ELBI，有進(jìn)一步開發(fā)的價(jià)值。


圖1表達(dá)載體pMAL-c2-PR的構(gòu)建圖譜示意2PCR擴(kuò)增及驗(yàn)證1pc54-pol-T作為模板2pMAL-c2-PR作為模板3空白對(duì)照4DNA ladder 2000圖3pMAL-c2-PR的限制性內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證1DNA ladder 15 0002DNA ladder 20003pMAL-c2/EcoR I4pMAL-c2/EcoR I+BamH I5pMAL-c2-PR/EcoR I6pMAL-c2-PR/EcoR I+BamH I圖4 pMAL-c2-PR的測(cè)序驗(yàn)證圖5SDS-PAGE電泳驗(yàn)證HIV-1蛋白酶的表達(dá)和純化1pMAL-c2-PR轉(zhuǎn)化菌未誘導(dǎo)總蛋白2低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)3pMAL-c2-PR轉(zhuǎn)化菌IPTG誘導(dǎo)總蛋白4pMAL-c2-PR轉(zhuǎn)化菌IPTG誘導(dǎo)可溶性胞質(zhì)部分5pMAL-c2-PR轉(zhuǎn)化菌IPTG誘導(dǎo)包涵體6不與amylose柱結(jié)合部分7，8純化后的HIV-1蛋白酶圖6 Gelpro凝膠分析軟件分析HIV-1蛋白酶的表達(dá)圖7 HPLC方法測(cè)定重組HIV-1蛋白酶活性從上到下曲線的反應(yīng)時(shí)間分別為0，20，40，60分鐘圖8HPLC方法測(cè)定HIV-1重組蛋白酶的Km值的雙倒數(shù)9ELISA方法HIV-1蛋白酶的反應(yīng)時(shí)間曲線圖10ELISA方法測(cè)定HIV-1蛋白酶的反應(yīng)速度曲線圖11 ELISA方法測(cè)定HIV-1蛋白酶的Km值的雙倒數(shù)12萘醌類化合物的結(jié)構(gòu)NQ-1R1＝R2＝R3＝R4＝HNQ-2R1＝R2＝OH，R3＝R4＝H9833R1＝R2＝OH，R3＝R4＝SO3K圖13 CEH在小鼠體內(nèi)抗HIV-1 RT血清動(dòng)態(tài)
序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究所陳鴻珊，郭志敏<120>我國(guó)HIV-1蛋白酶ELISA檢測(cè)方法及用于多靶位篩選抗HIV-1抑制劑<160>1<210>1<211>297<212>DNA<213>逆轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒屬(Retroviridae，Lentivirus)<220><221>mat_peptide<222>(1)...(297)<400>1cctcaaatca ctctttggca acgacccctc gtcacaataa agataggggg gcaattaaag 60gaagctctat tagatacagg agcagatgat acagtattag aagacctgaa tttgccaggg 120aaatggaaac caaaaatgat agggggaatt ggaggtttta tcaaagtaag acagtatgaa 180cagataccca tagaaatttg cggacacaaa gctataggta cagtattagt aggacctaca 240cctgtcaaca taattggaag aaatctgttg actcagcttg gttgcacttt aaatttt 29權(quán)利要求
1.我國(guó)HIV-1蛋白酶ELISA檢測(cè)方法，其特征是首次采用我國(guó)分離的HIV-1C/B型重組病毒的pol基因，以pMAL-c2載體構(gòu)建我國(guó)HIV-1蛋白酶重組質(zhì)粒pMAL-c2-PR，表達(dá)可溶性HIV蛋白酶，進(jìn)行一步純化，并以所獲得的HIV-1蛋白酶建立ELISA活性檢測(cè)方法。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是HIV-1蛋白酶重組質(zhì)粒pMAL-c2-PR的構(gòu)建是以含有HIV-1pol基因的質(zhì)粒pC54-pol-T為模板，設(shè)計(jì)含有pMAL-c2表達(dá)載體的多克隆酶切位點(diǎn)EcOR I和BamH I的上游引物5′-ACT GAA TTC CCTCAA ATC ACT CTT-3′及下游引物5′-GCC GGA TCC TTA AAA ATT TAA AGT GCA ACC AAG-3′，經(jīng)PCR反應(yīng)，獲得HIV-1蛋白酶基因片段，插入pMAL-c2表達(dá)載體相應(yīng)酶切位點(diǎn)，獲得HIV-1蛋白酶重組質(zhì)粒pMAL-c2-PR。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是可溶性HIV蛋白酶的表達(dá)是將所構(gòu)建的HIV-1蛋白酶重組質(zhì)粒pMAL-c2-PR轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化子在LB+氨芐青霉素(Amp)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得HIV-1蛋白酶的表達(dá)。
4.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征是HIV-1蛋白酶的一步純化是將含有HIV-1蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌菌體懸于預(yù)冷的裂解緩沖液，冷凍過(guò)夜，融化、超聲破碎細(xì)胞，離心，上清液上Amylose樹脂柱用含麥芽糖的緩沖液洗脫，透析、濃縮，獲得純化的HIV-1蛋白酶。
5.如權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征是HIV-1蛋白酶是以Ac-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Lys-biotin為底物所建立的ELISA方法檢測(cè)其活性的。
6.HIV-1蛋白酶ELISA檢測(cè)方法在聯(lián)合HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶3H摻入法和HIV-1整合酶ELISA法進(jìn)行三種HIV-1復(fù)制酶單一或多靶位篩選HIV-抑制劑、研究有效化合物的構(gòu)效關(guān)系、示蹤中草藥分離提取的單一成分、探索藥物作用機(jī)制和測(cè)定動(dòng)物體內(nèi)藥物血清動(dòng)態(tài)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及人類免疫缺陷病毒復(fù)制酶ELISA檢測(cè)方法及其在HIV－1抑制劑篩選中的應(yīng)用，該方法首次采用我國(guó)分離的HIV－1C/B型重組病毒pol基因，以pMAL－c2載體構(gòu)建我國(guó)HIV－1蛋白酶重組質(zhì)粒pMAL－c2－PR，表達(dá)可溶性HIV蛋白酶，進(jìn)行一步純化，并以所獲得的HIV－1蛋白酶建立ELISA活性檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)便易行，以此可篩選出作用不同的單一或多靶位HIV－1抑制劑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1403588SQ02124248
公開日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2002年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者陳鴻珊, 郭志敏 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所