專利名稱：高效核酸雜交裝置及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于液體中的靶分子和探針之間雜交反應(yīng)的裝置，以及雜交反應(yīng)的方法。
有許多裝置和方法通過改變雜交條件改善了雜交反應(yīng)的效率。例如，美國專利5,639,423涉及一種在微結(jié)構(gòu)環(huán)境內(nèi)用于原位化學(xué)反應(yīng)的裝置。該裝置在需要高度準(zhǔn)確的溫度循環(huán)的生化反應(yīng)中尤其有用，尤其是基于DNA的控制如PCR，這是因?yàn)槲⒀b置較小的體積有利于快速的循環(huán)周期。美國專利6,238,910提供了一種能準(zhǔn)確控制溫度和液體的DNA雜交裝置。
另外，有些技術(shù)改進(jìn)了用于雜交測定裝置的元件。美國專利5,849,486公開了用于分子生物學(xué)診斷、分析和多步驟及多元反應(yīng)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用可以自身移動的、自身組裝的微電子系統(tǒng)以便在精細(xì)條件下主動控制反應(yīng)條件。美國專利6,197,565提供了一種微小的整合液體系統(tǒng)，用于多種操作的準(zhǔn)備和分析，以及操作和使用這些系統(tǒng)的方法。美國專利6,255,050利用一種力，如離心力、電泳力、重力、真空吸引力或壓力，在雜交反應(yīng)中驅(qū)動含核酸堿基的序列分隔聚集。美國專利6,287,850公開了一種振動裝置，用于可逆的介導(dǎo)液體樣品沿著核酸列陣來回流動，因此促進(jìn)液體樣品靶序列和探針在核酸列陣中的雜交。另外，Liu等人改進(jìn)了微量液體生化列陣，用摩拖羅拉(Motorola)基于玻璃的微列陣生物芯片大量的整合了平行微量液體通道(第14屆IEEE國際微電子機(jī)械系統(tǒng)研討會2001，439-442頁，2001年1月21-25日)。
然而，上述已知技術(shù)不能提供滿意的雜交效率，也不能有效減少雜交所需的時(shí)間。因此，有必要發(fā)明一種改善雜交測定的裝置和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于液體中的靶分子和探針之間雜交反應(yīng)的裝置，包括一個(gè)微量液體管道包括第一部分和接續(xù)所述的第一部分之后的第二部分，其中所述的第一部分有一個(gè)不規(guī)則的橫截面，所述的第二部分有一種探針，以及一個(gè)連接所述管道末端與試管的液體驅(qū)動元件，其中所述的液體元件可以重復(fù)地來回移動所述的靶分子通過所述的第二部分。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供增加靶分子和探針之間雜交反應(yīng)的方法，包括以下步驟(a)提供一個(gè)含有第一部分和接續(xù)所述的第一部分之后的第二部分的微量液體管道，其中所述的第一部分有一個(gè)不規(guī)則的橫截面，所述的第二部分有第一種和第二種或更多種探針，其中所述的第一種探針與所述的靶分子特異結(jié)合；(b)將含有所述靶分子的液體導(dǎo)入本發(fā)明雜交反應(yīng)裝置中的微量液體管道；(c)驅(qū)動所述的液體來回流動，使所述的靶分子可以重復(fù)通過所述的第二部分，因此移走與第二或更多探針非特異結(jié)合的所述的靶分子，保留與所述第一種探針結(jié)合的靶分子。


圖1表示用于雜交反應(yīng)裝置微量液體管道不規(guī)則橫斷面形狀的實(shí)例。
圖2闡述了發(fā)明的裝置。
圖3表示不同形狀(裝置I圓圈，裝置II直線)的不規(guī)則橫斷面的微量液體管道。
圖4表示不考慮不規(guī)則橫斷面的形狀，由微泵驅(qū)動的靶DNA的雜交效率較孵育靶DNA(對照)為佳。
圖5表示圓圈狀不規(guī)則斷面的雜交效率。
圖6表示不同大小橫斷面的微量液體管道。
圖7表示不管在裝置III還是裝置IV，由微泵驅(qū)動的靶DNA的雜交效率較孵育靶DNA(對照)為佳。
圖8表示在裝置III的慢區(qū)域(橫斷面大)30分鐘后的雜交信號是對照4小時(shí)后雜交信號的1.5倍。
圖9表示在裝置IV的慢區(qū)域(橫斷面大)30分鐘后的雜交信號是對照4小時(shí)后雜交信號的2.7倍，如是對照30分鐘時(shí)的6.1倍。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明利用了能產(chǎn)生剪切力的微量液體管道使液體前后晃動，增加液體中的靶分子和探針的雜交效率，減少雜交所需的時(shí)間。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于液體中的靶分子和探針之間雜交反應(yīng)的裝置，包括一個(gè)含有第一部分和接續(xù)所述的第一部分之后的第二部分的微量液體管道，其中所述的第一部分有一個(gè)不規(guī)則的橫截面，所述的第二部分有一種探針，以及一個(gè)連接所述管道末端與試管的液體驅(qū)動元件，其中所述的液體元件可以重復(fù)地來回移動所述的靶分子通過所述的第二部分。
根據(jù)本發(fā)明，探針是一種表面固定不動的分子，被特別的靶序列識別，有時(shí)也指作為配體?？梢杂迷摪l(fā)明研究的探針例子包括，但不局限于，細(xì)胞膜受體的激動劑和拮抗劑、毒素和毒液、病毒表位、激素(如鴉片肽、類固醇等)、激素受體、肽、酶、酶作用物、輔因子、藥物、外源凝集素、糖類、寡核苷酸或核酸、寡糖、蛋白質(zhì)和單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明，靶分子是與給定探針有親和力的分子，有時(shí)指作為一個(gè)受體。靶分子可以是自然產(chǎn)生的分子，也可以是人工制造的分子。另外，它們可以以無變化狀態(tài)使用，也可以與其他種類結(jié)合使用。靶分子可以直接或通過特異結(jié)合介質(zhì)以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵與結(jié)合膜結(jié)合。本發(fā)明使用的靶分子例子包括，但不局限于，抗體、細(xì)胞膜受體、與特異抗原決定簇(如病毒、細(xì)胞或其他物質(zhì))反應(yīng)的單克隆抗體和抗血清、藥物、寡核苷酸或核酸、肽、輔因子、外源凝集素、糖類、多糖、細(xì)胞、細(xì)胞膜和細(xì)胞器。優(yōu)選的本發(fā)明的靶分子是核酸、肽或肽核糖核酸。本發(fā)明更優(yōu)選的靶分子是DNA或RNA。更優(yōu)選的本發(fā)明的靶分子是單鏈核酸或雙鏈核酸。
根據(jù)本發(fā)明，本裝置的微量液體管道包括第一部分和接續(xù)所述的第一部分之后的第二部分。根據(jù)本發(fā)明，第一部分有一個(gè)不規(guī)則的橫截面。不規(guī)則的橫截面是通過不規(guī)則的改變所述管道的所述第一部分的橫截面的大小產(chǎn)生的。第一部分形狀的例子見圖1。由于分子內(nèi)氫鍵的形成，多數(shù)單鏈核酸分子可以形成盤狀構(gòu)造。考慮到此種構(gòu)造，進(jìn)行雜交反應(yīng)的區(qū)域位于分子構(gòu)造之內(nèi)，因此，雜交反應(yīng)并不完全。過去，只有大約8％的核酸分子可以完全反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，第一部分可以產(chǎn)生切應(yīng)力，該切應(yīng)力能將核酸分子拉成線性構(gòu)造，線性核酸分子的形成有利于雜交反應(yīng)。另外，本發(fā)明裝置也可以使用雙鏈核酸。本發(fā)明第一部分產(chǎn)生的切應(yīng)力可以使雙鏈核酸變性產(chǎn)生單鏈核酸。類似的，蛋白分子的反應(yīng)區(qū)也可能位于三維結(jié)構(gòu)之內(nèi)。剪切力可以損傷蛋白的三維結(jié)構(gòu)，使得反應(yīng)區(qū)暴露出來，雜交反應(yīng)容易的進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，微量液體管道的內(nèi)表面是粗糙的或有凹縫。
根據(jù)本發(fā)明，該裝置包括一個(gè)連接所述管道末端與試管的液體驅(qū)動元件。優(yōu)選的液體驅(qū)動元件是微氣體驅(qū)動泵、微機(jī)械泵或微電動泵。更優(yōu)選的，微機(jī)械泵選自微靜電泵、微磁力驅(qū)動泵、微擴(kuò)散泵。更優(yōu)選的，微電動泵選自以下團(tuán)體包括微水電泵和微電泳泵以及微電滲透泵。
根據(jù)本發(fā)明，該裝置進(jìn)一步包括給所述的靶分子提供能量的方法。優(yōu)選的方法是加熱器如溫度循環(huán)儀。能量可以增加靶分子和探針碰撞的次數(shù)。因此可以提高雜交效率。
本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例是為了闡明該裝置用于液體中靶分子和探針(見圖2)之間的雜交反應(yīng)。微泵1驅(qū)動液體流至閥2。液體通過試管4流進(jìn)微量液體管道3，雜交反應(yīng)在管道3進(jìn)行。獲得的液體通過試管5流出管道3。
根據(jù)本發(fā)明，任何已知的技術(shù)(如微鑄造、刻蝕和粘合方法)可以用于制造本發(fā)明雜交反應(yīng)的裝置，如在“第14屆IEEE國際微電子機(jī)械系統(tǒng)研討會2001，439-442頁，2001年1月21-25日”中描述的方法。優(yōu)選的本發(fā)明裝置可以用于去除與探針非特異結(jié)合的靶分子。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供為去除雜交反應(yīng)中靶分子和探針之間非特異結(jié)合的靶分子的方法，它包括以下步驟(a)提供一個(gè)微量液體管道包括第一部分和接續(xù)所述的第一部分之后的第二部分；其中所述的第一部分有一個(gè)不規(guī)則的橫截面，所述的第二部分有第一和第二或更多的探針，其中所述的第一探針與所述的靶分子特異結(jié)合；(b)將含有所述靶分子的液體導(dǎo)入本發(fā)明雜交反應(yīng)裝置中的微管道；(c)驅(qū)動所述的液體來回流動，使所述的靶分子可以重復(fù)通過所述的第二部分，去除與第二或更多探針非特異結(jié)合的靶分子，保留與所述第一種探針結(jié)合的靶分子。
根據(jù)本發(fā)明，本方法中使用的去除非特異結(jié)合的靶分子的微量液體裝置包括有一個(gè)不規(guī)則的橫截面的第一部分和有第一和第二或更多探針的第二部分，其中所述的第一探針與所述的靶分子特異結(jié)合。與其它探針非特異結(jié)合的靶分子可以通過重復(fù)驅(qū)動液體通過所述的第二部分去除。
根據(jù)本發(fā)明，該發(fā)明的裝置和方法可以減少雜交反應(yīng)所需的時(shí)間，增加雜交效率。本發(fā)明為進(jìn)行雜交反應(yīng)提供了商業(yè)上可行的裝置。可以理解上述描述意在闡明而非限定。通過閱讀上述說明，許多實(shí)例對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
實(shí)施例實(shí)施例1 雜交反應(yīng)本實(shí)施例比較了不同形狀的(圖3，裝置I圓圈，裝置II直線)微量液體管道的雜交效率。
四種探針，Sp5(0.5μM)，Alo3(5μM)，Alo1(5μM)和P3(5μM)分別用移液器點(diǎn)至薄片上(固定液2×SSC；薄片工業(yè)技術(shù)研究所制造的sol-gel；每一點(diǎn)的體積200nl)，37℃反應(yīng)4小時(shí)。然后將薄片在0.5％SDS中用超聲波降解，用去離子水洗兩次，每次一分鐘，在DNA雜交爐(雜交公司)中風(fēng)干。
其上有一個(gè)包括圓圈狀或直線狀的第一部分微量液體管道的特別鑄造的模具與上述含有特異核酸探針的薄片緊密結(jié)合，其上用強(qiáng)有力的彈簧別針固定。鑄造模具上的微量液體管道應(yīng)該正確覆蓋固定在薄片上的核酸探針，使核算探針暴露在微量液體管道中。
靶DNA，Cy5O3(1μM；與Alo3互補(bǔ)的25堿基單鏈序列，其5‘端用Cy5探測熒光標(biāo)記)，變性。含有10μl靶DNA、20μl去離子水和30μl的2×雜交緩沖液的液體進(jìn)入微量液體管道。提供附加能量以增加雜交效率。靶DNA用微量泵前后驅(qū)動以進(jìn)行雜交(40℃；1小時(shí))。靶DNA分別引入另外一個(gè)微量液體管道，40℃孵育1小時(shí)以進(jìn)行雜交(作為對照)。雜交后，薄片用掃描儀(ScanArray 4000，通用掃描公司)探測熒光。
結(jié)果見圖4和圖5。圖4表示不考慮第一部分的形狀，由微泵驅(qū)動的靶DNA的雜交效率較孵育靶DNA(對照)好。圖5表示直線狀的第一部分(信號大約是對照的3.8倍)的雜交效率較圓圈狀(信號大約是對照的2.1倍)的雜交效率好。
實(shí)施例2 雜交反應(yīng)本實(shí)施例比較了不同大小的橫斷面(圖6)的微量液體管道的雜交效率。
五種探針，Sp5(0.5μM)，2號探針(5μM)，3號探針(5μM)，4號探針(5μM)和5號探針(5μM)分別用移液器點(diǎn)至薄片上(固定液2×SSC；薄片工業(yè)技術(shù)研究所制造的sol-gel；每一點(diǎn)的體積200nl)，37℃反應(yīng)4小時(shí)。然后將薄片在0.5％SDS中用超聲波降解，用去離子水洗兩次，每次一分鐘，在DNA雜交爐(雜交公司)中風(fēng)干。
根據(jù)實(shí)施例1的描述產(chǎn)生兩個(gè)直線微量液體管道，橫截面為2∶1(裝置III)和5∶1(裝置IV)，在以下雜交實(shí)驗(yàn)中使用。
靶DNA(與5號探針互補(bǔ)的1K堿基單鏈序列，其5‘端用Cy5探測熒光標(biāo)記)變性。含有10μl靶DNA、20μl去離子水和30μl的2×雜交緩沖液的液體進(jìn)入微量液體管道。靶DNA用微量泵前后驅(qū)動以進(jìn)行雜交(40℃；30分鐘)。靶DNA分別引入另外一個(gè)微量液體管道，40℃孵育30分鐘以進(jìn)行雜交(作為對照)。雜交后，薄片用掃描儀(ScanArray 4000，通用掃描公司)探測熒光。
結(jié)果見圖7至9。圖7表示不管在裝置III還是裝置IV，由微泵驅(qū)動的靶DNA的雜交效率較孵育靶DNA(對照)好。圖8表示在裝置III的慢區(qū)域(橫斷面大)30分鐘后的雜交信號是對照4小時(shí)后雜交信號的1.5倍。圖9表示在裝置IV的慢區(qū)域(橫斷面大)30分鐘后的雜交信號是對照4小時(shí)后雜交信號的2.7倍，如是對照30分鐘時(shí)的6.1倍。這些結(jié)果表明雜交信號的數(shù)量不僅被用以驅(qū)動靶DNA的動力能量影響，而且還被微量液體管道的形狀影響。
雖然本發(fā)明在優(yōu)選的參考實(shí)施例中有特別的顯示與描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，只要不背離本發(fā)明的精神和范圍，可以有形式和細(xì)節(jié)上的多種變化。
權(quán)利要求
1.一種用于液體中的靶分子和探針之間雜交反應(yīng)的裝置，其特征在于包括一個(gè)微量液體管道，它包括第一部分和接續(xù)第一部分之后的第二部分，其中所述的第一部分有一個(gè)不規(guī)則的橫截面，所述的第二部分有一種探針，以及一個(gè)連接所述管道末端與試管的液體驅(qū)動元件，其中所述的液體元件可以重復(fù)地來回移動所述的靶分子通過所述的第二部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述的不規(guī)則橫截面是通過不規(guī)則的改變所述管道的所述第一部分橫截面的大小產(chǎn)生的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述的微量液體管道的內(nèi)表面是粗糙的或有凹縫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述的探針是核酸、肽或肽核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于所述的核酸是DNA或RNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于所述的核酸是單鏈核酸或雙鏈核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于進(jìn)一步包括給所述的靶分子提供能量的裝置。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于可以用來去除與所述探針非特異結(jié)合的靶分子。
9.一種增加靶分子和探針之間雜交反應(yīng)的方法，其特征在于包括以下步驟(a)提供一個(gè)含有第一部分和接續(xù)所述的第一部分之后的第二部分的微量液體管道，其中所述的第一部分有一個(gè)不規(guī)則的橫截面，所述的第二部分有第一和第二或更多的探針，其中所述的第一探針與所述的靶分子特異結(jié)合；(b)將含有所述靶分子的液體導(dǎo)入本發(fā)明雜交反應(yīng)裝置中的微量液體管道；(c)驅(qū)動所述的液體來回流動，使所述的靶分子可以重復(fù)通過所述的第二部分，因此移走與第二或更多探針非特異結(jié)合的所述的靶分子，保留與第一探針結(jié)合的靶分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述的探針是核酸，肽或肽核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述的核酸是DNA或RNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述的核酸是單鏈核酸或雙鏈核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述的管道的表面是粗糙的。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述的不規(guī)則橫截面是通過不規(guī)則的改變所述管道的所述第一部分橫截面的大小產(chǎn)生的。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于進(jìn)一步包括給所述的靶分子提供能量的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于液體中的靶分子和探針之間雜交反應(yīng)的裝置，該裝置包括一個(gè)含有第一部分和接續(xù)第一部分之后的第二部分的微量液體管道；其中第一部分有一個(gè)不規(guī)則的橫截面，第二部分有一種探針，以及一個(gè)連接所述管道末端與試管的液體驅(qū)動元件，其中所述的液體元件可以重復(fù)地來回移動所述的靶分子通過所述的第二部分。
文檔編號C12Q1/68GK1441061SQ02105179
公開日2003年9月10日 申請日期2002年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月25日
發(fā)明者張耀嵩, 鐘永強(qiáng), 石明正 申請人:財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院