專利名稱：重組dna序列,編碼的免疫融合蛋白及表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤指以基因重組技術(shù)得到的重組DNA序列(DNAs)，以及與之相對(duì)應(yīng)的編碼的免疫融合蛋白及其表達(dá)方法。
包括細(xì)胞因子在內(nèi)的很多具有藥用意義的生物因子，只在體內(nèi)產(chǎn)生瞬間及局部的生物作用，所以其循環(huán)周期相對(duì)很短。例如，人血清中的干擾素的半衰期就只有2-8小時(shí)(Roche labs.Referon A.Schering Intron A.Physicians’desk Referece，47thedition，pp.2006-2008，2194-2201)。為使這些生物因子產(chǎn)生一種有效的系統(tǒng)治療效果，患者需要接受相對(duì)大的劑量和高頻率的給藥。這樣的給藥十分不方便，也會(huì)使患者承受很多疼痛之苦，同時(shí)也會(huì)增加藥物的毒副作用。為了克服這些缺點(diǎn)，就需要修飾該藥物分子，使其在不減少藥物效力的前提下增加它在血液中的循環(huán)周期時(shí)間。
人體免疫球蛋白IgG是血液中富含的一種蛋白，其典型的半衰期可長達(dá)21天。利用IgG分子的絞鏈和Fc區(qū)與其他蛋白的功能區(qū)所構(gòu)建的融合蛋白已有文獻(xiàn)報(bào)道(Mordenti J.et al.，Nature，1989，337525-31；Capon DJ and Lasky LA，US pat.No.5,116,964；Kurschner C.et al.，J.Immunol.1992，1494096-4100；Chang TW and Yu L，US pat.No.5,723,125；Lo KM et al.，US pat.No.5,541,087；Gillies SD et al.，PNAS USA，1992，891428-1432；Capon DJ et al.，Nature，1989，337525-31；Gillies SD et al.，Bioconjugate Chemistry，1992，4230-235)。很多可溶性蛋白都通過這種方式成功地進(jìn)行了修飾，比如細(xì)胞因子(如IL-2，IL-10等)，酶(如尿激酶等)，以及細(xì)胞表面受體的胞外結(jié)構(gòu)域。這種融合蛋白的構(gòu)型是一個(gè)同型二聚體，結(jié)構(gòu)類似于一個(gè)沒有CH1結(jié)構(gòu)域和輕鏈的IgG分子，它通過IgG絞鏈區(qū)里面的半胱氨酸殘基通過二硫鍵連接起來。由于具有結(jié)構(gòu)同源性，F(xiàn)c融合蛋白在體內(nèi)表現(xiàn)出來的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)與相似種型的人源化單克隆抗體相同(Capon DJ et al.，Nature，1989，337525-31；Chaudhary et al.，Nature，1989，339394)。
內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)允許在一個(gè)mRNA分子上進(jìn)行2個(gè)開放閱讀框的翻譯(Rees s.et al.1996，BioTechniques 2012-104；Jackson RJ et al.1990，TrendsBiochem.Sci.15477-483；Jang SK et al.1988，J.Virol.622636-2643)。當(dāng)融合蛋白編碼序列通過內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)連接到選擇性標(biāo)記蛋白的N端時(shí)，雙順反子mRNAs則被作為融合蛋白和選擇標(biāo)記蛋白的雙重翻譯模板。因?yàn)閮?nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的翻譯效率較低，所以在IRES下游區(qū)域放置選擇性標(biāo)記位點(diǎn)就增加了它的選擇性壓力。在加入適當(dāng)試劑的選擇后，幾乎所有幸存的克隆都會(huì)穩(wěn)定地表達(dá)感興趣的融合蛋白，從而減少了為尋找高產(chǎn)功能克隆株而需篩選的克隆株的數(shù)量。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下本發(fā)明涉及到的免疫融合蛋白的重組DNA序列，依次為編碼分泌信號(hào)肽、免疫球蛋白Fc區(qū)、免疫惰性肽連接鏈、以及哺乳類目的蛋白的DNA序列，以上各部份編碼序列均位于同一翻譯框架。
本發(fā)明所涉及的免疫融合蛋白的重組DNA序列，也可以是另一種結(jié)構(gòu)，依次為編碼分泌信號(hào)肽、哺乳類目的蛋白、免疫惰性肽連接鏈、以及免疫球蛋白Fc區(qū)的DNA序列，以上各部份編碼序列均位于同一翻譯框架。
本發(fā)明的一個(gè)特征是上述的免疫融合蛋白也包括在編碼框內(nèi)或者編碼框外的其他多肽鏈序列，比如選擇性標(biāo)記蛋白，蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(如特殊蛋白裂解酶位點(diǎn))，多肽表面抗原的序列(如可以通過蛋白識(shí)別位點(diǎn)被裂解掉從而便于純化的表面抗原)。
本發(fā)明的一個(gè)特征是免疫融合蛋白的重組DNA還包括其他序列，比如載體、啟動(dòng)子、調(diào)控序列(比如5’和3’序列)以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)，比如IRES。
本發(fā)明的另一個(gè)特征是免疫融合蛋白以及相應(yīng)的重組DNA序列，按5’-3’方向順序，依次編碼分泌信號(hào)肽序列，免疫球蛋白Fc區(qū)(或者哺乳類目的蛋白編碼序列)，免疫惰性多肽連接鏈序列，哺乳類目的蛋白編碼序列(或者免疫球蛋白Fc區(qū))，在理想的情況下，選擇性標(biāo)記蛋白可通過IRES連接到融合蛋白的下游，從而提高選擇壓力。這種融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)使得哺乳類目的蛋白的表達(dá)比現(xiàn)有的技術(shù)更為優(yōu)越。另外，表達(dá)質(zhì)粒調(diào)控序列可以優(yōu)化，哺乳類目的蛋白編碼序列可以是任何目的基因，因此，本發(fā)明適用于構(gòu)建及表達(dá)多種融合蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)特征在于采用基因重組方法構(gòu)建DNA表達(dá)載體，并使其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)，從而產(chǎn)生具有實(shí)用價(jià)值的免疫融合蛋白。使用本發(fā)明涉及的重組DNA序列及其生產(chǎn)哺乳類目的蛋白方法，在充分保留哺乳類目的蛋白生物活性的前提下，免疫融合蛋白的產(chǎn)量可高達(dá)每升100-300毫克。原因?yàn)?)將哺乳類目的蛋白編碼序列免疫球蛋白Fc區(qū)的N端或C端連接，并在真核宿主細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，使哺乳類目的蛋白的生成過程簡單化。未成熟融合蛋白的信號(hào)肽在細(xì)胞內(nèi)被完全切去以后，成熟融合蛋白被分泌到培養(yǎng)液中，有利于產(chǎn)品的收集；2)蛋白的天然構(gòu)型及其立體靈活性與生物活性關(guān)系密切。當(dāng)被融合的兩段蛋白之間被引入一個(gè)連接體，則有利于保留各自的天然構(gòu)型及其立體靈活性，從而保留其生物活性；3)通常情況下，在融合位點(diǎn)上產(chǎn)生的新抗原可以通過加入一段免疫惰性肽段的方法來消除；4)將選擇性標(biāo)記與免疫融合蛋白編碼序列通過IRES連接，提高了免疫融合蛋白高產(chǎn)株篩選效率。另外，免疫融合蛋白的Fc區(qū)多肽鏈?zhǔn)蛊浞蛛x純化效率大幅提高。
本發(fā)明特別提到的免疫融合蛋白系指包含哺乳類目的蛋白，免疫球蛋白Fc區(qū)及免疫惰性肽連接鏈的融合蛋白。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是無論將哺乳類目的蛋白與免疫球蛋白Fc區(qū)的C端或者N端連接，免疫融合蛋白都能在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生高水平表達(dá)，并延長哺乳類目的蛋白在人體內(nèi)的半衰期。免疫惰性肽鏈連接體可提高相融合蛋白鏈的靈活性，從而保持他們天然的生物活性，并消除了融合位點(diǎn)產(chǎn)生新抗體的可能。另外，融合產(chǎn)物的Fc區(qū)可以通過與蛋白A，蛋白G，以及其他類似物特異性結(jié)合，使融合蛋白的純化及制備簡單而高效。
本發(fā)明重組DAN序列編碼的免疫融合蛋白可以作為制備藥物或藥物的組成成分應(yīng)用。
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1-B 重組DNA序列所編碼的融合蛋白結(jié)構(gòu)2。
圖2狒狒體內(nèi)血藥濃度-注射后時(shí)間曲線。
圖3狒狒體內(nèi)不同給入方式IFN-α2b-Fc的藥時(shí)對(duì)比。
本發(fā)明所涉及的重組DNA以及由其編碼的免疫融合蛋白結(jié)構(gòu)可參見圖1-A和圖1-B。以雙順反子形式編碼免疫融合蛋白及選擇性標(biāo)記蛋白的重組DNA序列示于相應(yīng)的起始和終止符號(hào)之間。啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，Kozak序列等上游的調(diào)控序列，以及聚腺苷酸化信號(hào)等3’調(diào)控序列為已知的基因表達(dá)必需的調(diào)控因子，所以未在圖中表示?？傊拘蛄型?，本發(fā)明中的多核苷酸結(jié)構(gòu)可以包括任何使融合蛋白在宿主細(xì)胞中有效表達(dá)的調(diào)控及非調(diào)控序列。
在包括了所有必要的5’(包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，Kozak序列等)和3’(聚腺苷酸化信號(hào)序列)調(diào)控序列的前提下，本發(fā)明所涉及的多核苷酸包括6個(gè)不同的部分。1)信號(hào)肽編碼序列；2)哺乳類目的基因序列；3)免疫惰性肽連接體序列；4)Fc編碼序列；5)IRES序列；6)選擇性標(biāo)記序列。圖1-A和1-B中除了哺乳類目的基因序列和Fc編碼序列在位置上相互交換，其它完全相同。所以，免疫惰性連接肽既可以和哺乳類目的蛋白的N端也可以與其C端連接。在圖1-A中，F(xiàn)c的天然終止密碼子以及哺乳類目的蛋白的天然信號(hào)肽序列被去除了；而哺乳類目的基因的終止密碼子仍保持不變。在圖1-B中，目的基因的終止密碼子被去除，而Fc的終止密碼子被保留。
免疫融合蛋白的編碼序列可以是基因組DNA或者cDNA構(gòu)型。因此，此編碼序列可以包含或不包含內(nèi)含子(天然的或者非天然的)。有實(shí)例證明，在某些條件下，編碼序列中包含內(nèi)含子可以提高蛋白表達(dá)量。其他未在圖中表示的序列，包括但不限制于穩(wěn)定mRNAs的人工內(nèi)含子，可視需要附加。
本發(fā)明中的信號(hào)肽序列為編碼未成熟蛋白上轉(zhuǎn)移小肽的多核苷酸序列，轉(zhuǎn)移小肽可引導(dǎo)未成熟蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，并經(jīng)過修飾后，分泌至胞外。有關(guān)信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)與功能的研究已很成熟，典型的序列含有16-30個(gè)氨基酸殘基，但有些序列的氨基酸殘基可少于16或多于30個(gè)。一個(gè)典型的信號(hào)肽包括三個(gè)區(qū)堿性N末端，中間疏水區(qū)和極性C末端。中間的疏水區(qū)包括4-12個(gè)疏水氨基酸殘基，其作用是使新生的多肽鏈在運(yùn)輸中把信號(hào)肽停留在膜脂雙層中間。接下來，信號(hào)肽通常在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔中被信號(hào)肽酶切掉。通常的信號(hào)肽切割遵循“(-3，-1)原則”，因而典型的信號(hào)肽通常在-1，-3位置上含中性小分子氨基酸，并且，此區(qū)域不存在脯氨酸殘基。信號(hào)肽酶通常在-1到+1位置將信號(hào)肽切除，本發(fā)明傾向于使用切除位點(diǎn)在0位的信號(hào)肽序列，包括N端融合伙伴的天然信號(hào)肽，以及人工合成或源于不同分泌型蛋白的信號(hào)肽序列。來源于不同蛋白的信號(hào)肽可以通過基因重組技術(shù)相互置換，成熟蛋白的結(jié)構(gòu)與功能不會(huì)因此有任何變化。適應(yīng)于特定融合蛋白分泌表達(dá)的信號(hào)肽序列可通過一些常規(guī)試驗(yàn)加以選擇，這些實(shí)驗(yàn)包括測定所選信號(hào)肽的分泌效率，如融合蛋白的分泌產(chǎn)量及生物活性。此外，信號(hào)肽還可以依以上原則人工合成。本發(fā)明所指的信號(hào)肽序列也可以被稱為“信號(hào)肽”，“先導(dǎo)序列”，或“先導(dǎo)肽”，在這里它們都和信號(hào)肽序列是同義關(guān)系。本發(fā)明中提到的信號(hào)肽包括但并不限于1)抗體輕鏈信號(hào)肽序列，例如，小鼠IgG Kapa鏈的先導(dǎo)序列(Technical bulletin，Invitrogen)；2)抗體重鏈先導(dǎo)序列，如MOPC141抗體重鏈信號(hào)序列(Sakano et al.，1980，Nature 2865774)；3)哺乳類目的蛋白的天然信號(hào)肽序列；4)以及任何眾所周知的其他信號(hào)序列。
免疫球蛋白的Fc區(qū)為免疫球蛋白重鏈C末端不變區(qū)的氨基酸序列。Fc區(qū)在決定免疫球蛋白的生物學(xué)性質(zhì)上起著重要的作用。眾所周知，免疫球蛋白的重鏈包括4個(gè)或者5個(gè)區(qū)域IgM和IgE的重鏈包括5個(gè)區(qū)域，而IgA，IgD和IgG的重鏈有4個(gè)區(qū)域。IgA，IgD及IgG的Fc區(qū)是絞鏈-CH2-CH3雙體；IgM和IgE中，F(xiàn)c區(qū)則是絞鏈-CH2-CH3-CH4域的雙體。幾乎所有已知的Fc區(qū)都可以作為本發(fā)明所涉及的免疫融合蛋白的一部分。本發(fā)明首選的免疫球蛋白Fc區(qū)來自人免疫球蛋白gamma-4(IgG4)，其優(yōu)點(diǎn)為1)在人體血液中很穩(wěn)定；2)在很多細(xì)胞類型中都可高效分泌表達(dá)；3)其生物特性已知；4)可以避免諸如補(bǔ)體反應(yīng)及ADCC等需要避免的第二生物學(xué)特性。本發(fā)明首選的gamma-4 Fc區(qū)至少會(huì)包含絞鏈，CH2和CH3三個(gè)區(qū)域。如前所述，IgA，IgD，IgE，IgM和IgG1-3的Fc亦可作為免疫融合蛋白的Fc部份，同樣，經(jīng)過分子修飾(如，刪除)的Fc段也可以被用于本發(fā)明。分子修飾所用的分子生物學(xué)方法已成常規(guī)，在此不再贅述。
本發(fā)明所涉及的免疫惰性肽連接鏈可增加融合伙伴(如目標(biāo)蛋白和Fc區(qū))的靈活性，從而有助于保留蛋白的天然構(gòu)型和生物活性。雖然本發(fā)明所涉及免疫融合蛋白的Fc區(qū)和目標(biāo)蛋白均源自相應(yīng)宿主，單獨(dú)使用不會(huì)使宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但將二者融合后，可能會(huì)在融合位點(diǎn)產(chǎn)生新的免疫表面抗原。所以，本發(fā)明中的連接肽的另一優(yōu)點(diǎn)就在于降低了融合位點(diǎn)的免疫原性。免疫惰性肽連接體的序列可以是不在宿主中引起免疫反應(yīng)的任何肽鏈，長度不限，其作用表現(xiàn)為降低免疫原性和提高Fc與目標(biāo)蛋白的生物活性。本發(fā)明首選的肽連接鏈來自人T細(xì)胞免疫惰性肽鏈，其結(jié)構(gòu)包括甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸和/或甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸的重復(fù)序列。連接肽的長度沒有特別的限制，可以是幾個(gè)氨基酸也可以是幾十個(gè)氨基酸?！懊庖叨栊浴边@個(gè)詞，意味著所涉及的肽連接鏈在特定宿主(比如人)中不引起免疫反應(yīng)。
本發(fā)明所涉及哺乳類目的蛋白的種類沒有限制。實(shí)際上，本發(fā)明旨在提供一個(gè)廣義的，適用于任何哺乳類目的蛋白的多核苷酸及其編碼的免疫融合蛋白的結(jié)構(gòu)及生產(chǎn)方法。在這里，“哺乳類目的蛋白”這個(gè)詞，是指可利用本發(fā)明進(jìn)行修飾和生產(chǎn)的任何有實(shí)用價(jià)值的蛋白。哺乳類目的蛋白可以是酶、激素、趨化因子、細(xì)胞因子、凝血因子等等，包括但不限于生長激素、細(xì)胞介素(例如白介素-2、白介素-6、白介素-10)、干擾素、第八因子、成形因子、紅細(xì)胞生成素等。哺乳類目的蛋白還可以是嵌合體、突變體、多形核蛋白體等。
如上所述，本發(fā)明所涉及的信號(hào)肽序列、哺乳類目的蛋白序列、惰性肽連接鏈序列和Fc區(qū)需相互融合在同一翻譯框架中以表達(dá)所需融合蛋白?！翱蚣堋毕抵敢欢芜B續(xù)的沒有終止密碼子的開放閱讀框序列。將不同編碼序列通過基因重組構(gòu)建在同一翻譯框架中的方法已為常規(guī)。在此結(jié)構(gòu)中，有必要根據(jù)所涉及基因在免疫融合蛋白中的位置和分子牛物學(xué)基本原理對(duì)啟始密碼子、終止密碼子及信號(hào)肽序列進(jìn)行必要的取舍。例如，位于免疫融合蛋白N端的基因，就不可含有終止密碼子子；而位于C端的基因，其啟始密碼子或天然信號(hào)肽序列就必須刪除。
本發(fā)明所涉及的重組DNA序列還可進(jìn)一步包括其他可提高蛋白表達(dá)量、保留生物活性、以及降低篩選及純化難度等的多核苷酸編碼序列。例如，本發(fā)明可包括的一個(gè)連接免疫融合蛋白和下游選擇性標(biāo)記的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，從而產(chǎn)生一個(gè)可同時(shí)翻譯出免疫融合蛋白和選擇性標(biāo)記的雙順反子mRNA。IRES允許核糖體從同一個(gè)mRNA分子上翻譯2個(gè)開放閱讀框(Rees s.et al.1996，BioTechniques 20102-104；Jackson RJ et al.1990，Trends Biochem.Sci.15477-483；Jang SK et al.1988，J.Virol.622636-2643)。當(dāng)免疫融合蛋白的編碼基因通過IRES被連接到選擇性標(biāo)記基因時(shí)，雙順反子mRNAs作為模板，既可翻譯出融合蛋白，也可翻譯出選擇性標(biāo)記蛋白，而且，由于IRES的翻譯效率較低，所以選擇性標(biāo)記的表達(dá)就會(huì)低于其上游的免疫融合蛋白，從而顯著提高了高產(chǎn)株篩選過程中的選擇性壓力和效果。另外，由于免疫融合蛋白基因和選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄受控于同一個(gè)啟動(dòng)子，于是幾乎所有經(jīng)篩選幸存的轉(zhuǎn)染體都會(huì)包含正確的融合基因，及高效表達(dá)所需的免疫融合蛋白，從而減少了篩選大量克隆來獲得高產(chǎn)珠的周期和工作量。本發(fā)明首選的IRES來自腦心肌炎病毒(ECMV)，富含ATG三核苷酸。據(jù)推測，IRES中ATG三核苷酸促進(jìn)了核糖體的進(jìn)入，從而使其下游基因得以順利翻譯。雖然腦心肌炎病毒(ECMV)中分離出的IRES的作用機(jī)制還不十分清楚，但是仍有可能使用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法來進(jìn)行人工改造(如刪除、突變、插入等)。經(jīng)修飾的任何有功能的IRES變異體都可用于本發(fā)明。
本發(fā)明可以使用不同的選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記可賦予所需轉(zhuǎn)染體一個(gè)可識(shí)別和選擇的表型特征，從而使在宿主基因組中含有免疫融合蛋白重組DNA的細(xì)胞很容易被分離及克隆。本發(fā)明可用的選擇性標(biāo)記包括，但并不限制于如下二氫葉酸還原酶(DHFR)、新鏈絲菌素(Neomycin)等。
本發(fā)明重組DNA基因序列可以被克隆到一個(gè)表達(dá)載體中。因此，本發(fā)明中提到的重組DNA基因結(jié)構(gòu)還進(jìn)一步包括位于相應(yīng)載體上的核苷酸序列，這些序列均屬常規(guī)分子克隆技術(shù)范疇，在此不一一列舉。所選擇的載體類型應(yīng)與所選表達(dá)宿主細(xì)胞相匹配，例如使用酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌等作為宿主，則需選擇可在相應(yīng)細(xì)胞中正常表達(dá)的載體。為方便不同目的基因的融合修飾及表達(dá)，可以構(gòu)建一個(gè)基本的表達(dá)載體，此載體應(yīng)包括除去本發(fā)明重組DNA序列中目的基因以外的其他各部分基因，并應(yīng)在此基本表達(dá)載體上目的基因的插入位點(diǎn)引入限制性內(nèi)切點(diǎn)。最終的表達(dá)載體可被用來轉(zhuǎn)染任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主細(xì)胞。DNA的操縱，擴(kuò)增以及重組過程為分子生物技術(shù)常規(guī)，所以不做詳述。如何選擇及克隆適用于本發(fā)明并有實(shí)用價(jià)值的目的基因，目前已有成熟的方法。總之，本發(fā)明所涉及的DNA重組結(jié)構(gòu)，均可以通過已知的DNA重組技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，如限制性內(nèi)切酶的使用，DNA的連接，cDNA合成，聚合酶鏈反應(yīng)等等。另外，諸如啟動(dòng)子等用于表達(dá)調(diào)控的DNA序列也已為眾所周知。適用于本發(fā)明的載體類型可包括，但不限于質(zhì)粒和病毒(包括動(dòng)物病毒)。
本發(fā)明也涉及到免疫融合蛋白的表達(dá)方法，包括由本發(fā)明描述的重組DNA轉(zhuǎn)染而有效表達(dá)免疫融合蛋白的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)方法和條件。任何宿主細(xì)胞都可以用于表達(dá)免疫融合蛋白，包括但并不限制于如下酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(包括人、大鼠、小鼠、猴子等)和昆蟲細(xì)胞等。本發(fā)明所用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括，但并不限于CHO、BHK、NS/0、293等。這些細(xì)胞可以生長(如“培養(yǎng)”)在各種不同的有利于融合蛋白表達(dá)的條件下。這里“表達(dá)”這個(gè)詞，指的是多核苷酸鏈被轉(zhuǎn)錄以及翻譯成蛋白質(zhì)的過程。細(xì)胞的培養(yǎng)條件包括但不限于培養(yǎng)基、空氣中氧氣和二氧化碳濃度、溫度、pH值、緩沖液等等，這些條件的選擇亦屬常規(guī)。
宿主細(xì)胞需經(jīng)本發(fā)明中涉及的多核苷酸轉(zhuǎn)染并篩選后而成為免疫融合蛋白的表達(dá)株。細(xì)胞轉(zhuǎn)化可使用，但不限制于磷酸鈣法、電穿孔法、病毒、脂質(zhì)體等，總之，任何能使多核苷酸進(jìn)入細(xì)胞的方法都可以被使用。進(jìn)入宿主細(xì)胞的多核苷酸可以被瞬時(shí)表達(dá)，也可以整合到基因組DNA上穩(wěn)定表達(dá)。
本發(fā)明重組DNA序列表達(dá)的免疫融合蛋白包含哺乳類目的蛋白，免疫球蛋白Fc區(qū)及連接它們的免疫惰性肽連接鏈。
使用常規(guī)的商業(yè)試劑盒(Promega)可分離出VLN3G2人雜交瘤的總RNA。將3’引物(SEQ ID NO2)加入到含有1μg總RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、dNTP和緩沖液的反應(yīng)液中，于42℃溫育30分鐘，再于80℃溫育30分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。以此合成的cDNA單鏈可用乙醇沉淀，再置于標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)液(包括引物，dNTPs，1x含Mg離子的反應(yīng)緩沖液和Taq聚合酶)中進(jìn)行30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。PCR產(chǎn)物在經(jīng)EcoR I和BamH I消化30分鐘后，用瓊脂糖電泳及GeneClean II(Bio 101)顯現(xiàn)和純化。經(jīng)酶消化及純化后的PCR產(chǎn)物可克隆到經(jīng)EcoR I和BamH I消化的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pIRES-DHFR上。pIRES-DHFR系由購自Clontech公司的pIRES-NEO載體修飾而來，該載體在其多克隆位點(diǎn)依次含EcoR I，BamH I和Not I酶切位點(diǎn)(5’-3’方向)，以及下游的IRES序列和DHFR基因。構(gòu)建好的基本表達(dá)載體均通過DNA測序加以驗(yàn)證。
如把Fc作為C末端的融合部分時(shí)，IFN 2b基因可用SEQ ID NO8和SEQ IDNO9為引物通過PCR獲得。SEQ ID NO8(5’引物)包括一個(gè)EcoR I酶切位點(diǎn)，隨后是IFN 2b前導(dǎo)序列的前24個(gè)核甘酸；SEQ ID NO9(3’引物)包括SEQ ID NO3序列4-18位核苷酸的互補(bǔ)序列(含有BamH I位點(diǎn))和IFN 2b最3’端的21個(gè)核苷酸互補(bǔ)序列(不含終止密碼子)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過EcoR I和BamH I酶切之后，可克隆到實(shí)施例2中描述的表達(dá)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中。所得DNA轉(zhuǎn)染到合適的宿主體系中，即可得到IFN 2b-Fc融合蛋白。在此，免疫惰性連接肽的長度為15個(gè)氨基酸殘基。
如把Fc作為C末端的融合部分時(shí)，HuGH基因可用SEQ ID NO12和SEQ IDNO13為引物通過P℃R獲得。SEQ ID NO12(5’引物)包括一個(gè)EcoR I酶切位點(diǎn)，隨后是HuGHb前導(dǎo)序列；SEQ ID NO13(3’引物)包括SEQ ID NO3序列1-18位核苷酸的互補(bǔ)序列(含有BamH I位點(diǎn))和HuGH基因最3’端的21個(gè)互補(bǔ)核苷酸序列(不含終止密碼子)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過EcoR I和BamH I酶切之后，可克隆到實(shí)施例2中描述的表達(dá)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中。所得DNA轉(zhuǎn)染到合適的宿主體系中，即可得到HuGH-Fc融合蛋白。實(shí)施例5Fc-IL2和IL2-Fc融合蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建人白細(xì)胞介素2(IL2)的基因系通過RT-PCR從一個(gè)經(jīng)Con A激活的Jurkat T細(xì)胞cDNA文庫中分離得到。將Fc融合到N末端和C末端所使用的引物不同。
當(dāng)Fc作為N末端的融合部分時(shí)，使用引物SEQ ID NO14(5’引物)和SEQ IDNO15(3’引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。依5’-3’順序，SEQ ID NO14包括SEQ ID NO3序列中13-48的核苷酸序列和位于IL2基因信號(hào)肽之后最5’端成熟編碼序列；SEQID NO15包括Not I酶切位點(diǎn)和IL2最3’端的互補(bǔ)編碼序列(包括天然的終止密碼子TAG)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠分離純化之后，進(jìn)一步使用BamH I和Not I酶切消化。經(jīng)再次凝膠純化，PCR產(chǎn)物可被克隆到經(jīng)BamH I和Not I消化的基本載體中(見實(shí)施例1)。將得到的DNA轉(zhuǎn)染到一個(gè)適合的宿主體系中即可以表達(dá)出所需的Fc-IL2融合蛋白。
如把Fc作為C末端的融合部分時(shí)，IL2基因可用SEQ ID NO16和SEQ IDNO17為引物通過PCR獲得。SEQ ID NO16(5’引物)包括一個(gè)EcoR I酶切位點(diǎn)，隨后是IL2基因前導(dǎo)序列的前23個(gè)核苷酸；SEQ ID NO17(3’引物)包括SEQ ID NO3序列1-18位核苷酸的互補(bǔ)序列(含有BamHI位點(diǎn))和IL2基因最3’端的互補(bǔ)核苷酸序列(不含終止密碼子)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過EcoR I和BamH I酶切之后，可克隆到實(shí)施例2中描述的表達(dá)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中。所得DNA轉(zhuǎn)染到合適的宿主體系中，即可得到IL2-Fc融合蛋白。
當(dāng)Fc作為N末端的融合部分時(shí)，使用引物SEQ ID NO18(5’引物)和SEQ IDNO19(3’引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。依5’-3’順序，SEQ ID NO18包括SEQ ID NO3序列中13-48的核苷酸序列和位于IL10基因信號(hào)肽之后最5’端成熟編碼序列；SEQID NO19包括Not I酶切位點(diǎn)和IL10最3’端的互補(bǔ)編碼序列(包括天然的終止密碼子TAG)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠分離純化之后，進(jìn)一步使用BamH I和Not I酶切消化。經(jīng)再次凝膠純化，PCR產(chǎn)物可被克隆到經(jīng)BamH I和Not I消化的基本載體中(見實(shí)施例1)。將得到的DNA轉(zhuǎn)染到一個(gè)適合的宿主體系中即可以表達(dá)出所需的Fc-IL10融合蛋白。
如把Fc作為C末端的融合部分時(shí)，IL10基因可用SEQ ID NO20和SEQ IDNO21為引物通過PCR獲得。SEQ ID NO20(5’引物)包括一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，隨后是IL10基因前導(dǎo)序列；SEQ ID NO21(3’引物)包括SEQ ID NO3序列1-18位核苷酸的互補(bǔ)序列(含有BamH I位點(diǎn))和IL10基因最3’端的21個(gè)互補(bǔ)核苷酸序列(不含終止密碼子)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過EcoR I和BamH I酶切之后，可克隆到實(shí)施例2中描述的表達(dá)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中。所得DNA轉(zhuǎn)染到合適的宿主體系中，即可得到IL10-Fc融合蛋白。
實(shí)例3-6所述免疫融合蛋白的瞬表達(dá)可在NS/0或者293細(xì)胞進(jìn)行。107個(gè)宿主細(xì)胞被1-5微克經(jīng)磷酸鈣沉淀處理的線性質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后，經(jīng)過48小時(shí)的培養(yǎng)后，收集含免疫融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液。
為了建立穩(wěn)定及高效表達(dá)實(shí)例3-6所涉及的免疫融合蛋白，線性化表達(dá)載體DNA被用于轉(zhuǎn)染CHO(dhfr-)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在含100nM MTX的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。在其后的4到5周內(nèi)，逐步將MTX濃度增加至5-10μM。選擇后的細(xì)胞可通過限定稀釋成為克隆株。通過用ELISA法測定不同克隆株上清液中的免疫融合蛋白含量，選擇產(chǎn)量較高的克隆株進(jìn)行進(jìn)一步篩選及克隆。最高分泌量的克隆株將被適應(yīng)培養(yǎng)于特殊制作的懸浮培養(yǎng)基中，從而建成可懸浮生長的高產(chǎn)細(xì)胞株。
除磷酸鈣沉淀法外，其他方法如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電轉(zhuǎn)染等均適用于此實(shí)施例的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。這些轉(zhuǎn)染方法的具體描述可詳見Sambrool et al.(1989)MolecularCloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harber，NY。
實(shí)施例8免疫融合蛋白的分析與純化當(dāng)利用常規(guī)凝膠電泳對(duì)免疫融合蛋白進(jìn)行分析時(shí)，培養(yǎng)液中的免疫融合蛋白先被結(jié)合于蛋白A瓊脂糖(Repligen，Cambridge，Mass)上，層析柱經(jīng)PBS清洗后，被結(jié)合的免疫融合蛋白用50mM(pH2.8)甘氨酸從蛋白A洗脫，并經(jīng)凍干法濃縮，進(jìn)而用還原和非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。
免疫融合蛋白的大規(guī)模制備，需將培養(yǎng)液上清通過以PBS平衡的蛋白A瓊脂糖層析柱。與蛋白A結(jié)合的免疫融合蛋白經(jīng)醋酸鈉緩沖液(100mM，pH4)洗脫，且經(jīng)凍干濃縮。經(jīng)此步純化之后的免疫融合蛋白，其純度可達(dá)90％以上，更高的純度可通過1-2次凝膠過濾柱層析達(dá)到。免疫融合蛋白的純度可以用SDS-PAGE和Western印記法(Western blot)加以驗(yàn)證，檢測結(jié)果應(yīng)只顯示一條蛋白帶。使用非還原凝膠電泳得到的免疫融合蛋白的分子量是使用還原凝膠電泳法的2倍，提示免疫融合蛋白為二聚體構(gòu)型。
序列表<110>北京正青星光生物醫(yī)學(xué)科技有限公司<120>重組DNA序列，編碼的免疫融合蛋白及表達(dá)方法<130>PI010725/43<160>21<210>1<211>111<212>DNA<213>人工序列<400>1tcgaattccc caagctggct agccaccatg gagacagaca cactcctgct atgggtactg 60ctgctctggg ttccaggttc cactggtgac gagtccaaat atggtccccca 111<210>2<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>2cccaaaggat ccacctgagc caccttacc cagagacagg gagaggc 47<210>3<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>3ggtggctag gtggatccgg tggaggcgga agcggcggtg gaggatca 48<210>4<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>4ggtggatccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcag agtccaaata tggtccccca 60<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5gcgcggccgc tatttaccca gagacaggga 30<210>6<211>69<212>DNA<213>人工序列<400>6tcaggtggat ccggtggagg cggaagcggc ggtggtggag gatcatgtga tctgcctcaa 60<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>7gcgcggccgc actttcctta cttcttaaa 29<210>8<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>8tcgaattccc caagctggct agccaccatg gccttgacct ttgctttactg 51<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>9cccaaaggat ccacctgagc cttccttact tcttaaactttc 42<210>10<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>10ggtggatccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcat tcccaaccat tcccttatcc 60<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>11gcgcggccgc ctagaagcca cagctgccct 30<210>12<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>12tcgaattccc caagctggct agccaccatg gctacaggct cccggacg 48<210>13<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>13aaggatccac ctgagccacc gaagccacag ctgccctcca c 41<210>14<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>14ggtggatccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcag cacctacttc aagttctac 59<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>15gcgcggccgc tcaagttagt gttgagatga 30<210>16<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>16tcgaattccc caagctggct agccaccatg tacaggatgc aactcctgtc 50<210>17<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>17aaggatccac ctgagccacc agttagtgtt gagatgatgc tttg 44<210>18<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>18ggtggatccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcaa gcccaggcca gggcacccag 60<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>19gcgcggccgc tcagtttcgt atcttcattg t 31<210>20<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>20tcgaattccc caagctggct agccaccatg cacagctcag cactgctc 48<210>21<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>21aaggatccac ctgagccacc gtttcgtatc ttcattgtca t 4權(quán)利要求
1.一種重組DNA序列，其特征在于依5’-3’順序，依次為編碼分泌信號(hào)肽、免疫球蛋白Fc區(qū)、免疫惰性肽連接鏈、以及哺乳類目的蛋白的DNA序列，以上各部份編碼序列均位于同一翻譯框架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組DNA序列，其特征在于其中編碼的哺乳類目的蛋白DNA序列源于人類。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼哺乳類目的蛋白序列為編碼干擾素、白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素10、及生長激素的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組DNA序列，其特征在于其中的分泌信號(hào)肽序列為鼠kappa鏈V-J2-C信號(hào)肽序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組DNA序列，其特征在于其中的免疫惰性肽連接鏈序列為T細(xì)胞免疫惰性肽序列(SEQ ID3)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組DNA序列，其特征在于其中的免疫球蛋白Fc區(qū)為人gamma-4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組DNA序列，其特征在于其中還包含一個(gè)位于分泌信號(hào)肽上游，并可使此重組DNA在哺乳細(xì)胞中有效表達(dá)的啟動(dòng)子序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組DNA序列，其特征在于其中還包含位于其編碼的免疫融合蛋白下游的IRES序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組DNA序列，其特征在于其中包含選擇標(biāo)記序列。
10.一種重組DNA序列，其特征在于依5’-3’順序，依次為編碼分泌信號(hào)肽、哺乳類目的蛋白、免疫惰性肽連接鏈、以及免疫球蛋白Fc區(qū)的DNA序列，以上各部份編碼序列均位于同一翻譯框架。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA序列，其特征在于其中編碼的哺乳類目的蛋白序列源于人類。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述哺乳類目的蛋白序列為編碼干擾素、白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素10、及生長激素的DNA序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA序列，其特征在于其中的分泌信號(hào)肽序列為鼠kappa鏈V-J2-C信號(hào)肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA序列，其特征在于其中的免疫惰性肽連接鏈序列為T細(xì)胞免疫惰性肽序列(SEQ ID3)。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA序列，其特征在于其中的免疫球蛋白Fc區(qū)為人gamma-4。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA序列，其特征在于其中還包含一個(gè)位于分泌信號(hào)肽上游，并可使此重組DNA在哺乳細(xì)胞中有效表達(dá)的啟動(dòng)子序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA序列，其特征在于其中還包含位于其編碼的免疫融合蛋白下游的IRES序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA序列，其特征在于其中包含選擇標(biāo)記序列。
19.一種表達(dá)融合蛋白的方法，其特征在于用權(quán)利要求1-18中所述的任一重組DNA轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞快速生長及高效表達(dá)免疫融合體的方法。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的重組DNA轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞。
21.一種免疫融合蛋白，其特征在于它包含哺乳類目的蛋白，免疫球蛋白的Fc區(qū)及連接它們的惰性肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的一種免疫融合蛋白，其特征在于其中的哺乳類目的蛋白源于人類。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的一種免疫融合蛋白，其特征在于其中的哺乳類目的蛋白為干擾素、白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素10及生長激素。
全文摘要
本發(fā)明涉及以基因重組技術(shù)得到的DNA序列，其編碼的免疫融合蛋白及表達(dá)方法。本發(fā)明重組DNA還可通過加入一個(gè)連接免疫融合蛋白編碼序列及其下游選擇性標(biāo)記序列的核糖體內(nèi)起始位點(diǎn)(IRES)，以提高高產(chǎn)表達(dá)株的篩選效率。將重組的DNAs轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，可表達(dá)出本發(fā)明所涉及的免疫融合蛋白。該免疫融合蛋白可成為在血液循環(huán)中具有較長半衰期的新型生物制品，因而可以作為制備藥物或藥物的組成成分應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1435485SQ0210085
公開日2003年8月13日 申請(qǐng)日期2002年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月1日
發(fā)明者顏林 申請(qǐng)人:北京正青星光生物醫(yī)學(xué)科技有限公司