專利名稱：在乙醇制備中的次級(jí)液化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備乙醇(ethanol)的方法。
背景技術(shù)：
乙醇可廣泛地應(yīng)用于工業(yè)化學(xué)，汽油添加劑或直接的液體燃料。作為燃料或燃料添加劑，乙醇顯著降低氣體排放同時(shí)改進(jìn)發(fā)動(dòng)機(jī)性能。作為可再生的燃料，乙醇顯著降低國(guó)家對(duì)有限的和主要的化石燃料資源的依賴，同時(shí)顯著降低空氣中二氧化碳的凈積累。利用發(fā)酵方法來(lái)制備乙醇。許多公開(kāi)物涉及到通過(guò)發(fā)酵制備乙醇，其中例如US 5,231,017和CA 1,143,677。EP 138428中提到利用乙醇工業(yè)中的液化作用制備黑曲霉α-淀粉酶。
需要進(jìn)一步改進(jìn)乙醇的制備方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種通過(guò)發(fā)酵制備乙醇的方法，該方法包括在熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的(maltogenic)酸性(acid)α-淀粉酶存在下的次級(jí)液化作用步驟。特別是，提供了一種基于作為包含淀粉的原料的整個(gè)谷物(whole grain)來(lái)制備乙醇的改進(jìn)方法。
因此，本發(fā)明涉及一種自包含淀粉的原料制備乙醇的方法，所述包含淀粉的原料，優(yōu)選的是基于整個(gè)谷物，該方法包括下述步驟(a)在α-淀粉酶存在下，包含淀粉的原料的液化作用；(b)噴射式蒸煮(jet cooking)；(c)在熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的次級(jí)液化作用步驟；和(d)糖化作用和發(fā)酵作用以制備乙醇；其中步驟(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的順序進(jìn)行。
本發(fā)明的方法在步驟a)，(b)，(c)和(d)之前，之間和/或之后還可包括一或多個(gè)附加的步驟，例如，諸如在步驟(d)之后回收乙醇。
本發(fā)明還涉及通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的或可獲得的產(chǎn)物以及該產(chǎn)物的用途，例如，作為燃料酒精或添加劑。
本發(fā)明進(jìn)一步地還涉及尤其是在自整個(gè)谷物(whole grain)制備乙醇的方法的次級(jí)液化作用步驟中，熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶的用途。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示的是按照本發(fā)明的一實(shí)施方案制備乙醇的方法流程圖。初級(jí)液化作用步驟可以通過(guò)在淤漿槽中存在的α-淀粉酶進(jìn)行實(shí)施而次級(jí)液化作用的步驟在圖中稱為“液化作用”。
發(fā)明詳述乙醇的制備本發(fā)明提供一種制備乙醇的方法，尤其是在自干磨(dry milled)的整個(gè)谷物制備乙醇的方法中改進(jìn)次級(jí)液化作用的步驟。
本發(fā)明涉及一種通過(guò)發(fā)酵制備乙醇的方法，該方法包括在熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的次級(jí)液化作用步驟。一種特別有意義的實(shí)施方案涉及本發(fā)明的發(fā)酵方法，其中原料是已被分割成精細(xì)部分的整個(gè)谷物，優(yōu)選的是通過(guò)干磨法進(jìn)行。
因此，本發(fā)明一方面涉及一種自包含淀粉的原料制備乙醇的方法，該方法包括(a)在α-淀粉酶存在下，包含淀粉的原料的液化作用；(b)噴射式蒸煮；(c)在熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶存在下的液化作用；(d)糖化作用和發(fā)酵作用以制備乙醇；其中步驟(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的順序進(jìn)行。
原料在一實(shí)施方案中，含淀粉的原料選自塊莖，根和整個(gè)谷物；以及前面的任意組合。在一實(shí)施方案中，含淀粉的原料得自谷類。含淀粉的原料可以，例如選自玉米，玉米芯(cobs)，小麥，大麥，木薯，高粱，黑麥，買羅高粱(milo)和馬鈴薯；或前面的任意組合。
在本發(fā)明的乙醇制備方法中，原料優(yōu)選的是整個(gè)谷物或至少是整個(gè)谷物的主要部分。包含許多種類淀粉的整個(gè)谷物可以用作原料，包括玉米(corn(maize))，買羅高粱，馬鈴薯，木薯，高粱，小麥和大麥。
因此，在一實(shí)施方案中，包含淀粉的原料是整個(gè)谷物，其選自玉米，買羅高粱，馬鈴薯，木薯，高粱，小麥和大麥；或前面的任意組合。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含淀粉的原料是選自谷物，小麥和大麥或其任意組合的整個(gè)谷物。
原料還可以由淀粉加工的例流物組成或包括淀粉加工的側(cè)流物(sidestreem)-例如包含不適合制備漿的C6碳水化合物加工流物(processstreams)。在其它的實(shí)施方案中，原料不由自淀粉加工的側(cè)流物組成或不包括自淀粉加工的側(cè)流物。
處理步驟本發(fā)明的主要處理步驟在一實(shí)施方案中描述，分為下面的主要方法階段粉碎(在整個(gè)谷物用作原料時(shí))，初級(jí)液化作用，通過(guò)噴射式蒸煮進(jìn)行熱處理，次級(jí)液化作用，糖化作用，發(fā)酵，蒸餾。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在步驟(a)前的下述步驟i)干磨整個(gè)谷物；和ii)形成包括磨過(guò)的谷物和水的漿。
制備酒精的個(gè)別的處理步驟可以分批的或連續(xù)地進(jìn)行。對(duì)于其中所有的處理步驟分批進(jìn)行的本發(fā)明的方法或其中所有的處理步驟連續(xù)進(jìn)行的本發(fā)明的方法，或其中一或多個(gè)處理步驟分批進(jìn)行而一或多個(gè)處理步驟連續(xù)流(continuous flow)進(jìn)行的本發(fā)明的方法同等考慮。
級(jí)聯(lián)的方法是其中一或多個(gè)處理步驟以連續(xù)進(jìn)行的方法的實(shí)例并為本發(fā)明所考慮。級(jí)聯(lián)方法進(jìn)一步的信息和其它的乙醇方法可查閱The AlcoholTextbook.Ethanol production by fermentation and distillation.Eds.T.P.Lyons，D.R.Kesall and J.E.Murtagh.Nottingham University Press1995。
粉碎(milling)因此，在本發(fā)明方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含淀粉的原料是整個(gè)谷物，并且該方法包括在步驟a)前，即在初級(jí)液化作用前粉碎整個(gè)谷物的步驟。換句話說(shuō)，本發(fā)明還包括本發(fā)明的方法，其中包含淀粉的原料可通過(guò)包括粉碎整個(gè)谷物的方法獲得，優(yōu)選的是例如通過(guò)錘磨機(jī)或軋磨機(jī)(roller mils)的干磨。磨碎(grinding)也被理解為粉碎(milling)。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括在初級(jí)液化作用步驟前(即在步驟(a)前)的步驟，該步驟為i.粉碎整個(gè)谷物；ii形成包括已粉碎谷物和水的漿以獲得含淀粉的原料。
粉碎整個(gè)谷物以展開(kāi)結(jié)構(gòu)并且允許進(jìn)一步的加工。在酒精制備中正常地使用兩種粉碎方法濕或干磨。術(shù)語(yǔ)“干磨”表示粉碎整個(gè)谷物。在干磨中整個(gè)谷物被碾磨并用于該方法的其余部分。濕磨法(wet milling)能很好地將胚(germ)和粉(淀粉顆粒和蛋白)分離，但在其中并聯(lián)制備漿的位置有例外。
因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，由于包括次級(jí)液化作用步驟的干磨法有利制備乙醇，所以使用干磨法。
液化作用在液化作用方法中，降解(水解)包含淀粉的原料(優(yōu)選的是粉碎過(guò)的整個(gè)谷物原料形式)生成麥芽糖糊精(糊精)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明初級(jí)液化作用方法中，水解包含淀粉的原料(優(yōu)選的是粉碎過(guò)的整個(gè)谷物原料形式)成DE(葡萄糖等價(jià)物的縮寫)高于4。DE代表“葡萄糖等價(jià)物”，并用來(lái)測(cè)定還原C6糖類的末端。純的葡萄糖的DE為100。葡萄糖(也稱葡糖)是還原糖，無(wú)論淀粉酶何時(shí)水解淀粉中葡萄糖-葡萄糖鍵，會(huì)暴露兩個(gè)新的葡萄糖末端基團(tuán)。至少其中之一可用作還原糖。因此，在還原糖中測(cè)定水解的程度升高。所得值與基于純葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較-由此得到術(shù)語(yǔ)葡萄糖等價(jià)物。DE可以例如利用純葡萄糖為參照，使用Fehlings液體通過(guò)與淀粉形成銅絡(luò)合物測(cè)定，接著通過(guò)碘滴定來(lái)定量。換而言之樣品中的DE(葡萄糖等價(jià)物定義為還原糖類(測(cè)定葡萄糖等價(jià)物)的量)表示為溶解干物質(zhì)的總量的w/w％。還可通過(guò)新亞銅試劑試驗(yàn)(neocuproine assay)(Dygert，LiFloridana(1965)Anal.Biochem.No 368)測(cè)定。新亞銅試劑試驗(yàn)的原理是將CuSO4加入到樣品中，通過(guò)還原糖和還原Cu2+，形成的新亞銅試劑絡(luò)合物在450nm測(cè)定。
通過(guò)酸處理或酶處理進(jìn)行水解。液化作用，優(yōu)選的是進(jìn)行酶處理，優(yōu)選的是α-淀粉酶處理。在一實(shí)施方案中，通過(guò)下述進(jìn)行液化作用，制備包括粉碎的原料的漿(優(yōu)選的是粉碎的整個(gè)谷物)和水，加熱漿到60-95℃，優(yōu)選80-85℃，將酶加到引發(fā)液化作用(thinning)。這也稱為“初級(jí)液化作用”，即在處理步驟噴射式蒸煮(jet-cooking)(步驟(b))前發(fā)生。本發(fā)明方法中的液化作用在任何適合所研究酶的條件下(即，例如pH，溫度，和時(shí)間)進(jìn)行。在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)，其中步驟(a)的液化作用在60-95℃進(jìn)行10-120分鐘，優(yōu)選的是在75-90℃進(jìn)行15-40分鐘。在一實(shí)施方案中，步驟(a)的液化作用在約pH4-7的范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選的是約pH4.5-6.5。漿的pH值調(diào)節(jié)與否取決于所用酶的性質(zhì)。因此，在一實(shí)施方案中pH調(diào)節(jié)為例如通過(guò)添加NH3例如上調(diào)約1個(gè)單位。所調(diào)節(jié)的pH在添加α-淀粉酶時(shí)有利于進(jìn)行。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，不能調(diào)節(jié)pH，并且α-淀粉酶具有相應(yīng)合適的pH活性模式，例如在pH約為4時(shí)有活性。
初級(jí)液化作用步驟之后，優(yōu)選的是將漿在合適的條件下進(jìn)行噴射式蒸煮以進(jìn)一步使淀粉凝膠化，例如，諸如在溫度為95-140℃，優(yōu)選的是105-125℃以確保凝膠化。在一實(shí)施方案中，步驟(b)中的噴射式蒸煮在下述條件下進(jìn)行1-10分鐘，105-150℃和例如pH4-7；優(yōu)選的是1-5分鐘，105-120℃和例如pH4.5-6；諸如，例如約5分鐘，約105℃，和例如pH約5.0。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)噴射式蒸煮一般也包括獲得相似結(jié)果的任何其它的方法。
然后優(yōu)選的是將漿冷卻，例如到約60-95℃，并且將更多的酶加入以獲得最終的水解；后者稱為“次級(jí)液化作用”。即噴射式蒸煮之后的液化作用，通過(guò)本發(fā)明的方法添加至少熱穩(wěn)定的酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶獲得。
步驟(c)中的次級(jí)液化作用在合適的條件(pH，溫度，和處理時(shí)間)下進(jìn)行。步驟(c)中的次級(jí)液化作用可以例如在60-95℃，10-120分鐘，優(yōu)選的是70-85℃，15-80分鐘，pH4.5-6.5。在一實(shí)施方案中，對(duì)于次級(jí)液化作用不能調(diào)節(jié)pH。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，次級(jí)液化作用期間的pH至多約5。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)方法的次級(jí)液化作用步驟中包含例如得自干磨整個(gè)谷物的淀粉的原料水解成DE的范圍約為5-15，例如8-15，8-14，諸如例如約范圍10-14的DE，例如約10-12。
液化作用的方法(初級(jí)和次級(jí)液化作用的方法)在合適的pH下進(jìn)行，例如pH4.5-6.5，例如pH在約5和pH約6之間。
粉碎的和液化作用的整個(gè)谷物也被認(rèn)為是醪液(mash)。
糖化作用通過(guò)酵母產(chǎn)生可被新陳代謝的低分子量的糖DP1-2，優(yōu)選的是進(jìn)一步水解自液化作用的產(chǎn)麥芽糖糊精；這也稱為“糖化作用”。在葡糖淀粉酶存在下通過(guò)酶解進(jìn)行水解。除了葡糖淀粉酶外，也可存在α-糖甙酶和/或酸性α-淀粉酶。
充分的糖化作用持續(xù)可達(dá)到72小時(shí)。然而，糖化作用和發(fā)酵(SSF)可以結(jié)合，并且在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中可以包括1-4小時(shí)的預(yù)糖化作用步驟。預(yù)糖化作用在任何合適的方法條件下進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)糖化作用在30-65℃，例如約60℃，和在例如pH的范圍為4-5，尤其在約pH4.5下進(jìn)行。
因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括預(yù)糖化作用步驟，如本文所描述的，其可在次級(jí)液化作用步驟(c)之后和步驟(d)之前進(jìn)行。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法不包括預(yù)糖化作用步驟并且糖化作用用僅在發(fā)酵期間是必需進(jìn)行的，例如通過(guò)存在葡糖淀粉酶和可選擇的植酸酶下。
發(fā)酵將發(fā)酵所用的微生物添加到醪液中。發(fā)酵一直進(jìn)行到產(chǎn)生出所需量的乙醇；這可以，例如進(jìn)行24-96小時(shí)，例如35-60小時(shí)。發(fā)酵期間的溫度和pH為適合所研究的微生物的溫度和pH，例如，諸如溫度范圍約為26-34℃，例如約32℃，并且pH在約pH3-6的范圍，例如約pH4-5。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，實(shí)施同時(shí)進(jìn)行的糖化作用和發(fā)酵(SSF)方法，其中糖化作用沒(méi)有遲滯階段，這表明酵母和糖化作用的酶基本上一起加入。在一實(shí)施方案中，剛好在發(fā)酵之前，在溫度高于50℃下，將SSF引入預(yù)糖化作用步驟。
在一實(shí)施方案中，在葡糖淀粉酶和/或蛋白酶存在下實(shí)施發(fā)酵。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中次級(jí)液化作用步驟中添加熱穩(wěn)定的酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶有可能替代發(fā)酵步驟中存在的葡糖淀粉酶的活性。因此，涉及本發(fā)明制備乙醇的方法的一實(shí)施方案，在添加發(fā)酵步驟中或在發(fā)酵步驟前沒(méi)有添加葡糖淀粉酶。
蒸餾本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括回收乙醇；因此酒精可以從發(fā)酵的材料中分離出并純化。接著發(fā)酵，可蒸餾醪液以提取乙醇。純度達(dá)到例如約96vol.％乙醇的乙醇可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得。
因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括(e)蒸餾以獲得乙醇。步驟(d)中的發(fā)酵和步驟(e)中的蒸餾可同時(shí)和/或分別/依次地進(jìn)行；任選地可以后接一或多個(gè)處理步驟以進(jìn)一步地精制乙醇。
蒸餾的副產(chǎn)品和再循環(huán)在本發(fā)明方法的一實(shí)施方案中，自蒸餾方法中的水成的副產(chǎn)品(″酒糟物(Whole Stillage)″，cf.圖1)分為兩種級(jí)分，例如通過(guò)離心1)″濕谷物(Wet Grain)″(固相，見(jiàn)圖1)，和2)″酒糟水(Thin Stillage)″(上清，見(jiàn)圖1)。
在一實(shí)施方案中，進(jìn)入本發(fā)明方法中的含淀粉的原料為干磨過(guò)的整個(gè)谷物，本發(fā)明的方法包括步驟(a)，(b)，(c)，(d)，和(e)及進(jìn)一步包括步驟(f)分離步驟(e)中蒸餾產(chǎn)生的酒糟物，為濕谷物和酒糟水；和(g)在初級(jí)液化作用步驟(a)之前再回收酒糟水至包含淀粉的原料。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法，酒糟水(cf.圖1)被再循環(huán)到磨碎的整個(gè)谷物漿。
典型的在轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)中干燥濕谷物的級(jí)分。干燥的產(chǎn)物稱為″ 蒸餾器變干谷物(Distillers Dried Grain)”(見(jiàn)圖1)，可用作例如動(dòng)物飼料。
蒸發(fā)酒糟水級(jí)分提供兩級(jí)分(見(jiàn)圖1)(i)4-6％DS的冷凝物(Condensate)級(jí)分(主要為淀粉，蛋白質(zhì)，和細(xì)胞壁成分)，和(ii)漿(Syrup)級(jí)分，主要由極限糊精和不可發(fā)酵的糖組成，可以與濕谷物(Wet Grains)(來(lái)自酒糟物分離步驟)一起引入以提供稱為″蒸餾器變干谷物″的產(chǎn)品，其也可用作動(dòng)物飼料。
術(shù)語(yǔ)″酒糟水″用于酒糟物的上清(見(jiàn)圖1)，典型的，酒糟水包含4-6％DS(主要為淀粉，蛋白質(zhì))以及溫度約為60-90℃。
本發(fā)明另一實(shí)施方案中，酒糟水不再循環(huán)，但蒸發(fā)酒糟水的冷凝流再循環(huán)至包含磨過(guò)的整個(gè)谷物的漿以噴射蒸煮。
本發(fā)明的一實(shí)施方案涉及制備乙醇的方法，該方法包括下面的步驟(a)在有α-淀粉酶活性下，包含淀粉的原料的初級(jí)液化作用；(b)噴射式蒸煮步驟(a)的材料；(c)在熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的步驟(b)的材料的次級(jí)液化作用；和(d)糖化作用和發(fā)酵作用以制備乙醇；其中步驟(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的順序進(jìn)行。
任選地糖化作用和發(fā)酵可以分步進(jìn)行。因此，本發(fā)明還涉及制備乙醇的方法，該方法包括下面的步驟(a)在有α-淀粉酶活性下，包含淀粉的原料的初級(jí)液化作用；(b)噴射式蒸煮步驟(a)的材料；(c)在熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的步驟(b)的材料的次級(jí)液化作用；和(d)糖化作用；(e)發(fā)酵作用以制備乙醇；其中步驟(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的順序進(jìn)行，并且其中同時(shí)或接著(d)進(jìn)行(e)。
本發(fā)明還涉及制備乙醇的方法，該方法包括下面的步驟a)干磨整個(gè)谷物；b)形成包括已粉碎谷物和水的漿；c)在α-淀粉酶存在下的液化作用；(d)噴射式蒸煮；(e)在熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的次級(jí)液化作用；(f)在植酸酶和/或葡糖淀粉酶存在下進(jìn)行糖化作用和發(fā)酵作用以制備乙醇；(g)蒸餾任選地后接一或多個(gè)步驟以進(jìn)一步提煉乙醇；
其中步驟(a)，(b)，(c)，(d)，(e)和(f)按照(a)，(b)，(c)，(d)，(e)和(f)的順序進(jìn)行；和其中步驟(g)同時(shí)與步驟(f)和/或在其后進(jìn)行。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明制備乙醇的方法，可包括下面的步驟a)粉碎整個(gè)谷物；b)形成包括已粉碎整個(gè)谷物和水的漿；c)在α-淀粉酶存在下進(jìn)行液化作用；(d)在葡糖淀粉酶存在下進(jìn)行糖化作用和利用微生物進(jìn)行發(fā)酵；(f)蒸餾發(fā)酵的材料，提供兩種流1)酒精和2)酒糟物；(g1)回收酒精以進(jìn)一步提煉；任選地，(g2)分離酒糟物為二級(jí)分1)濕谷物，和2)酒糟水；(h1)干燥整個(gè)谷物級(jí)分以提供包含產(chǎn)物的蛋白質(zhì)，和任選地(h2)蒸發(fā)酒糟水，提供兩種流1)冷凝流和2)漿；其中在有或沒(méi)有進(jìn)一步的處理下，酒糟水和任選地自步驟(h2)的冷凝液再循環(huán)到步驟(b)。酶活性α-淀粉酶“初級(jí)液化作用”優(yōu)選的是在存在例如衍生自微生物或植物的α-淀粉酶下進(jìn)行。優(yōu)選的α-淀粉酶是真菌或細(xì)菌源。根據(jù)本發(fā)明特別考慮的是芽孢桿菌屬α-淀粉酶(常指的是“Termamyl樣的(Termamyl-like)α-淀粉酶”)，變體，和其雜種。熟知的Termamyl樣α-淀粉酶包括衍生自地衣芽孢桿菌(商品化購(gòu)得為TermamylTM)，解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株的α-淀粉酶。其它Termamyl樣α-淀粉酶包括衍生自芽孢桿菌菌株NCIB12289，NCIB 12512，NCIB 12513或DSM 9375，所有這些在WO 95/26397中詳述，以及由Tsukamoto等，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31所述的α-淀粉酶。本發(fā)明中Termamyl樣α-淀粉酶是在WO 99/19467中3頁(yè)18行到6頁(yè)27行所定義的α-淀粉酶。所研究的變體和雜種在WO 96/23874，WO 97/41213，和WO99/19467中描述，并且包括嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)變體，α-淀粉酶TTC，與WO 99/19467中公開(kāi)的SEQ ID NO3所示的野生型氨基酸序列相比具有下面的突變?chǔ)?181-182)+N193F(也表示I181*+G182*+N193F)。所研究的α-淀粉酶衍生自曲霉屬的菌株包括米曲酶和黑曲霉。
商業(yè)的α-淀粉酶產(chǎn)物和包含α-淀粉酶的產(chǎn)品包含TERMAMYLTMSC，F(xiàn)UNGAMYLTM，LIQUOZYMETMSC和SANTMSUPER，(Novozymes A/S，Denmark)和DEX-LOTM，SPEZYMETMAA，和SPEZYMETMDELTA AA(自Genencor Int.)。
其它所研究的α-淀粉酶是EP 1,022,334中公開(kāi)的KSM-K36α-淀粉酶，保存為FERM BP 6945，以及EP 1,022,334中公開(kāi)的KSM-K38α-淀粉酶，保存為FERM BP-6946。還研究了變體，尤其是丹麥專利申請(qǐng)PA 2000 11533中所公開(kāi)的變體(自Novozymes A/S)。
“次級(jí)液化作用”在存在α-淀粉酶，尤其是在存在本文所述的本發(fā)明方法中次級(jí)液化作用步驟中使用的熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶下進(jìn)行。α-淀粉酶優(yōu)選的是衍生自微生物包括真菌和細(xì)菌或衍生自植物。優(yōu)選的熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶是細(xì)菌源的。優(yōu)選的熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶是真菌源。
應(yīng)理解的是所加入的酶量為用于所述方法的真實(shí)條件下有效量，例如步驟(c)中加入有效量的熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶。
在本發(fā)明方法進(jìn)一步的實(shí)施方案中，除了加入熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶外，還加入不是熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶的α-淀粉酶。
本文一實(shí)施方案中熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶中的術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定”指的是使用0.1M檸檬酸鹽(citrate)緩沖液和4.3mM Ca2+，在pH5.0，達(dá)到90℃時(shí)酶具有活性。
在液化作用和發(fā)酵期間，在所提供的pH例如諸如在pH2.5-5.5使用0.1M檸檬酸鹽緩沖液和4.3mM Ca2+下，熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶應(yīng)具有的活性。所述酶優(yōu)選的是在至少在pH3-5具有活性。應(yīng)理解的是所述酶在所提到的pH范圍外仍具有活性。
本文所用熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶的實(shí)例是選自下述組的α-淀粉酶LE399；米曲酶TAKAα-淀粉酶(EP 238 023)；EP 383,779 B2中公開(kāi)的黑曲霉α-淀粉酶( 部分(還見(jiàn)實(shí)施例1中黑曲霉基因克隆)；EP 140,410的實(shí)施例1中公開(kāi)的黑曲霉α-淀粉酶；商業(yè)真菌黑曲霉α-淀粉酶FUNGAMYL(Novozymes A/S)；和ClaraseTM(自Genencor Int.，USA)，后者均源自曲霉屬。
LE399是雜交的α-淀粉酶。具體地，LE399包括地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的445 C-末端氨基酸殘基(在WO 99/1946 7中SEQ ID NO4所示)和源自解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(在WO 99/19467中SEQ ID NO5表示)的37N-末端氨基酸殘基，具有下面的取代G48A+T491+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467中SEQ ID NO4編號(hào))。
通過(guò)“熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶存在下的次級(jí)液化作用”應(yīng)理解為通過(guò)如本文所定義的有效量的熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶處理，本發(fā)明方法的次級(jí)液化作用步驟中的液化作用。
使用例如下面的方法950微升0.1M檸檬酸鹽+4.3mM Ca2+緩沖液在60℃溫育1小時(shí)來(lái)檢測(cè)熱/pH穩(wěn)定性。添加緩沖液(4AFAU/ml)中50微升酶。在0和60分鐘時(shí)取出2×40微升樣品并在冰上冷卻。溫育前(0分鐘)測(cè)定的活性(AFAU/ml)用作參考(100％)。百分比的下降計(jì)算為溫育時(shí)間的函數(shù)。為了測(cè)定熱穩(wěn)定性，使用不同的溫度，例如50，60，70，80，90℃重復(fù)試驗(yàn)。為了測(cè)定pH穩(wěn)定性，使用不同的pH例如pH2.5；3；3.5；4；4.5；5，重復(fù)試驗(yàn)。
本發(fā)明方法的α-淀粉酶，特別是熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶的實(shí)例是具有SEQ ID NO1(也稱SP288)中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶和其變體，與SEQ ID NO1的氨基酸序列相比該變體具有一或多個(gè)氨基酸殘基缺失，取代和/或插入；變體具有α-淀粉酶的活性，優(yōu)選的是熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶。
因此，本發(fā)明方法的次級(jí)液化作用步驟中所用的α-淀粉酶可以是例如α-淀粉酶，尤其是熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶，具有與SEQ ID NO1有至少70％的同一性，優(yōu)選的是與SEQ ID NO1有至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％，或至少99％的同一性。在本發(fā)明中，兩種氨基酸序列間的同一性程度通過(guò)以％所給的參數(shù)“同一性”描述。為了本發(fā)明的目的，兩種氨基酸序列間的同一性程度優(yōu)選的是通過(guò)Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)和同一性表以及下面的序列多重對(duì)比參數(shù)缺口罰(Gap penalty)10，gap length penalty(缺口長(zhǎng)度罰)10。Pairwise序列對(duì)比參數(shù)Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口(windows)＝5，對(duì)角線(diagonals)＝5。
因此，本發(fā)明方法中所用的熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶可以例如也是α-淀粉酶，尤其是熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶，具有SEQ IDNO1片段的氨基酸序列。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)例如SEQ ID NO1的變體和片段的“α-淀粉酶”或“熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶”時(shí)，應(yīng)理解的是該酶具有酶活性。本文所用SEQ ID NO1的“片段”是具有自該氨基酸序列的胺基和/或羧基末端缺失的一或多個(gè)氨基酸的多肽。優(yōu)選的是，片段包含至少50個(gè)氨基酸殘基或100個(gè)氨基酸殘基。
由SEQ ID NO1所給的酶也在Boel E.等中公開(kāi)“在α-淀粉酶中的鈣的結(jié)合兩種自曲霉屬的酶的X-射線衍射的研究在2.1-A解析”。Biochemistry，296244-6249，Publ.Year1990，例如在表1中和“材料與方法”的相同。
在本發(fā)明方法次級(jí)液化作用步驟中所使用的α-淀粉酶是在由Guy-Jean Moulin和Pierre Galzy的Agric.Biol.Chem.，431165-1171，1979中公開(kāi)的α-淀粉酶。
應(yīng)理解的是本發(fā)明實(shí)際條件(溫度，pH)添加有效量的酶，例如在步驟(c)中添加有效量的熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在次級(jí)液化作用步驟中除了添加熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶(例如本文所述的SEQ ID NO1的α-淀粉酶和其變體)外，也可添加不是本文所定義的熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶，例如α-淀粉酶TTC。
熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶應(yīng)在液化作用和發(fā)酵期間在所提供的pH下具有活性；例如在pH范圍為pH2.5-5.5使用0.1M檸檬酸鹽緩沖液和4.3mM Ca2+，由DE12α-淀粉酶TTC液化作用在30％干物質(zhì)的谷類淀粉組成的底物。該酶優(yōu)選的是至少在pH3-5，優(yōu)選的是至少pH2.5-5具有活性。應(yīng)理解的是該酶在所提到的pH范圍之外也具有活性。
本文中術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)麥芽糖的(maltogenic)”指的是能釋放相對(duì)高量的酶活性產(chǎn)物的α-麥芽糖的酶。
在一特別有趣的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)麥芽糖的”指的是在60℃，pH4.5使用DE12α-淀粉酶TTC液化的30％干物質(zhì)谷類淀粉的酶和以1AFAU/g干物質(zhì)使用該酶，該酶在24小時(shí)內(nèi)催化基于總量淀粉的至少15％，至少20％，至少25％，至少30w/w麥芽糖的形成。麥芽糖的含量可以例如通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知HPLC測(cè)定。
本文術(shù)語(yǔ)“DE 12α-淀粉酶TTC液化的谷類淀粉”指的是用于檢測(cè)α-淀粉酶產(chǎn)麥芽糖化(maltogenisity)的底物，是用α-淀粉酶TTC液化DE12的谷類淀粉。
術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定”指的是在高溫時(shí)酶相對(duì)穩(wěn)定。在一實(shí)施方案中，該酶可以在70℃使用具有30％的干物質(zhì)的DE12α-淀粉酶TTC液化谷類淀粉作為底物，pH5.5，0.1M檸檬酸鹽緩沖液和4.3mM Ca2+，維持高于其活性90％1小時(shí)。
術(shù)語(yǔ)“酸性”指的是該酶在低pH下相對(duì)穩(wěn)定。在一實(shí)施方案中，在pH3.5-5.0(例如pH4)的范圍維持其高于70％的活性，優(yōu)選的是pH3.8-4.7(例如pH4.2)，在條件DE12α-淀粉酶TTC液化谷類淀粉在30％的干物質(zhì)的底物，溫度40℃，0.1M檸檬酸鹽緩沖液和4.3mM Ca2+。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明次級(jí)液化作用步驟中所用酶的pH窗(window)(模式(profile))如下酶的最大活性發(fā)現(xiàn)在約pH4.2和/或酶在pH3.5-5.0(例如pH4)的范圍維持其高于70％的活性，在條件DE12α-淀粉酶TTC液化谷類淀粉在30％的干物質(zhì)為底物，溫度40℃，0.1M檸檬酸鹽緩沖液和4.3mM Ca2+。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明次級(jí)液化作用步驟中所用α-淀粉酶的溫度窗(window)(模式)如下DE12α-淀粉酶TTC液化谷類淀粉在30％的干物質(zhì)為底物，pH5.5，0.1M檸檬酸鹽緩沖液和4.3mM Ca2+，在溫度50-80℃維持其高于80％的活性。
本發(fā)明次級(jí)液化作用步驟中所用α-淀粉酶可以催化水解β-環(huán)糊精，其是具有SEQ ID NO1的氨基酸序列酶的之一特征。
通過(guò)表達(dá)“熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的次級(jí)液化作用”應(yīng)理解為通過(guò)如本文所定義的有效量的熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶處理，本發(fā)明方法的次級(jí)液化作用步驟中的液化作用。次級(jí)液化作用中所使用的α-淀粉酶優(yōu)選的是熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶。術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶”本文中指的是熱穩(wěn)定，酸性的和產(chǎn)麥芽糖的。在一實(shí)施方案中，本文α-淀粉酶是至少是熱穩(wěn)定的和酸性的。任選的是如本文定義的產(chǎn)麥芽糖的(maltogenic)。
熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶可以在初級(jí)液化作用步驟中實(shí)施；然而，如果在次級(jí)液化作用步驟中添加該酶，會(huì)獲得最大的效果。
糖化作用或SSF期間所用的酶活性葡糖淀粉酶糖化作用步驟或糖化作用和發(fā)酵作用(SSF)同時(shí)進(jìn)行的步驟可以在葡糖淀粉酶存在下實(shí)施。葡糖淀粉酶可以是任何來(lái)源的，例如衍生自微生物或植物。優(yōu)選的是衍生自選自下面組的真菌的或細(xì)菌源的葡糖淀粉酶黑曲霉葡糖淀粉酶，尤其是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel et al.(1984)，EMBO J.t(5)，p.1097-1102)，或其變體，例如WO 92/00381和WO 00/041236中公開(kāi)的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)，米曲酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，5(4)，p.941-949)，或其變體或片段。
其它研究的曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括促進(jìn)熱穩(wěn)定性變體G137A和G139A(Chen et al.(1996)，Prot.Engng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen et al.(1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen et al.(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫鍵，A246C(Fierobe et al.(1996)，Biochemistry，35，8698-8704；在位點(diǎn)A435和S436引入Pro殘基(Li et al.(1997)，Protein Engng.10，1199-1204。此外，Clark Ford于1997年10月17日提交的論文ENZYME ENGINEERING 14，Beijing/ChinaOct 12-17，97，Abstract numberAbstract book p.0-61。摘要表明在泡盛曲霉葡糖淀粉酶位點(diǎn)G137A，N20C/A27C和S30P的突變改進(jìn)熱穩(wěn)定性。其它葡糖淀粉酶包括踝節(jié)菌屬葡糖淀粉酶，尤其是衍生自踝節(jié)菌屬emersonii(WO 99/28448)，踝節(jié)菌屬leycettanus(US patent no.Re.32，153)，踝節(jié)菌屬duponti，踝節(jié)菌屬thermopiles(US patent no.4,587,215)。所研究的細(xì)菌葡糖淀粉酶包括自梭狀芽胞桿菌屬的葡糖淀粉酶，尤其是C.thermoamylolyticum(EP 135,138)，和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)。
商業(yè)的產(chǎn)品包括SANTMSUPERTM和AMGTME(自Novozymes A/S)。
蛋白酶在糖化作用步驟，SSF和/或發(fā)酵步驟中添加蛋白酶，增加FAN(游離氨基氮)的水平，并且增加酵母代謝率，以及進(jìn)一步產(chǎn)生更高的發(fā)酵效率。
合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌的和細(xì)菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是酸性的蛋白酶，即低于pH7的酸性條件下，水解蛋白質(zhì)的能力的特征鑒定的蛋白酶。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該蛋白酶是選自真菌的蛋白酶，例如衍生自曲霉菌屬菌株的酸性真菌蛋白酶。
合適的酸性的真菌蛋白酶類包括衍生自曲霉屬，毛霉屬，酒曲菌屬(Rhizopus)，念珠菌屬，革蓋菌屬，疫病霉屬(Zndothia)，Enthomophtra，耙菌屬(Irpex)，青霉屬，Sclerotiumand Torulopsis的真菌的蛋白酶。尤其考慮的是衍生自黑曲霉(見(jiàn)例如Koaze et al.，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)，A spergillus saitoi(see，e.g.，Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)，泡盛曲霉(Hayashida et al.，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933，棘孢曲霉(WO 95/02044)，或米曲酶，例如pepA蛋白酶；和自微小毛霉(Mucor pusillus)和米赫毛霉的酸性蛋白酶。
還考慮的是中性的或堿性蛋白酶，諸如衍生自芽胞桿菌屬菌株的蛋白酶。不是酸性蛋白酶的細(xì)菌的蛋白酶，包括商業(yè)途徑購(gòu)得的產(chǎn)品Alcalasee和Neutraseo(得自Novozymes A/S)。
其它的酶在糖化作用/預(yù)糖化作用或SSF期間還可使用一種或更多種附加的酶。附加的酶包括例如支鏈淀粉酶和/或植酸酶。因此，在一實(shí)施方案中，為了促進(jìn)發(fā)酵添加葡糖淀粉酶和/或5-植酸酶。
植酸酶本發(fā)明所用的植酸酶可以是任何能影響無(wú)機(jī)磷酸鹽自植酸(肌醇六磷酸)或任何其鹽(肌醇六磷酸鹽)的釋放的酶。植酸酶根據(jù)其在初始水解步驟中的特異性即根據(jù)磷酸酯基團(tuán)首先被水解而分類。本發(fā)明所用植酸酶具有植酸酶的特異性，例如3-植酸酶(EC 3.1.3.8)，6-植酸酶(EC 3.1.3.26)或5-植酸酶。
合適劑量的植酸酶例如在5.000-250.000 FYT/g DS的范圍內(nèi)，尤其是10.000-100.000 FYT/g DS。
植酸酶活性可以測(cè)定FYT單位，一個(gè)FYT為每分鐘釋放1微摩無(wú)機(jī)正磷酸鹽的酶量。在下面的條件下pH5.5；溫度37℃；底物濃度為0.0050mole/l的肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)。
植酸酶可以是任何源的，例如微生物，諸如衍生自Peniophra lycii或米曲酶的菌株。其可以重組或非重組產(chǎn)生。植酸酶可以衍生自例如植物或微生物，例如細(xì)菌或真菌，例如酵母或絲狀真菌。
植物植酸酶可以是來(lái)自小麥麩，玉米，大豆(soy bean)或百合花粉。合適的植物植酸酶描述于Thomlinson et al，Biochemistry，1(1962)，166-171；Barrientos et al，Plant.Physio.，106(1994)，1489-1495；WO 98/05785；WO 98/20139。
細(xì)菌酶可以自芽胞桿菌屬(Bacillus)，假單胞菌屬或埃希氏桿菌屬(Escherichia)，特別是枯草芽孢桿菌或E.coli.。合適的細(xì)菌植酸酶描述于Paver and Jagannathan，1982，Journal of Bacteriology 1511102-1108；Cosgrove，1970，Australian Journal of Biological Sciences231207-1220；Greiner et al，Arch.Biochem.Biophys.，303，107-113，1993；WO 98/06856；WO 97/33976；WO 97/48812。
酵母植酸酶或肌醇單磷酸酶可以衍生自糖酵母屬(Saccharomyces)或許旺氏酵母屬，特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或西方許旺氏酵母。前者的酶已描述為合適的酵母植酸酶，描述于Nayini et al，1984，Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 1724-26；Wodzinski etal，Adv.Appl.Microbiol.，42，263-303；AU-A-24840/95；絲狀真菌的植酸酶可以是衍生自Ascomycota(ascomycetes)fungalphylum或phylum Basidiomycota，例如曲霉屬，Thermomyces(也稱腐質(zhì)菌屬)，毀絲霉屬，Manascus，青霉屬，隔孢伏革菌屬，田頭菇屬，Paxillus，或栓菌屬，特別是土曲霉，黑曲霉，黑曲霉var.awamori，無(wú)花果曲霉，T.lanuginosus(也稱為H.lanuginosa)，毀絲霉屬thermophila，隔孢伏革菌屬lycii，平田頭菇(Agrocybe pediades)，Manascus anka，Paxillusinvoltus，或絨毛栓菌。合適的真菌植酸酶描述于Yamada et al.，1986，Agric.Biol.Chem.3221275-1282；Piddington et al.，1993，Gene 13355-62；EP 684,313；EP 0 420 358；EP 0 684 313；WO 98/28408；WO 98/28409；JP 767635；WO 98/44125；WO 97/38096；WO 98/13480。
修飾的植酸酶或植酸酶變體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法獲得。尤其是在EP 897010；EP 897985；WO 99/49022；WO 99/48330中公開(kāi)的方法。
用于發(fā)酵的微生物優(yōu)選的是(d)步驟中使用微生物發(fā)酵。微生物可以是真菌微生物，例如酵母或細(xì)菌。合適的細(xì)菌可以是例如發(fā)酵單胞菌屬的種，例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，和E.Coli。絲狀真菌的實(shí)例包括青霉屬種的菌株。用于乙醇制備的生物體優(yōu)選的是酵母，例如畢赤氏酵母屬或糖酵母屬(Sacharomyces)。本發(fā)明優(yōu)選的酵母是糖酵母屬的種，尤其是釀酒酵母或面包糖酵母。
通過(guò)本發(fā)明方法制備的產(chǎn)品的用途本發(fā)明方法得到的乙醇可以用于例如燃料乙醇；飲用乙醇，及可飲用的中度烈酒，或工業(yè)乙醇包括燃料添加劑。
另一方面，本發(fā)明涉及在制備乙醇的方法中的次級(jí)液化作用步驟中熱穩(wěn)定的酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶的用途；包括本發(fā)明公開(kāi)的方法中的次級(jí)液化作用步驟中熱穩(wěn)定的酸性α-淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶的用途。
本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)通過(guò)實(shí)施本發(fā)明次級(jí)液化作用步驟中熱穩(wěn)定的酸性α-淀粉酶，本發(fā)明方法提供了一種改進(jìn)的制備乙醇的方法。通過(guò)本發(fā)明的方法提高了總產(chǎn)量和/或加工的經(jīng)濟(jì)性。本發(fā)明的方法有可能降低發(fā)酵時(shí)間。而且，本發(fā)明的方法可以促進(jìn)發(fā)酵效率，例如通過(guò)降低殘留的淀粉而不會(huì)殘留在發(fā)酵中。而且，本發(fā)明的方法可以降低或消除預(yù)糖化作用步驟的需要。
通過(guò)實(shí)施本發(fā)明次級(jí)液化作用步驟中熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶，本發(fā)明方法提供了一種改進(jìn)的制備乙醇的方法。通過(guò)本發(fā)明的方法提高了總產(chǎn)量和/或加工的經(jīng)濟(jì)性。所述的熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶在用于次級(jí)液化作用步驟時(shí)，與目前使用非產(chǎn)麥芽糖的α-淀粉酶相比，產(chǎn)生更高量的可發(fā)酵的糖(麥芽糖)。這會(huì)減少發(fā)酵時(shí)間和/或葡糖淀粉酶的劑量，葡糖淀粉酶是形成可發(fā)酵糖必須的。與非產(chǎn)麥芽糖的α-淀粉酶相比，由于形成低分子量的分子，粘度會(huì)降低。降低粘度是在例如熱交換器和干燥器中所希望的。而且，發(fā)酵情況中，熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶具有活性，并且由于該酶具有內(nèi)降解(endo-breakdown)機(jī)制，它可以與葡糖淀粉酶組合，葡糖淀粉酶是胞外酶，能夠更有效地在發(fā)酵期間水解淀粉。因此本發(fā)明的方法有可能降低發(fā)酵時(shí)間。本發(fā)明方法可以促進(jìn)發(fā)酵效率，例如通過(guò)降低殘留的淀粉而不是殘留在發(fā)酵中。而且，本發(fā)明的方法可以降低或消除預(yù)糖化作用步驟的需要。
材料與方法測(cè)定粘度基于處理加熱醪液到50-70℃。使用基于Haake VT02 rotation粘度計(jì)測(cè)定下面的粘度處理。粘度單位是厘泊(cps)，其與粘度水平成比例。
測(cè)定α-淀粉酶的活性(KNU)KNU用于測(cè)定具有高pH最適度的細(xì)菌α-淀粉酶。
Phadebas試驗(yàn)α-淀粉酶活性通過(guò)實(shí)施Phadebas片劑為底物的方法測(cè)定。Phadebas片劑(PhadebasAmylase Test，由Pharmacia Diagnostic提供)包含交聯(lián)的不能溶解的藍(lán)色淀粉聚合物，其已經(jīng)用牛血清蛋白和緩沖物混合并片劑化。
對(duì)于每一單獨(dú)的測(cè)量，將一片劑懸浮于含5ml 50mM Britton-Robinson緩沖液中(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl2，pH用NaOH調(diào)整為所需值)。在所需溫度下水浴中實(shí)施檢測(cè)。將待檢的α-淀粉酶稀釋到x ml的50mM Britton Robinson緩沖液中。將1ml該α-淀粉酶溶液加入到5ml 50mM Britton Robinson緩沖液中。α-淀粉酶水解該淀粉可給出可溶的藍(lán)色片段的。所得藍(lán)色溶液的吸光度，在620nm分光光度測(cè)定，為α-淀粉酶的活性。
重要的是溫育10或15分鐘(檢測(cè)時(shí)間)之后所測(cè)的620nm吸光度在620nm在0.2到2.0吸光度單位的范圍之內(nèi)。在該吸光度范圍之內(nèi)，活性與吸光度間是線性的(Lambert-Beer law)。酶的稀釋必須由此調(diào)整到適合該標(biāo)準(zhǔn)。在特定組的反應(yīng)條件(溫度，pH，反應(yīng)時(shí)間，緩沖條件)下，1mg所給α-淀粉酶水解一定量底物，并且產(chǎn)生藍(lán)色。藍(lán)色強(qiáng)度在620nm測(cè)定。所測(cè)的吸光度與在所給定組條件下α-淀粉酶的特異性活性(活性/純?chǔ)?淀粉酶蛋白mg)成正比。
備選方法通過(guò)采用PNP-G7底物的方法測(cè)定α-淀粉酶活性。PNP-G7是p-硝基苯-α，D-maltoheptaoside的縮寫，它是封閉的低聚糖，可通過(guò)內(nèi)淀粉酶切割。切割之后，包括在試劑盒中的α糖甙酶消化底物以釋放游離的黃色的PNP分子，由此可通過(guò)可見(jiàn)的光譜測(cè)定法(spectophometry)于λ＝405nm(400-420nm.)測(cè)定。包含PNP-G7底物和α-糖甙酶的試劑盒通過(guò)Boehringer-Mannheim(cat.No.1054635)制備。
為制備底物，添加一瓶底物(BM 1442309)到5ml緩沖液(BM1442309)中。為制備α-糖甙酶，添加一瓶α-糖甙酶(BM 1462309)到45ml緩沖液(BM1442309)中。通過(guò)混合5mlα-糖甙酶溶液和0.5ml底物制備使用液。
實(shí)施該試驗(yàn)轉(zhuǎn)移20微升酶溶液到96孔微量滴定板并于25℃溫育。25℃添加200微升使用液?；旌先芤翰㈩A(yù)溫育1分鐘，在OD 405nm在3分鐘時(shí)間里每15秒測(cè)定吸光度。
時(shí)間依賴吸光度曲線的斜率正比于在所給定組條件下α-淀粉酶的特異性活性(每mg酶的活性)FAU活性的測(cè)定一真菌α-淀粉酶的單位(FAU)定義為基于下面的標(biāo)準(zhǔn)條件每小時(shí)破碎5.26g淀粉(Merck Amylum solubile Erg.B.6，Batch 9947275)的酶量底物 可溶的淀粉溫度37℃pH 4.7反應(yīng)時(shí)間7-20分鐘酸性α-淀粉酶的活性(AFAU)測(cè)定酸性α-淀粉酶的活性在AFAU(酸性真菌α-淀粉酶的單位)中測(cè)定，其是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)酶測(cè)定。
所用標(biāo)準(zhǔn)為AMG 300 L(自Novozymes A/S，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉G1，公開(kāi)于Boel et al.(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)和WO92/00381)。在該AMG中中性α-淀粉酶室溫下儲(chǔ)存3周后自約1 FAU/mL降低到低于0.05FAU/mL。
在該AMG標(biāo)準(zhǔn)中酸性α-淀粉酶按照下面的描述測(cè)定。該方法中，1 AFAU定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下每小時(shí)降解5.260mg淀粉干物質(zhì)的酶量。
碘形成與淀粉的藍(lán)色絡(luò)合物，但沒(méi)有產(chǎn)物降解。藍(lán)色的強(qiáng)度由此與淀粉的濃度成正比。使用反比色法測(cè)定淀粉酶活性為特定分析條件下淀粉濃度的降低。
α-淀粉酶淀粉+碘→糊精+低聚糖40℃，pH2.5藍(lán)色/紫羅蘭色 t＝23秒 脫色標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件(每分鐘)底物 淀粉，約0.17g/L緩沖液 Citate，約0.03M碘(I2)0.03g/LCaCl2 1.85mMpH 2.50±0.05溫育溫度 40℃反應(yīng)時(shí)間 23秒波長(zhǎng) λ＝590nm酶濃度 0.025AFAU/mL酶的工作范圍 0.01-0.04AFAU/mL如果進(jìn)一步的詳述若需要優(yōu)選的是Novozymes A/S EB-SM-0259.02/01中的，在此引入作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1使用熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶的次級(jí)液化作用
400mL已磨過(guò)的谷類漿通過(guò)細(xì)菌α-淀粉酶液化作用并于105℃噴射式蒸煮5分鐘；所得谷類醪液具有30％干物質(zhì)，DE7和pH5.0。加熱醪液到80℃。使用VT 180粘度計(jì)測(cè)定粘度至500 CPS。
所述醪液用自黑曲霉的熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶處理。酶的上樣為0.25AFAU/g干物質(zhì)，1AFAU定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(37℃，pH2.5，0.01M醋酸鹽緩沖液)水解5.25g淀粉的酶量，通過(guò)添加碘-鉀(iodine-potassium)-碘化物使水解的淀粉僅稍微有色。
30分鐘后，測(cè)定粘度和DE值到350 CPS和DE12，表明獲得最終的谷類醪液的液化作用。
實(shí)施例2采用熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖酸性α-淀粉酶的次級(jí)液化400mL已磨過(guò)的谷類漿通過(guò)α-淀粉酶TTC液化作用并于105℃噴射式蒸煮5分鐘；所得谷類漿具有30％干物質(zhì)，DE7和pH5.0。加熱漿到80℃。使用VT 180粘度計(jì)測(cè)定粘度至500 CPS。
所述醪液用具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的自黑曲霉的熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶處理。酶的用量為0.25AFAU/g干物質(zhì)，1AFAU定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(37℃，pH2.5，0.01M醋酸鹽緩沖液)水解5.25g淀粉的酶量，通過(guò)添加碘-鉀(iodine-potassium)-碘化物使水解的淀粉僅稍微有色。
30分鐘后，測(cè)定粘度和DE值到350 CPS和DE12，表明獲得最終的谷類醪液的液化作用。
序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>在乙醇制備中的次級(jí)液化<130>10113.204<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>484<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<220><223>SEQ ID NO1<400>1Leu Ser Ala Ala Ser Trp Arg Thr Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Leu Thr1 5 10 15Asp Arg Phe Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asn Thr20 25 30Gly Asn Glu Ile Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln Gly Ile Ile Asp His35 40 45Leu Asp Tyr Ile Glu Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro50 55 60Ile Thr Glu Gln Leu Pro Gln Asp Thr Ala Asp Gly Glu Ala Tyr His65 70 75 80Gly Tyr Trp Gln Gln Lys Ile Tyr Asp Val Asn Ser Asn Phe Gly Thr85 90 95Ala Asp Asn Leu Lys Ser Leu Ser Asp Ala Leu His Ala Arg Gly Met100 105 110Tyr Leu Met Val Asp Val Val Pro Asp His Met Gly Tyr Ala Gly Asn115 120 125Gly Asn Asp Val Asp Tyr Ser Val Phe Asp Pro Phe Asp Ser Ser Ser130 135 140Tyr Phe His Pro Tyr Cys Leu Ile Thr Asp Trp Asp Asn Leu Thr Met145 150 155 160Val Glu Asp Cys Trp Glu Gly Asp Thr Ile Val Ser Leu Pro Asp Leu165 170 175Asp Thr Thr Glu Thr Ala Val Arg Thr Ile Trp Tyr Asp Trp Val Ala180 185 190Asp Leu Val Ser Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser Val195 200 205Leu Glu Val Gln Pro Asp Phe Phe Pro Gly Tyr Asn Lys Ala Ser Gly210 215 220Val Tyr Cys Val Gly Glu Ile Asp Asn Gly Asn Pro Ala Ser Asp Cys225 230 235 240Pro Tyr Gln Lys Val Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr Trp245 250 255Gln Leu Leu Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ile Ser Asn Leu260 265 270Tyr Asn Met Ile Lys Ser Val Ala Ser Asp Cys Ser Asp Pro Thr Leu275 280 285Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Lys Tyr290 295 300Thr Ser Asp Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Leu Ser Tyr Ile Phe Leu305 310 315 320Ser Asp Gly Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Glu Glu Gln His Tyr Ala325 330 335Gly Gly Lys Val Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr340 345 350Asp Thr Ser Ala Glu Leu Tyr Thr Trp Ile Ala Thr Thr Asn Ala Ile355 360 365Arg Lys Leu Ala Ile Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Ile Thr Tyr Ala Asn370 375 380Asp Ala Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Ala Lys Gly Thr385 390 395 400Ser Gly Ser Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn Lys Gly Ser Ser Gly405 410 415Ser Ser Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Thr420 425 430Lys Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Cys Thr Ser Val Thr Val Asp Ser Ser435 440 445Gly Asp Ile Pro Val Pro Met Ala Ser 6ly Leu Pro Arg Val Leu Leu450 455 460Pro Ala Ser Val Val Asp Ser Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Gly Arg465 470 475 480Leu Tyr Val Glu
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)發(fā)酵制備乙醇的方法，該方法包括在熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶存在下的次級(jí)液化作用步驟。
2.一種從包含淀粉的原料制備乙醇的方法，該方法包括下面的步驟(a)在α-淀粉酶存在下，包含淀粉的原料的液化作用；(b)噴射式蒸煮；(c)在熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶存在下的次級(jí)液化作用；(d)糖化作用；和(e)發(fā)酵作用以制備乙醇；其中步驟(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的順序進(jìn)行，并且其中(e)與(d)同時(shí)進(jìn)行或在(d)之后進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括回收乙醇。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括預(yù)糖化作用的步驟，其是在次級(jí)液化作用步驟(c)之后和步驟(d)之前進(jìn)行的。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中包含淀粉的原料選自塊莖，根和整個(gè)谷物；以及前面的任意組合。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中包含淀粉的原料得自谷類。
7.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中包含淀粉的原料選自玉米，玉米芯，小麥，大麥，黑麥，買羅高粱和馬鈴薯；或前面的任意組合。
8.權(quán)利要求5的方法，其中包含淀粉的原料是整個(gè)谷物，該谷物選自玉米，小麥或大麥或其任一組合。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中包含淀粉的原料是整個(gè)谷物，并且所述方法包括在步驟(a)之前粉碎整個(gè)谷物的步驟。
10.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中包含淀粉的原料是通過(guò)包含粉碎整個(gè)谷物的方法獲得的。
11.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，在步驟(a)前進(jìn)一步包括步驟i)粉碎整個(gè)谷物；ii)形成包括已粉碎谷物和水的漿以獲得含淀粉的原料。
12.權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的方法，其中粉碎步驟是干磨法步驟。
13.權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的方法，其中粉碎步驟是濕磨法步驟。
14.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中包含淀粉的原料是來(lái)自淀粉加工的側(cè)流物。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括下面的步驟(f)蒸餾以獲得乙醇；其中步驟(e)中的發(fā)酵和步驟(f)中的蒸餾是同時(shí)或分別地/依次地進(jìn)行；任選的是后接一或多個(gè)處理步驟以進(jìn)一步提煉乙醇。
16.權(quán)利要求15的方法，其中包含淀粉的原料是被粉碎的整個(gè)谷物，該方法進(jìn)一步包括下面的步驟(g)將步驟(f)中蒸餾制備的酒糟物分為濕谷物和酒糟水；和(h)在步驟(a)前回收酒糟水至包含淀粉的原料。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(e)中的發(fā)酵使用微生物進(jìn)行，例如細(xì)菌和真菌，例如發(fā)酵單胞菌和糖酵母。
18.權(quán)利要求17的方法，其中微生物能發(fā)酵糖為乙醇。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中微生物是酵母，例如釀酒酵母。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵在葡糖淀粉酶和/或蛋白酶存在下進(jìn)行。
21.權(quán)利要求20的方法，其中蛋白酶是微生物蛋白酶，例如選自真菌蛋白酶，例如衍生自曲霉菌屬優(yōu)選的是黑曲霉的菌株的酸性真菌蛋白酶。
22.權(quán)利要求20的方法，其中蛋白酶是中性的或堿性蛋白酶，例如衍生自芽胞桿菌屬菌株的蛋白酶。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法，其中添加葡糖淀粉酶和/或植酸酶以啟動(dòng)發(fā)酵。
24.權(quán)利要求23的方法，其中植酸酶是微生物，例如衍生自Peniophralycii或米曲酶的菌株
25.權(quán)利要求23的方法，其中葡糖淀粉酶是微生物，例如衍生自黑曲霉或Talaromyces emersonii。
26.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)中的α-淀粉酶是微生物，例如細(xì)菌α-淀粉酶，包括例如熱穩(wěn)定細(xì)菌α-淀粉酶。
27.權(quán)利要求26的方法，其中α-淀粉酶衍生自芽孢桿菌屬的菌株或曲霉屬的菌株。
28.權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)中的熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶是真菌，例如衍生自黑曲霉。
29.權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)中的液化材料已經(jīng)液化至DE 5-15，例如8-12，例如10-12。
30.權(quán)利要求29的方法，在步驟(a)前包括下述的步驟i)粉碎整個(gè)谷物；和ii)形成包括已粉碎谷物和水的漿。
31.權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)中的液化作用在60-95℃進(jìn)行10-120分鐘，優(yōu)選的是75-90℃進(jìn)行15-40分鐘。
32.權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)中的液化作用在60-95℃進(jìn)行10-120分鐘，優(yōu)選的是75-85℃進(jìn)行15-80分鐘。
33.權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)中除了熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶外還加入不是熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶的α-淀粉酶，即例如α-淀粉酶TTC。
34.權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)的方法，其中熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶是熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶。
35.權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)的方法，其中熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶是具有與SEQ ID NO1有至少70％的同一性，優(yōu)選的是與SEQ ID NO1有至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％，或至少99％的同一性的氨基酸序列的α-淀粉酶。
36.權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)的方法，其中熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
37.權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)的方法，其中熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶如權(quán)利要求41-46定義。
38.一種通過(guò)發(fā)酵制備乙醇的方法，該方法包括在α-淀粉酶存在下的次級(jí)液化作用步驟，該α-淀粉酶具有與SEQ ID NO1有至少70％的同一性，優(yōu)選的是具有與SEQ ID NO1有至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％，或至少99％的同一性的氨基酸序列。
39.一種自包含淀粉的原料制備乙醇的方法，該方法包括下面的步驟(a)在α-淀粉酶存在下，包含淀粉的原料的液化作用；(b)噴射式蒸煮；(c)在α-淀粉酶存在下的次級(jí)液化作用，該α-淀粉酶與SEQ ID NO1有至少70％的同一性，優(yōu)選的是具有與SEQ ID NO1有至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％，或至少99％的同一性和(d)糖化作用；和(e)發(fā)酵作用以制備乙醇；其中步驟(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的順序進(jìn)行，并且其中(e)與(d)同時(shí)進(jìn)行或在(d)之后進(jìn)行。
40.權(quán)利要求38或39的方法，其中所述的α-淀粉酶具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
41.權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)的方法，其中次級(jí)液化作用步驟中α-淀粉酶是產(chǎn)麥芽糖的，使得在使用DE 12α-淀粉酶TTC液化谷類淀粉在30％的干物質(zhì)，在60℃，pH4.5，，使用1AFAU/g干物質(zhì)的酶劑量，所述酶在24小時(shí)內(nèi)催化基于總量淀粉的至少15％，至少20％，至少25％，至少30w/w麥芽糖的形成。
42.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)所述的方法，其中次級(jí)液化作用步驟中所用的α-淀粉酶是熱穩(wěn)定的，該酶在下面的條件下在溫度70℃，維持高于其活性90％1小時(shí)，使用DE 12α-淀粉酶TTC液化谷類淀粉在30％的干物質(zhì)為底物，pH5.5；0.1M檸檬酸鹽緩沖液和4.3mM Ca2+。
43.權(quán)利要求38-42中任一項(xiàng)所述的方法，其中次級(jí)液化作用步驟中所用的α-淀粉酶是熱穩(wěn)定的，使得酶在下面的條件下在溫度50-80℃，維持高于其活性80％15分鐘，使用DE 12α-淀粉酶TTC液化谷類淀粉在30％的干物質(zhì)為底物，pH5.5，0.1M檸檬酸鹽緩沖液和4.3mM Ca2+。
44.權(quán)利要求38-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中次級(jí)液化作用步驟中所用的α-淀粉酶是酸性的，使得酶在下面的條件下在pH3.5-5.0(例如pH4)維持的活性比其活性的70％高DE 12α-淀粉酶TTC液化谷類淀粉在30％的干物質(zhì)為底物，溫度40℃，0.1M檸檬酸鹽緩沖液和4.3mM Ca2+。
45.權(quán)利要求38-39中任一項(xiàng)所述的方法，其中次級(jí)液化作用步驟中所用的α-淀粉酶是i)如權(quán)利要求42和/或權(quán)利要求43中所定義的熱穩(wěn)定的；ii)如權(quán)利要求44中所定義的酸性的。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述的熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶也是iii)如權(quán)利要求41中所定義的產(chǎn)麥芽糖的。
47.權(quán)利要求38-45中任一項(xiàng)的方法，其中制備乙醇方法中所用的包含淀粉的原料為權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)所定義。
48.權(quán)利要求38-45中任一項(xiàng)所定義的方法，進(jìn)一步包括權(quán)利要求3-4或11-33中任一項(xiàng)所定義的處理步驟。
49.權(quán)利要求1-48中任一項(xiàng)定義的方法，其中次級(jí)液化作用和發(fā)酵基本同時(shí)進(jìn)行，其中用于次級(jí)液化作用的α-淀粉酶通過(guò)優(yōu)選的是酵母的微生物表達(dá)，該微生物被遺傳修飾以表達(dá)α-淀粉酶。
50.權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括在一或多個(gè)處理步驟中添加一或多個(gè)附加酶。
51.權(quán)利要求50的方法，其中附加的酶不是α-淀粉酶。
52.權(quán)利要求51的方法，其中附加的酶不是熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶。
53.權(quán)利要求1-52任一項(xiàng)所述的方法，其中所用的處理步驟分批進(jìn)行或其中所有的處理步驟持續(xù)進(jìn)行，或其中一或多個(gè)處理步驟分批進(jìn)行而一或多個(gè)處理步驟連續(xù)進(jìn)行。
54.遺傳修飾酵母以表達(dá)權(quán)利要求35-36或權(quán)利要求41-47任一項(xiàng)所定義的α-淀粉酶。
55.熱穩(wěn)定酸性α-淀粉酶在制備乙醇的方法中次級(jí)液化作用步驟中的用途。
56.熱穩(wěn)定產(chǎn)麥芽糖的酸性α-淀粉酶在制備乙醇的方法中次級(jí)液化作用步驟中用途。
57.權(quán)利要求55或56的用途，其中用于本發(fā)明方法的包含淀粉的原料是如權(quán)利要求5-10任一項(xiàng)所述定義的。
58.權(quán)利要求55-56的用途，其中乙醇用作燃料酒精和/或燃料添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過(guò)發(fā)酵制備乙醇的方法，該方法包括在熱穩(wěn)定酸性α－淀粉酶或熱穩(wěn)定的產(chǎn)麥芽糖酸性α－淀粉酶存在下的次級(jí)液化作用步驟。
文檔編號(hào)C12P19/14GK1473197SQ01818566
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2001年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月10日
發(fā)明者克里斯托弗·維特, 克勞斯·費(fèi)爾比, 克勞斯·C·富格爾桑, C 富格爾桑, 費(fèi)爾比, 克里斯托弗 維特 申請(qǐng)人:諾維信公司, 諾維信北美公司