專利名稱：人源化肝癌單抗、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體(簡稱單抗)領(lǐng)域，尤其是關(guān)于人源化肝癌單抗、制備方法及其在臨床治療上的應(yīng)用。
抗體是由漿細胞分泌的，漿細胞又是由B淋巴細胞轉(zhuǎn)化而來的，每個淋巴細胞株制造它的專有抗體，每株細胞系只能產(chǎn)生一種它專有的、針對一種它能識別的特異性抗原決定族的抗體。這種從一株單一細胞系產(chǎn)生的抗體就叫單克隆抗體(以下簡稱單抗)。
如所周知，盡管幾十年來，人們對腫瘤的認識已有不少重要的突破，可是，手術(shù)，放射治療，化學(xué)藥物治療為核心的現(xiàn)代治療手段，至今還只能挽救少數(shù)惡性腫瘤患者的生命。腫瘤的治療學(xué)進展得如此艱難，其原因是多方面的。不少腫瘤由于其部位過于險惡，或由于其已擴散到致命的部位，在發(fā)現(xiàn)時已失去了任何手術(shù)的可能。
放射治療對某些局限性的腫瘤病灶非常有效，但并非對所有的惡性腫瘤均敏感，此外，對轉(zhuǎn)移病灶，一般說來放射治療是無效的。而今天的化學(xué)藥物治療至多還只是一種或可緩解病情的輔助手段。即使放射治療和化學(xué)藥物治療今后在療效上會有進步，也很難說它們是一類理想的治療方法，因為這類方法無選擇地作用于惡性腫瘤細胞和正常細胞，所導(dǎo)致的副作用往往為患者所不能忍受。
因此，很自然地想要尋找一種能選擇性殺死惡性腫瘤細胞而對正常細胞無毒害的全新的治療腫瘤的途徑，這種途徑，即所謂腫瘤的導(dǎo)向治療(TargetedTherapy)。由于沒有理想的導(dǎo)向載體，長時間以來，導(dǎo)向藥物的研究一直進展得十分緩慢。
1975年，1975年Koehler和Milstein用雜交瘤技術(shù)制備了世界上第一個鼠源單克隆抗體，為生物技術(shù)打開了一個全新的領(lǐng)域，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體技術(shù)也有了很大的發(fā)展，各種整分子的、小分子的、雞尾酒的、雙功能的以至抗獨特性的單克隆抗體均陸續(xù)問世；各種單克隆抗體有各種不同的用途，治療藥用的、診斷藥用的、分析用的、純化用的、檢驗用的等。1985年中科院細胞所謝弘、姚 等研制成功抗人肝癌單克隆抗體Hepama-11(實驗生物學(xué)報，Vol.18，p 263-270)，這是國際上最早報道的肝癌的鼠源單克隆抗體之一。單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展激勵了不少人再去探索導(dǎo)向治療的可行性，重新去尋找本世紀(jì)初德國人Paul Ehrlich提出的的“魔彈(magic bullet)”的舊夢。經(jīng)過十多年的探索和努力，作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)治療(Biological Response Modulizer)的一種重要的內(nèi)容，導(dǎo)向抗腫瘤藥物已成為一百多年來腫瘤免疫學(xué)最引人注目的進展之一。
經(jīng)過二十多年的努力，人們已制備成功多種腫瘤單克隆抗體，作為體外或體內(nèi)的診斷試劑、或作為體內(nèi)的治療藥物用于臨床實踐。其中，作為體內(nèi)治療藥物的腫瘤單克隆抗體，如抗乳腺癌單抗、抗卵巢癌單抗、抗B淋巴細胞白血病單抗等還剛剛開始用于臨床。我國在抗肝癌單抗、抗胃癌單抗等方面的研究也有很大的成功，但迄今為止，我國所研制的腫瘤單克隆抗體絕大部分均為鼠源性的，鼠源性單抗由于不能長期反復(fù)注射，其臨床應(yīng)用受到了嚴(yán)重的限制，隨著體內(nèi)治療藥物的單抗日益受到臨床重視，人源化單抗的研制勢在必行。
本發(fā)明人經(jīng)過多年努力，終于研制成了一種人源化肝癌單抗(命名為rGD-A)并試用于臨床，獲得了初步成功。
本發(fā)明的目的是提供一類人源化的抗人肝癌單克隆抗體，該種單克隆抗體是基因工程產(chǎn)物，可用于識別肝癌細胞，也可作為治療原發(fā)性肝細胞肝癌的單克隆抗體藥物的原料。
本發(fā)明的人源化的抗人肝癌單克隆抗體是指Fc片段完全人源化而Fab片段能識別人肝癌相關(guān)抗原的單克隆抗體。
這一類人源化的抗人肝癌單克隆抗體可以用蛋白A親和柱純化，HAMA(人抗鼠抗體)血清反應(yīng)測定陰性，體外結(jié)合活性試驗表明rGD-A只保留與人肝癌細胞和組織的結(jié)合功能，而與其它的人腫瘤細胞和正常組織沒有交叉結(jié)合。競爭結(jié)合試驗表明rGD-A的相對結(jié)合活性為對應(yīng)鼠源抗體結(jié)合活性的50％。
rGD-A的制備過程1.對應(yīng)鼠源肝癌單抗GD-A，系由中科院細胞所生物治療組制備2.細胞培養(yǎng)肝細胞肝癌細胞系SMMC-7721(中國上海細胞所)和中國倉鼠卵巢細胞系CHO-K1(ATCC CCL 61)分別用RPMI 1640(Gibco)和F12 Ham’s培養(yǎng)液培養(yǎng)，兩種培養(yǎng)液都添加10％胎牛血清(Gibco)，5％抗生素和抗真菌的溶液(Gibco)和2mM/L谷氨酰胺(Gibco)，在37度，5％CO2，無菌條件下培養(yǎng)。
3.抗體人源化基于與鼠的序列相似性，人框架組織亞群的kappa鏈(VK)可變區(qū)亞群I和重鏈可變區(qū)(VH)亞群II被選用于抗體人源化(14)。不保留kappa鏈低危位點42、83和106，但保留對應(yīng)鼠源單抗的與結(jié)合有關(guān)位置的框架組織殘基并人源化(12)。6個GD-A CDRs被嫁接到rGD-A可變區(qū)，根據(jù)抗體基因表達中最常用的密碼子，rGD-A可變區(qū)的完整的氨基酸序列轉(zhuǎn)變成DNA序列(14)。NheI位點位于VH的3’末端(GCTAGC)，另一個限制性位點，hindIII，則被引入5’末端，以便于克隆至哺乳動物細胞的表達載體。此外，通過改變密碼子的用法，一些內(nèi)部的限制性位點，如KpnI(GGTACC)和XbaI(TCTAGA)也被引入人源化的框架DNA序列中。
4.表達載體的構(gòu)建人源kappa鏈和重鏈的不同區(qū)域的DNA片斷的合成使用六段長的重疊合成DNA寡聚核苷酸，通過重疊PCR方法即可。六段重疊的寡聚核苷酸分兩步組建而成。第一步，六段寡聚核苷酸(5pmole)的每一段都在50μl的反應(yīng)混合液中退火和延伸。第二步，設(shè)計每一段的寡聚核苷酸引物(50pmole)在不同片斷的5’和3’端進行雜交。人類恒變區(qū)域的cDNA片斷可使用變性的引物通過PCR法克隆制得重鏈恒變區(qū)。重鏈載體(pHeavy)的構(gòu)建首先用hindIII/NheI和NheI/XhoI分別消化人的可變區(qū)DNA片斷和人重鏈不變區(qū)cDNA片斷，然后連接成一個hindIII/XhoI消化的載體，pSectag2B/Hygro(Invitrogen)；kappa鏈載體(pKappa)的構(gòu)建用hindIII酶消化人源化的可變區(qū)DNA片斷，人不變區(qū)cDNA片斷先5’磷酸化和用XhoI酶消化，然后連接成一個hindIII/XhoI消化的載體，pSectag2B(Invitrogen)。純化的質(zhì)粒DNA進行轉(zhuǎn)染和測序，可變區(qū)的測序結(jié)果與設(shè)計的hHP-1 DNA序列比較，共轉(zhuǎn)染至哺乳動物細胞之前，不同的克隆之間通過交換DNA限制片斷糾正點突變和缺失。
5.抗體在CHO-K1細胞系中表達兩種表達載體(0.75μg pHeavy和0.75μg pKappa)和雜交瘤-SFM(Gibco)中5μl lipofectamine轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢CHO-K1細胞(ATCC)中，為了選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)染48小時后添加含有250μg/ml潮霉素B的選擇培養(yǎng)液，選擇致密集落并通過夾心ELISA法篩選分泌hHp-1的抗性克隆的上清，選擇分泌抗體達最高水平的抗性克隆，用無血清CHO-S-SFM培養(yǎng)液(Gibco)制備抗體，培養(yǎng)3天后收集上清，用旦白A親和層析法純化hHp-1。離心過濾大約500ml混合的細胞上清，用1MTris-HCL(pH8.0)平衡，處理過的上清上樣，用旦白A柱純化，純化的抗體在PBS溶液中保存在-20℃，或加1％牛血清白旦白和0.02％NaN3(Sigma)保存在4℃。以已知濃度的人抗體IgG1kappa(Sigma)為標(biāo)準(zhǔn)，通過ELISA試驗，用兩倍系列稀釋的純化的抗體測定濃度，用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)作圖，校準(zhǔn)回歸線的斜率和Y-截距用相關(guān)系數(shù)不少于0.99來計算，hHP-1樣品的數(shù)據(jù)點在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，用于計算抗體濃度，抗體樣品的純度和亞單位(重鏈和kappa鏈)的大小，分別在還原和非還原條件下，用SDS-PAGE分析。
6.rGD-A的鑒定用免疫熒光染色試驗證實rGD-A與SMMC細胞的特異性結(jié)合，SMMC細胞先與抗體rGD-A和GD-A反應(yīng)，隨后與FITC偶合的二抗反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察染色切片。通過間接ELISA法測定rGD-A的結(jié)合活性，在96孔ELISA板(Coring)中培養(yǎng)SMMC-7721細胞并用2％多聚甲醛(Sigma)固定，用5μg/ml的正常人體組織樣品(Clontech)包被在ELISA板上，1％BSA封閉后，加各種濃度(0-20μg/ml)的rGD-A和非特異的人IgG kappa抗體(Sigma)，用HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG單克隆抗體(Pharmingen)檢測結(jié)合的抗體，人組織樣品的成功包被是用鼠抗人的心肌鈣旦白I單克隆抗體(HyTest)針對心組織樣品。對SMMC-7721細胞，有rGD-A，非特異的人IgG1 kappa抗體(Sigma)和非標(biāo)記的GD-A抗體三種抗體與生物素標(biāo)記的GD-A(biotin-GD-A)競爭，接種SMMC細胞，用2％甲醛固定和1％BSA封閉，加各種濃度(0-20μg/ml)的競爭抗體樣品，隨后加5μg/ml的生物素-GD-A，用抗生旦白鏈菌素-HRP(Pharmingen)檢測生物素-GD-A與SMMC細胞的結(jié)合。
對于HAMA血清反應(yīng)試驗，三種液相抗體樣品(GD-A，rGD-A和人IgGkappa)和固相GD-A競爭與人抗鼠抗體的結(jié)合，在ELISA板上先包被5μg/ml的GD-A然后加含有HAMA血清(Type 2SQ，Boehringer，Mannheim)和各種濃度的抗體樣品(0-0.5μg/ml)的血清/抗體混合液，隨后加2.5μg/ml生物素交聯(lián)的鼠抗人IgG1單克隆抗體和抗生旦白鏈菌素-HRP，檢測HAMA血清中的人抗鼠IgG抗體和固相GD-A的結(jié)合。上述提及的三種試驗，都用0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.2)包被旦白，結(jié)合和檢測的溫育步驟都是每孔50μl，室溫1小時，用封閉液(PBS中1％牛血清白旦白)稀釋所有的血清和抗體樣品，每步之間用PBS洗板六次，檢測之后，加OPO底物溶液(Sigma)顯色，吸收光線在450nm。
本發(fā)明系一類人源化的抗人肝癌單克隆抗體，下面以人源化的抗人肝癌單克隆抗體rGD-A的制得為實施例，進一步闡明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1鼠源抗體GD-A的人源化1.在人框架組織亞群的VH框架組織亞群II和VK框架亞群I被用于人源化過程。
2.攜帶13個鼠氨基酸殘基的VK框架組織與人kappa鏈框架組織亞群I有84％(67/80)相似，攜帶16個鼠氨基酸殘基的人源化重鏈框架組織與人重鏈框架組織亞群II有84％(81/97)的相似，所以人源化以后，鼠框架組織和人框架組織之間的重鏈和kappa鏈的相似性增加到84％。在人源化抗體設(shè)計中，從抗體序列數(shù)據(jù)庫中得到29個保存的鼠殘基(16個來自重鏈，13個來自kappa鏈)的發(fā)生頻率，29個保存的鼠殘基中，發(fā)現(xiàn)其中8個(VH27，VH73，VH76，VH82，VH82a，VH82c，VK3和VK4)保存在其他人框架組織亞群中，10個(VH6，VH48，VH67，VH71，VH78，VK43，VK70，VK78，VK100和VK104)在人的發(fā)生頻率不低于10％。在檢查數(shù)據(jù)庫中包含有的抗體序列時，一種含有24個殘基的人重鏈框架組織序列與已發(fā)現(xiàn)的人重鏈框架組織序列不同，對于kappa鏈，有40種完整的或幾乎完整的人kappa鏈框架組織序列，其中4種顯示有13個以上的殘基與人kappa鏈框架組織序列不同，與rGD-A框架序列比較，rGD-A只有16個重鏈殘基和13個kappa鏈殘基與人框架序列不同，rGD-A與人框架有更高的序列同源性。
實施例2人源化抗體rGD-A的表達1.為了篩選含有人IgG不變區(qū)亞類I的重鏈表達載體，來自4個獨立克隆的重鏈區(qū)用序列引物測序，通過把測序結(jié)果與不同的人IgG亞類保存的人絞鏈序列比較，進一步證實了重鏈不變區(qū)的亞類。
2.人化的IgG1重鏈和人化的kappa鏈DNA片斷以及從人脾cDNA克隆得到的兩個不變區(qū)在共轉(zhuǎn)染前測序，然而，通過PCR重疊合成的可變區(qū)，從4個獨立的kappa鏈克隆中得到的1114對堿基中發(fā)現(xiàn)有5處突變，從7個獨立的重鏈克隆中得到的1988對堿基中發(fā)現(xiàn)有22處突變，除了錯配和缺失外，突變位置沒有均勻分布，并且在重鏈可變區(qū)的中間部分(H165-H200)發(fā)現(xiàn)有突變的“熱點”領(lǐng)域。
3.表達載體的序列設(shè)計的所有突變都通過限制片斷重組糾正，而且重鏈和kappa鏈表達載體都共轉(zhuǎn)染至CHO-K1細胞中，用潮霉素B選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子，通過夾心ELISA法為人IgG kappa抗體分泌篩選抗性克隆，陰性對照的ELISA讀數(shù)與本底相似，在選擇的68個抗性克隆中，7％(5/68)顯示高水平抗體分泌(0D450＞8×本底)，顯示最高表達水平(ELISA讀數(shù)×16＞本底水平)的克隆用于制備rGD-A抗體。純化的rGD-A進行SDS-PAGE電泳證明樣品的純度，一條帶顯示測得的完整的rGD-A分子的大小，當(dāng)加入β-硫基乙醇(Sigma)時，重鏈和kappa鏈的分子量分別為50kDa和25kDa與人IgG kappa抗體相似。rGD-A抗體樣品通過夾心ELISA法定量，用已知濃度的人IgG kappa抗體樣品作標(biāo)準(zhǔn)進行校準(zhǔn)，表達水平為從1升培養(yǎng)3天的上清中得到約100μg分泌的rGD-A。
實施例3人源化抗體rGD-A的生物學(xué)性質(zhì)鑒定1.免疫熒光染色試驗當(dāng)同樣濃度的rGD-A和鼠GD-A分別與SMMC細胞反應(yīng)，都可以觀察到熒光顯像，只是rGD-A的熒光信號明顯更強。通過間接ELISA法檢測rGD-A與SMMC-7721細胞系的結(jié)合活性，沒有任何明確的結(jié)合特性的人IgG1 kappa抗體用作陰性對照，隨著抗體濃度增加，rGD-A結(jié)合吸光率增加，陰性對照沒有明顯變化。
2.競爭試驗用于檢測rGD-A是否有與最初的GD-A的抗原結(jié)合的能力，比較人源化過程前后的相對的結(jié)合親和力的變化，為了證明競爭的水平，構(gòu)建了結(jié)合抑制曲線，只加生物素-GD-A(如沒有任何競爭者)得到的ELISA讀數(shù)作為無抑制100％抑制的讀數(shù)為不含生物素-GD-A的孔的本底讀數(shù)，結(jié)果表明rGD-A和GD-A抗體和生物素-GD-A競爭與SMMC細胞的結(jié)合，而且隨著競爭抗體濃度增加，結(jié)合抑制水平也增加，為了與生物素-GD-A競爭，rGD-A抗體需要約比GD-A高四倍的濃度，結(jié)果提示rGD-A抗體的親和力為GD-A的30％。
實施例4人源化抗體rGD-A的專一性間接免疫熒光法組織名稱N1 N2P1 P2樣品1樣品2 樣品3大腦- - + + - - -小腦- - + + - - -坐骨神經(jīng)- - + + - - -肺 - - + + - - -肝 - - + + - - -腎 - - + + - - -膀胱- - + + - - -脾 - - + + - - -胃 - - + + - - -腸 - - + + - - -胰腺- - + + - - -甲狀腺 - - + + - - -腎上腺 - - + + - - -心 - - + + - - -橫紋肌 - - + + - - -睪丸- - + + - - -皮膚- - + + - - -肝癌- - + + + + ++N1，N2分別為第一和第二陰性對照N1相同濃度的人IgG作為第一抗體，以排除因非特異性吸附所致的假陽性。
N2緩沖液代替第一抗體，以排除溶媒成分所致的假陽性。
P1，P2分別為第一和第二陽性對照P1小鼠抗人肝癌細胞膜全血清(1∶5稀釋)作為第一抗體，以檢查抗原的活性。
P2人肝癌細胞BEL-7402作為抗原，以檢查待檢抗體的活性。
權(quán)利要求
1.一類人源化肝癌單克隆抗體，其特征在于其Fc片段完全人源化而Fab片段能識別人肝癌相關(guān)抗原的單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的肝癌人源化單克隆抗體，其特征在于可以用蛋白A親和柱純化，HAMA(人抗鼠抗體)血清反應(yīng)測定陰性，體外結(jié)合活性試驗表明這類單抗對人肝癌細胞和組織具有高度的專一性，而與其它的人腫瘤細胞和正常組織沒有交叉結(jié)合。其相對結(jié)合活性為對應(yīng)鼠源抗體結(jié)合活性的25-100％。
3.如權(quán)利要求1所述的肝癌人源化單克隆抗體，其特征在于所述肝癌人源單克隆抗體包括整分子及構(gòu)成整分子的小分子片段。
4.如權(quán)利要求1所述的肝癌人源化單克隆抗體的制備方法，其特征在于以基因工程技術(shù)為基本手段，即以對應(yīng)鼠源單克隆抗體可變區(qū)的氨基酸順序為構(gòu)建模板，在合成人源kappa鏈和重鏈的不同區(qū)域的DNA片斷的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建重鏈和kappa鏈的表達載體，再在適當(dāng)?shù)妮d體細胞中表達。
5.如權(quán)利要求1所述的肝癌人源化單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于所述單抗可用于識別肝癌細胞，也可作為治療原發(fā)性肝細胞肝癌的單克隆抗體藥物的原料。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類人源化肝癌單克隆抗體,其特征在于其Fc片段完全人源化而Fab片段能識別人肝癌相關(guān)抗原的單克隆抗體。當(dāng)然,其生物化學(xué)及免疫學(xué)特性也完全符合作為一類針對肝癌的單克隆抗體的基本要求,其涵蓋范圍包括整分子及構(gòu)成整分子的小分子片段。這是一種用基因工程技術(shù)制備的新的抗體分子,可用于識別肝癌細胞,也可作為治療原發(fā)性肝細胞肝癌的單克隆抗體藥物的原料。
文檔編號C12N15/12GK1385443SQ0111287
公開日2002年12月18日 申請日期2001年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月11日
發(fā)明者謝弘, 謝雍, 來文, 王根鳳, 陳中健, 王放 申請人:中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所