專利名稱：多種病毒同步檢測的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及病毒的檢測方法，更具體涉及一種多種人類病毒基因的同步檢測PCR(聚合酶鏈式反應)方法。
所說的多種病毒基因同步檢測是指采用一套統(tǒng)一的試劑和同一個熱循環(huán)程序，在同一個反應管中進行PCR擴增，檢測多至六種重要的人類病毒。這些病毒包括乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，艾滋病毒一型(HIV1)，人類巨細胞病毒(HCMV)，單純皰疹病毒一型(HSV1)和EB病毒(EBV)。它們對人類健康危害嚴重，導致各種惡性腫瘤或傳染病。如HBV和HCV導致肝炎，HBV的感染率長期高達10％以上，大約90％的輸血后肝炎由HCV引起。HIV1能導致愛滋病(AIDS)，AIDS是嚴重威脅人類生命的疾病之一，其病死率高于癌癥，被認為是世紀超級癌癥。HCMV是引起人類先天畸形的重要原因之一，它還可使細胞轉(zhuǎn)化，可能與人的惡性腫瘤的發(fā)生有關。HSV能引起多種人類疾病，并被認為與宮頸癌的發(fā)生有關，其中單純皰疹性腦炎(HSE)是一種死亡率很高的疾病。EBV感染十分普遍，與多種疾病相關，主要包括淋巴細胞增殖性疾病，非淋巴細胞的惡性腫瘤和自身免疫性疾病三大類，其中如鼻咽癌、Burkitt’s淋巴瘤、Hodgkin病和免疫缺陷相關淋巴瘤。所有這些病毒均可能通過血液傳播。主要傳播方式如輸血和血液制品注射。因此，血源質(zhì)量控制是阻止這類病毒及病毒病傳播的重要環(huán)節(jié)。已經(jīng)有許多方法用于檢測血液中病毒，如細胞學方法，免疫學方法、基因診斷(基因探針、PCR)，等等。其中，以PCR法的靈敏度最高，如果能嚴格控制實驗環(huán)境與條件，克服假陽性，PCR在臨床上將被廣泛使用。
然而，現(xiàn)有的PCR方法每次擴增只針對一種病毒，如果有一份血樣，要檢測是否含有上述病毒中的一種或多種，則需要分別進行多次PCR反應，因而費時費力，耗費藥品試劑多，檢測成本高。
隨著衛(wèi)生水平的提高，對血液質(zhì)量的控制受到空前重視，對血液制品和血源的檢測要求越來越高，指標也會增加，現(xiàn)有的PCR方法顯然不能滿足要求。學者們正在發(fā)展所謂多重PCR(Multiplex PCR)方法，即在一個試管中、在同一種反應條件下對兩個或兩個以上的不同靶基因進行同步擴增(Chamberlain，J．S_Gibbs，R．A_Rarier，J．E_Nguyen，P．N_and Caskey，C．T．(1988)Deletionscreening of the Dchennne muscular dystrophy locus via multiplex DNAamplification．Nucleic Acids Res．11141-11156)。這樣能大大提高PCR的效率。該方法也被用于臨床病毒的檢測，相關的研究有愛滋病毒I和II型同步擴增(Udaykumar，Heredia A_Soriano，V_Bravo，R_Epstein，J．S_and Hewlett，I．K．(1994)Enhanced diagnostic efficiency of the polymerase chain reaction by co-amplification of multiple regions of HIV-1 and HIV-2．J．Virol．Methods 4937-46)，四種逆轉(zhuǎn)錄病毒的同步擴增(Heredia，A_Soriano，V_Weiss，S．H_Bravo，R_Vallejo，A_Denny，T．N_Epstein，J．S_and Hewlett，I．K．(1996)Development of amultiplex PCR assay for the simultaneous detection and discrimination of HIV-1，HIV-2，HTLV-I and HTLV-II．Clin．Diagn．Virol_785-92)，三種肝炎病毒(HCV、HBV-C／HGV)的同步擴增(Caudai，C_Padula，M．G_Bettini，V_and Valensin，P．E．(1998)Detection of HCV and GBV-C／HGV infection by multiplex PCR in plasmasamples oftransfused subjects．J．Virol．Methods，7079-83)。這些方法顯然具有重要的臨床應用價值。然而，隨著靶基因數(shù)目的增加，加入的PCR引物對就越多，影響因數(shù)越復雜。例如，引物越多，存在同源序列可能性就越大，不同引物之間或引物與非靶基因之間發(fā)生區(qū)域堿基配對的機會就越多，從而干擾PCR；不同引物具有不同的Tm值(變性溫度)，給熱循環(huán)程序設計帶來困難，多重PCR假陽性率或假陰性率遠高出經(jīng)典PCR。因此，必須對多重PCR進行條件優(yōu)化，而優(yōu)化過程往往需要做大量的實驗。
均勻設計是一種建立在均勻分布理論上的實驗設計方法，比正交設計效率更高。例如，對于一個6因素、10水平的實驗，所有可能性組合的實驗次數(shù)為106，正交實驗至少需要1000次，而均勻設計只要10次，而所獲得的結(jié)果近似。(Fang K．T_and Wang，Y．(1993)Number-Theoretic Methods in Stastistics，Chapman and Hall，London；Tian G．L_and Fang，K．T．(1999)Uniform designs formixture-amount experiments and for mixture experiments under order restrictions．Sciences in China Ser．A．42456-470；Wang，Y_and Fang，K．T．(1996)Uniformdesign of experiments with mixtures．Sciences in China Ser．A．39264-275)。均勻設計表表示為U*x(Xy)，x為最大因子數(shù)，Y為水平數(shù)，*為新的均勻排布。每個均勻設計表附有一個應用表，指示從均勻分布表中選擇哪一欄來設計實驗。均勻設計由于效率高，已經(jīng)成功地在藥物設計和微生物發(fā)酵中獲得應用(Zhang W_Yu X．J_and Yuan，Q．(1994)Uniform designa new approach of design fermentationmedia．Bio／Techniques，7379-384．)。
本發(fā)明的目的是提供了一種多種病毒同步檢測的方法，該方法通過設計專用擴增引物，給出六種病毒的同步檢測的多重PCR條件，該方法易行，能快速、簡便地同步檢測血液中六種病毒。
為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施設計合適的引物，使引物之間不發(fā)生干擾，并具有相似的擴增條件；將目標集中PCR引物濃度上，它是影響多重PCR的關鍵因素，固定其它反應條件，采用均勻設計方案，用較少的實驗次數(shù)優(yōu)化引物濃度；利用優(yōu)化的條件對所有6種病毒同時或單獨地進行保守基因擴增，進而通過瓊脂糖凝膠電泳分離和檢測相應的病毒。其步驟是A．設計一套用于同步擴增六種病毒HIV1、HCV、HBV、HCMV、HSV和EBV的引物，各引物針對相應病毒高度保守基因，不同引物的退火溫度近似，引物兩兩之間無三堿基以上之互補，PCR產(chǎn)物兩兩長度之差大于30-50bp，以利于瓊脂糖凝膠分離；B．優(yōu)化多重PCR的引物濃度組合均勻設計，將擴增某一特定病毒靶基因的一對引物定義為一個因素，共6個因素，設每個因素的濃度范圍為0．1μmol／L-0．6μmol／L，共10個水平，采用均勻設計表U10*(108)及其附表(使用表)設計實驗方案；C．六種病毒的靶基因同步擴增，反應體系反應體積30μl，Taq酶1．5U，緩沖液1×，Mg++2．5mmol／L，dNTPs 300μmol／L，按均勻設計方案加入引物，反應在PE480熱循環(huán)儀上進行，采用同一個熱循環(huán)條件；反應完畢以后通過瓊脂糖凝膠電泳并在紫外燈下觀察和記錄結(jié)果。
D．優(yōu)化條件的驗證，由于在同一份血液樣品中同時出現(xiàn)六種病毒的幾率非常小，需要驗證所建立的六重PCR條件是否能檢測每種病毒單獨或同時存在，因此，在優(yōu)化條件下分別進行進行1-3重PCR擴增，并采用凝膠電泳分離檢測結(jié)果。


圖1為多重PCR條件優(yōu)化實驗結(jié)果。
用均勻設計組合的一組十個條件來優(yōu)化六重PCR，其中3，4，5，6四個條件下有非特異性的產(chǎn)物，如白色箭頭所示；在第8條件(第8泳道)下所有的預期產(chǎn)物均得到了很好的擴增，且沒有非特異性的產(chǎn)物。凝膠電泳條件1．7％瓊脂糖凝膠，0．5×TBE緩沖液，0．5μg／μL溴化乙錠預染色，60V穩(wěn)壓電泳3-4小時，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。
圖2為所建立的PCR條件的驗證。
M，pUC19／Msp標記分子量；1，六種病毒同步擴增；2，HIV1；3，HCV；4．HBV；5，HCMV；6，HSV1；7，EBV；8，三重擴增HIV1，HCV和HBV；9，兩重擴增HCMV和HSV1；10，兩重擴增HCV和HBV；11，陰性對照；12，HBV基因組；13，HCMV基因組；14，HSV1基因組。凝膠電泳條件1．7％瓊脂糖凝膠，0．5×TBE緩沖液，0．5μg／μL溴化乙錠預染色，60V穩(wěn)壓電泳3-4小時，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述1．PCR引物設計(表1)，共6對引物，各引物的靶基因為相應病毒高度保守區(qū)域基因，引物的退火溫度為56℃-64℃，引物兩兩之間無三堿基以上之互補，PCR產(chǎn)物兩兩長度之差大于30-50bp，以利于瓊脂糖凝膠分離，引物均委托商家合成；表1 PCR引物*
*每對引物中的前一個為上游引物，后一個為下游引物。
2．模板DNA的制備，六種病毒靶基因分別克隆在質(zhì)粒T載體上(表2)；質(zhì)粒保存在TE緩沖液(Tris-EDTA)中，-20℃貯存，采用常規(guī)的酚-氯仿-蛋白酶K法從感染病毒的細胞培養(yǎng)液中提取HSV1和HCMV基因組，從乙型肝炎病人陽性血清中提取HBV基因組；表2．載體質(zhì)粒及克隆的病毒靶基因或基因組
3．多重PCR引物濃度的均勻設計，將擴增某一特定病毒保守基因的一對引物定義為一個因素，共6個因素，將因素的水平范圍確定為0．1μmol／L-0．6μmol／L共10個水平，采用均勻設計表U10*(108)設計實驗方案(表3)，根據(jù)附表(使用表)中第6行指示的列號，從均勻設計表U10*(108)中找出相應的列(1、2、3、5、6、8)，確定引物濃度組合(表4)；表3用于六重PCR的均勻設計表及附表
表4六重PCR中的引物組合
4．多重PCR反應，反應體積為30μl，Taq酶1．5U，緩沖液1×，Mg++2．5mmol／L，dNTPs 300μmol／L，模板DNA為六種克隆有病毒基因的質(zhì)粒，每一種質(zhì)粒加入量為100ng，反應在PE480熱循環(huán)儀上進行，熱循環(huán)條件見表5，反應完畢后通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，電泳條件為1．7％瓊脂糖凝膠，0．5×TBE緩沖液，0．5μg／μL溴化乙錠預染色，60V穩(wěn)壓電泳3-4小時，然后在紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果，如
圖1所示，在第8泳道中，所有六種靶基因都得到相對均勻擴增，而且沒有非特異性擴增帶的出現(xiàn)，應視為最佳的引物濃度組合條件(表6)；表5PCR熱循環(huán)條件
表6按照均勻設計實驗所得到最優(yōu)六重PCR引物濃度組合(濃度單位μmol／L)
4．優(yōu)化條件的驗證將上述PCR條件及優(yōu)化的引物濃度組合(表6)應用于病毒基因的擴增，共14個擴增管，分別為第1管，六重擴增六種病毒基因的克隆質(zhì)粒；第2-7管，DNA模板為各單一的病毒基因克隆質(zhì)粒，順序為PTZA9707、PTZBG573、PTZYG3800、PTZX1418、PTZPY625和PTZEB723；第8管，三重擴增(PTZA9707、PTZBG573和PTZYG3800)，分別對應于HIV1，HCV和HBV；第9管，兩重擴增(PTZX1418和PTZPY625)，分別對應于HCMV和HSV1；第10管，兩重擴增(PTZBG573和PTZYG3800)，分別對應于HCV和HBV；第11管，陰性對照(不含DNA模板)；第12管，HBV基因組；第13管，HCMV基因組；第14管，HSV1基因組，結(jié)果見圖2，所有泳道的病毒靶基因擴增產(chǎn)物都清晰可見，沒有出現(xiàn)任何非特異性擴增，證明，無論所列六種病毒是混合存在還是單獨存在，均能在所優(yōu)化的多重PCR條件下被檢出。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，除具有經(jīng)典PCR技術(shù)的靈敏度、快速、簡便等特點以外，主要是實現(xiàn)了血液中六種重要病毒的同步檢測，成本更低，適合于開發(fā)相關多重PCR試劑盒，用于血源質(zhì)量控制、臨床診斷和病毒流行病控制。
權(quán)利要求
1．一種多種病毒同步檢測的方法，該方法包括以下步驟A．設計用于同步擴增六種病毒HIV1、HCV、HBV、HCMV、HSV和EBV的引物，各引物針對相應病毒高度保守基因，引物的退火溫度為56℃-64℃，引物兩兩之間無三堿基以上之互補，PCR產(chǎn)物兩兩長度之差大于30-50bp；B．多重PCR引物濃度的均勻設計，將擴增病毒每個靶基因的一對引物定義為一個因素，設因素的水平范圍為0．1μmol／L-0．6μmol／L，共10個水平，均勻設計表為U10*(108)，通過凝膠電泳分離檢測多重PCR結(jié)果；C．六種病毒HIV1，HCV，HBV，HCMV，HSV1和EBV基因同步檢測的PCR，反應體積30μl，Taq酶1．5U，緩沖液1×，Mg++2．5mmol／L，dNTPs300μmol／L，引物微摩爾濃度組合為；
反應在PE480熱循環(huán)儀上進行，熱循環(huán)條件94℃、3分鐘，1個循環(huán)；94℃、1分鐘，50℃、1分鐘，72℃、2分鐘，30個循環(huán)；94℃、1分鐘，50℃、1分鐘，72℃、7分鐘，1個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同步檢測六種病毒(HIV1,HCV,HBV,HCMV,HS－V1和EBV)多重PCR的方法,其特點是通過合理設計引物和采用均一設計法(U
文檔編號C12Q1/70GK1292424SQ00115958
公開日2001年4月25日 申請日期2000年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月16日
發(fā)明者張先恩, 陶生策, 劉虹, 李天憲, 張治平, 胡勤學, 梁布鋒 申請人:中國科學院武漢病毒研究所