專利名稱：Dna足紋步移作圖法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方法，具體地說是研究DNA與蛋白質(zhì)相結(jié)合的精確位點的作圖法。
DNA足紋法已應用較廣泛，盧圣棟主編的《現(xiàn)代分子生物學實驗技術》高等教育出版社，1993年7月第一版，P490～494對足紋法進行了詳細描述。足紋法通常包括以下步驟(1)采用PCR擴增或限制性核酸內(nèi)切酶消化獲得DNA靶分子；(2)在一定條件下用某些化學試劑或酶對同位素標記的雙鏈靶DNA進行隨機降解；(3)進行變性聚丙烯酰胺凝膠電脈；(4)放射自顯影，分析DNA梯隊中形成的位置缺口，并確定DNA與蛋白質(zhì)相結(jié)合的精確位點。該方法的主要缺點是在進行DNA足紋法之前必須經(jīng)過報告基因分析和EMSA試驗證實某一段DNA具有轉(zhuǎn)錄活性和存在蛋白質(zhì)的結(jié)合位點，且對片段的長度有一定限制，一般低于400bp較理想，當結(jié)合位點離標記末端300bp或更遠時，需要更長的電脈時間而且DNA片段梯隊帶型將很不尖銳，信號較弱，從而難以確定DNA與蛋白質(zhì)相結(jié)合的精確位點。因此，進行長片段DNA足紋分析時需要將DNA片段切割成小片段，再進行多次標記，多次結(jié)合，多次消化，步驟繁瑣、費時，消耗昂貴的核蛋白較多。
本發(fā)明的目的在于提供一種無需先進行報告基因分析和EMSA等初篩實驗，可以一次性繪制出任意長度DNA片段上存在的蛋白質(zhì)結(jié)合位點圖，且?guī)透怃J，更清晰，還可以節(jié)省昂貴的核蛋白的DNA足紋步移作圖法。
本發(fā)明的方法包括以下步驟(1)采用PCR擴增或限制性核酸內(nèi)切酶消化獲得DNA靶分子；(2)在一定條件下用某些化學試劑或酶對未標記的雙鏈靶進行隨機降解；(3)以這些降解后的DNA分子作模板，用條數(shù)n=靶DNA長度(bp)／300bp，經(jīng)同位素標記的該基因特異性的引物進行單鏈擴增；(4)進行變性聚丙烯酰胺凝膠電脈；(5)放射自顯影，分析結(jié)果。
由于采用這種用足夠多條特異性引物對被隨機降解靶DNA分子模板進行單鏈擴增，保證了無論是被蛋白質(zhì)所保護的區(qū)域，還是未被蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域的整個DNA片段均被擴增，又獲得大量長度不一的標記單鏈DNA分子，從而使放射性信號更為集中，帶型更尖銳、更清晰，從而實現(xiàn)了不需要先進行報告基因分析和EMSA初篩實驗，而可以一次性對任意長度DNA片段存在的蛋白質(zhì)結(jié)合點進行精確的分析，使該足紋法更簡便、快速，并大大節(jié)約了核蛋白的用量。
實施例1用DNA足紋步移作圖法對人體干細胞因子[hscf]基因5’調(diào)控序列(-1190～-273)進行分析。采用以下步驟1、用引物T7和SP6擴增重組質(zhì)粒PGEM-SCF5’(本課題組構(gòu)建)，獲得hscf下基因5’調(diào)控序列945bp(-1190～-273)并純化。
2、100μL反應體系中含100ng945bp探針，30～80μgHeIa核抽提物，1×結(jié)合緩沖液；對照組不加HeLa核抽提物，室溫下孵育30分鐘，后加入CaCl2／MgCa緩沖液100μl，室溫下放置1分鐘，加入1單位DNase I，室溫下放置1分鐘，加入37℃終止緩沖液200μl，無水乙醇沉淀DNA片段，離心分離，DNA沉淀于100μl無菌水中溶解；3、取以上經(jīng)降解DNA溶液1μl為模板，用[r-p32]ATP標記的T7和SP6引物擴增，同時進行A+G反應為對照；
4、以上擴增產(chǎn)物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電脈；5、-70℃放射自顯影，并分析。結(jié)果如下 Lane1～4采用T7引物對hSCF(human stem cell factor)基因5’調(diào)控序列自-1190進行DNA足紋步移作圖分析。Lanel，A+G反應；Lane2，100ng945bp探針，無核蛋白結(jié)合對照；Lane3，100ng945bp探針加30μgHeIa核抽提物；Lane4，100ng945bp探針加80μgHeIa核抽提物。DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)已于圖中注明。Lane5～8采用SP6引物對hSCF(human stem cell factor)基因5’調(diào)控序列自-273進行DNA足紋步移作圖分析。Lane1，A+G反應；Lane2，100ng945bp探針，無核蛋白結(jié)合對照；Lane3，100ng945bp探針加30μgHeIa核抽提物；Lane4，100ng945bp探針加80μgHeIa核抽提物。DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)已于圖中注明。
權利要求
1.DNA足紋步移作圖法，其特征在于包括以下步驟(1)采用PCR擴增或限制性核酸內(nèi)切酶消化獲得DNA靶分子；(2)在一定條件下，用某些化學試劑或酶對未標記的雙鏈靶進行隨機降解；(3)以這些降解后的DNA分子作模板，用條數(shù)n=靶DNA長度(bp)／300bp，經(jīng)同位素標記的該基因特異性的引物進行單鏈擴增；(4)進行變性聚丙烯酰胺凝膠電脈；(5)放射自顯影，分析結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DNA足紋步移作圖法,是在對未標記的雙鏈靶進行隨機降解以后,以這些降解的DNA分子作模板,用足夠多條經(jīng)同位素標記的該基因特異性引物進行單鏈擴增后再進行凝膠,電脈和放射自顯形,實現(xiàn)了無需先進行報告基因分析和MSA等初篩實驗,可以一次性繪制出任意長度DNA片段上存在的蛋白質(zhì)結(jié)合位點圖,且?guī)透怃J,更清晰節(jié)約昂貴的核蛋白。
文檔編號C12Q1/68GK1288959SQ00113519
公開日2001年3月28日 申請日期2000年6月30日 優(yōu)先權日2000年6月30日
發(fā)明者譚文斌, 朱敏, 聶怡玲, 彭興華 申請人:湖南醫(yī)科大學