專利名稱：產(chǎn)生果糖轉(zhuǎn)移酶的新菌株及其生產(chǎn)所述酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于新的微生物和微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種新的出芽短梗霉菌株，以及利用該微生物菌株高產(chǎn)量地制備果糖轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵方法，還涉及果糖轉(zhuǎn)移酶高效地催化蔗糖合成果寡糖的方法。
80年代以來，隨著人們對(duì)健康食品和低熱值食品需求的日益增加，許多功能性食品添加劑和甜味劑替代品應(yīng)運(yùn)而生，低聚糖或寡糖就是重要一類，如異麥芽低聚糖、大豆低聚糖、果寡糖、甘露寡糖、海藻寡糖等。其中果寡糖(FOS)一枝獨(dú)秀。果寡糖(FOS)為由3-10個(gè)單糖組成的低聚碳水化合物，主要是通過微生物的轉(zhuǎn)移酶由蔗糖合成的。在合成中，酶的來源不同催化果糖的連接方式也不一樣，出芽短孢霉和黑曲霉果糖轉(zhuǎn)移酶(Ftase)只產(chǎn)生1F-型FOS，而麥角和石刁柏FTase則形成1F-和6G-FOS.FOS是由蔗果三糖(GF2)，蔗果四糖(GF3)和1F-呋喃果糖基蔗果四糖(GF4)組成的果糖低聚化合物，其中果糖與蔗糖是以belta(2→1)鍵方式結(jié)合的[1-3]。FOS合成酶系有2種來源一是來自植物如石刁柏[10-12]、甜菜[13]、洋蔥[5，6，14]、菊芋[15-18]及其它植物[19-27]，二是來自微生物如曲霉屬[2，28-30，57]、出芽短孢霉屬[49，31-36]、節(jié)桿菌屬[37，38]和鐮孢霉屬等[7，8，39-43]。植物來源酶系因量少無法用于工業(yè)化生產(chǎn)。1984年Meiji Seika公司利用黑曲霉TFase[2，13]，90年代初Cheil Foods&Chemicals公司利用固定化出芽短孢霉[49，50]先后成功實(shí)現(xiàn)了FOS工業(yè)化生產(chǎn)。
對(duì)于人體和動(dòng)物而言，F(xiàn)OS具有許多優(yōu)良生物學(xué)和生理學(xué)效應(yīng)[3，51，51，52，56，60](1)FOS甜度為蔗糖三分之一，可用作限制甜味的食品原料；(2)FOS無能量，且不被人體消化酶利用，對(duì)糖尿病人是安全的；(3)FOS具有非致齲齒性，不能被口腔Streptcoccus mutans利用形成有機(jī)酸和不可溶性葡聚糖，避免齲齒和牙斑出現(xiàn)；(4)FOS刺激雙岐菌生長，抑制引起腹瀉病原菌的生長，人體日食用4g FOS有顯著的雙岐菌促進(jìn)效果；(5)通過與腸道病原菌特異性糖基結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，使病原菌失去或減少與寄主動(dòng)物腸壁細(xì)胞特異性識(shí)別、結(jié)合的機(jī)會(huì)，抑制沙門氏菌、大腸桿菌、腸球菌在腸道的定居和繁殖；(6)FOS能誘導(dǎo)動(dòng)物消化道微生物多聚碳水化合物水解酶的產(chǎn)生；(7)可以直接或間接正向刺激動(dòng)物體內(nèi)免疫活性；(8)降低血清膽固醇、磷脂和甘油三酯和血糖濃度；(9)降低結(jié)腸癌發(fā)生率。大量飼養(yǎng)試驗(yàn)表明，應(yīng)用FOS可以大大減少畜牧業(yè)生產(chǎn)抗生素使用量和病害防治成本，在綠色動(dòng)物食品生產(chǎn)中可以大有作為。給斷乳仔豬料添加0.25％和0.50％FOS飼喂30天，使動(dòng)物體重比對(duì)照分別提高36％和73％[55]。另據(jù)報(bào)道FOS使兔日增重較對(duì)照提高6.4％，而飼料消耗反下降7.8％[54]；果寡糖可以大大降低仔豬腹瀉率[55]。日糧中0.75％FOS使肉雞盲腸沙門氏菌數(shù)量比對(duì)照減少12％，且在斷水?dāng)嗉Z1天應(yīng)激下，F(xiàn)OS處理的肉雞盲腸沙門氏菌數(shù)量比對(duì)照要低4倍[53]；FOS使兔死亡率降低32％[54]；FOS還可以減少動(dòng)物糞便臭味[51，52]，與其它化學(xué)和活菌添加劑相比，F(xiàn)OS在產(chǎn)品制造與應(yīng)用方面也具有優(yōu)勢(shì)(1)產(chǎn)品耐高溫、耐胃酸，有利于制造與應(yīng)用；(2)不象活菌制劑那樣存在保持菌體活力的限制；(3)相對(duì)于活菌制劑而言，果寡糖制造成本相對(duì)低廉，且具有劑量效應(yīng)；(4)不論那種來源的低聚糖產(chǎn)品均安全無毒副作用，在動(dòng)物體內(nèi)不累積；(5)其使用不象抗生素和化學(xué)試劑那樣受停止用藥期限的限制。FOS可以作為食品和飼料原料廣泛應(yīng)用，由于具有多方面生物學(xué)效應(yīng)而足以與其它傳統(tǒng)甜味劑和食糖抗衡，或與其它甜味劑混合使用。因而將具有很大市場(chǎng)需求量。高純度FOS是有效的雙岐菌促進(jìn)因子，作為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑必將大有用武之地。
果糖轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)有多例FTase純化和酶學(xué)性質(zhì)研究報(bào)道[11，21，57]。一般，微生物來源的酶比植物來源的酶分子量更大，溫度穩(wěn)定性更好。該酶pH適性范圍5-6.5，溫度適性范圍50-60℃，便于商業(yè)化生產(chǎn)，F(xiàn)OS合成反應(yīng)通常在700-850克/升高蔗糖濃度下進(jìn)行。據(jù)報(bào)道[66]一種節(jié)桿菌FTase分子量為49KDa，pI為4.7，酶反應(yīng)最適pH為5.5，pH穩(wěn)定范圍為4.5-9.0，最適溫度為60℃，溫度穩(wěn)定范圍上限為70℃。另一株[67]節(jié)桿菌FTase分子量為40KDa，酶反應(yīng)最適pH為6.0，溫度為50℃。關(guān)于該酶的激活劑和抑制劑研究報(bào)道不多，美國龍舌蘭FTase受Ca，Mg，Co和Li等離子激活，而受Ag，Pb，Hg，Al和Sn等離子抑制[20]。出芽短孢霉FTase受Hg，Cu和Pb等離子抑制，目前尚未發(fā)現(xiàn)其激活劑。每分鐘轉(zhuǎn)移1mol果糖或產(chǎn)生1mol葡萄糖所需酶量為一個(gè)FTase酶活性單位[29，58]。微生物FTase特異性主要取決于蔗糖的belta-D-果糖呋喃苷殘基，有些帶有末端果糖的底物如棉子糖和菊二糖也適宜于FOS合成[57]。1-蔗果三糖、蔗果四糖和1F-呋喃果糖基蔗果四糖均可以作為果糖供體和受體，許多能夠產(chǎn)生FOS的微生物同時(shí)也產(chǎn)生FOS水解酶類[39，57，58]。在FOS生產(chǎn)時(shí)，應(yīng)抑制FOS水解酶類活性。
酶法合成生產(chǎn)果寡糖FTase制備 FTase一般是通過真菌有氧深層發(fā)酵生產(chǎn)的，具體發(fā)酵參數(shù)因菌種而異，已經(jīng)公認(rèn)，蔗糖總是菌體生長和產(chǎn)酶的最好碳源，pH宜保持在5.5以上，最適生長溫度是30℃[29，58]。出芽短孢霉FTase產(chǎn)酶條件研究報(bào)道較多[32，48]，在生長停滯期之后，胞內(nèi)酶和胞外酶的營養(yǎng)需求和產(chǎn)酶進(jìn)程非常一致，外加鎂離子能夠提高胞內(nèi)酶產(chǎn)量，這對(duì)于利用固定化細(xì)胞進(jìn)行FOS生產(chǎn)有著重要意義。
FOS工業(yè)化生產(chǎn) 依靠果糖轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行FOS工業(yè)化生產(chǎn)有2條具體技術(shù)路線一是利用酶制劑進(jìn)行分批生產(chǎn)，二是利用固定化酶或細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)，Meiji Seika公司利用海藻酸鈣凝膠作為載體固定黑曲霉細(xì)胞建立了FOS連續(xù)生產(chǎn)系統(tǒng)，Cheil Foods & Chemicals公司利用海藻酸鈣凝膠作為載體固定出芽短孢霉細(xì)胞建立了FOS連續(xù)生產(chǎn)系統(tǒng)，固定化細(xì)胞壽命50℃下3個(gè)月[49]。反應(yīng)體系中推薦的蔗糖濃度很高為600--850克/升。此外與FTase固定化有關(guān)的吸附劑和離子交換劑研究很多[33，35，46，49，50]。從生產(chǎn)實(shí)踐角度看，固定化酶反應(yīng)柱比固定化細(xì)胞反應(yīng)柱更好，其方法更為簡單，單位體積的生產(chǎn)率更高，但其運(yùn)轉(zhuǎn)穩(wěn)定性不如后者[49]。在實(shí)際決策時(shí)應(yīng)該綜合考慮各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。在分批生產(chǎn)途徑中必須增加去掉反應(yīng)產(chǎn)物中酶的工序，因此利用固定化方法進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)的途徑更為可取。
提高果寡糖產(chǎn)率的途徑 在FTase合成生產(chǎn)FOS中遇到的一個(gè)主要突出問題是該酶的活性受到反應(yīng)副產(chǎn)物葡萄糖的嚴(yán)重抑制，目前商品FOS含有大量蔗糖和葡萄糖，實(shí)際上是多種糖的混合物，其中葡萄糖占36-38％，蔗糖10-12％，蔗果三糖21-28％，蔗果四糖21-24％，蔗果五糖3-6％。產(chǎn)品中FOS純度很低，最高為55-60％(DW)[29，32，49，50]。在反應(yīng)體系中加入葡萄糖異構(gòu)酶或葡萄糖氧化酶能夠降低葡萄糖含量、提高主產(chǎn)物FOS產(chǎn)量，其中以葡萄糖氧化酶效果為好，但是增加生產(chǎn)成本，而在FTase和葡萄糖異構(gòu)酶復(fù)合酶體系中葡萄糖異構(gòu)酶的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)發(fā)生變化以致不能有效地降低體系中葡萄糖含量[34]。無疑，低純度和高成本是果寡糖生產(chǎn)中的最大限制因子，也是本發(fā)明著意解決的主要難題。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)利用本發(fā)明的新菌株可以高效價(jià)地生產(chǎn)果糖轉(zhuǎn)移酶，(2)本發(fā)明的發(fā)酵方法生產(chǎn)的果糖轉(zhuǎn)移酶作用效率高，酶∶底物＝1∶1，以往同類研究(Hidaka，H et al.，1988)[59]的比例為6∶1；本發(fā)明果寡糖產(chǎn)物中蔗果三糖比例非常高，在總產(chǎn)物中比率高達(dá)56.33％，在果寡糖中比率高達(dá)82％(表3和4)，這一點(diǎn)明顯與所有其他報(bào)道不同，其他報(bào)道蔗果三糖在總產(chǎn)物中和果寡糖中比率分別為20-30％和40-50％，甚至更低；這一特點(diǎn)對(duì)于開發(fā)高檔果寡糖和高純度單一果寡糖是十分有益的；本發(fā)明合成反應(yīng)產(chǎn)物中，四糖以上的高級(jí)果寡糖比率十分低，在總產(chǎn)物中和果寡糖中比率分別不到0.8％和不到1.2％，以往同類報(bào)道的四糖以上的高級(jí)果寡糖比率為20-30％。
本發(fā)明的目的之一是提供了一株果糖轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)FW9901。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了高產(chǎn)量地生產(chǎn)果糖轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供了果糖轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖合成果寡糖的方法，利用該方法可以提高產(chǎn)物得率。
本發(fā)明是通過以下所述得以實(shí)現(xiàn)的定義與技術(shù)果糖轉(zhuǎn)移酶活性定義每分鐘轉(zhuǎn)移1mol果糖所需酶量為一個(gè)活性單位，或每分鐘產(chǎn)生1mol還原糖所需酶量為一個(gè)活性單位(9，50)。酶活性測(cè)定條件pH5.5，溫度55℃，底物終濃度20-60％蔗糖。參考反應(yīng)體系組成7.5毫升25-80％(w/v)蔗糖溶液；2.3毫升0.1M檸檬酸緩沖液，pH 5.5；0.2毫升酶液，其產(chǎn)生還原糖的能力為5-25mg還原糖/分鐘/毫升(反應(yīng)液)，反應(yīng)時(shí)間15-30min。
產(chǎn)物定性鑒定采用HPLC方法測(cè)定反應(yīng)體系中所有糖的種類與含量。
一、果糖轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株的篩選在以高濃度蔗糖(5％)為唯一碳源的查氏培養(yǎng)基上，對(duì)不同來源的出芽短梗霉進(jìn)行初篩，30℃，4天，依照菌落長勢(shì)挑取優(yōu)勢(shì)菌落，作50毫升三角瓶搖瓶產(chǎn)酶篩選試驗(yàn)，30℃，280rpm/分鐘，4天后測(cè)定果糖轉(zhuǎn)移酶活性，依照活性大小篩選確定1株，定名為出芽短梗霉(Aureobasdium pullulans)FW9901，該菌株已經(jīng)于2000年1月 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.0436。
二、發(fā)酵生產(chǎn)果糖轉(zhuǎn)移酶將FW9901在斜面培養(yǎng)基上，以溫度30℃，培養(yǎng)3-5天，然后接種到搖瓶培養(yǎng)基中，以30℃，280-300r/分鐘，培養(yǎng)4天，然后接種到發(fā)酵罐，25-32℃，500-1200rpm/分鐘培養(yǎng)40-70小時(shí)；使用的斜面培養(yǎng)基為(克/升)蛋白胨，20；蔗糖，20；酵母提取物，10；使用的搖瓶培養(yǎng)基為(克/升)K2HPO3，5；(NH4)2SO4，6；NaCl，1；MgSO4.7H2O，0.2；酵母抽提物，3；蔗糖，60；使用的發(fā)酵罐培養(yǎng)基為(克/升)K2HPO3，5；(NH4)2SO4，6；NaCl，1；MgSO4.7H2O，0.2；酵母抽提物，3；蔗糖，200；聚氧丙烯甘油，0.5；聚氧乙烯氧丙烯甘油，0.5。
上發(fā)酵罐研究該菌株的產(chǎn)果糖轉(zhuǎn)移酶特性，接種量4％，在30℃，800r/分鐘下培養(yǎng)48小時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)酶高峰，酶活性達(dá)272U/毫升?？偺呛恐?4小時(shí)為6.115％，共消耗66.22％，至48小時(shí)僅為3.481％，至72小時(shí)為0；pH值在24小時(shí)之內(nèi)即下降近1個(gè)單位，后續(xù)48小時(shí)內(nèi)僅下降0.25個(gè)單位；菌體生物量至48小時(shí)達(dá)到高峰。顯然生物量增加與培養(yǎng)液中糖的消耗成正比例，與pH的下降成正比例。
三、果糖轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖合成果寡糖的方法以蔗糖為底物，依靠果糖轉(zhuǎn)移酶合成果寡糖。反應(yīng)體系的最終果糖轉(zhuǎn)移酶活性設(shè)置2個(gè)梯度分別為0.625和1.30U/毫升。對(duì)照(CK)和處理體系中蔗糖濃度統(tǒng)一為62.5％(W/V)。CK反應(yīng)前100℃下滅活20分鐘，其余與對(duì)照相同。pH值5.5，溫度55℃，合成反應(yīng)時(shí)間為72小時(shí)。
在本發(fā)明條件下，低聚糖產(chǎn)率高達(dá)68.70％，大大超過55-60％的最高水平(Jung，K.H.et al.，1989；Yun，J.W.，et al.，1990 an天1992；Hidaka，H et al.，1988)，這是目前報(bào)道的最高水平，比最高水平高出15-20％。反應(yīng)時(shí)間以48小時(shí)為宜，此時(shí)的低聚糖產(chǎn)率結(jié)果明顯優(yōu)于24小時(shí)，和略高于72小時(shí)；2種酶濃度試驗(yàn)結(jié)果表明在0.625U/毫升下，反應(yīng)48和72小時(shí)的低聚糖產(chǎn)率明顯高于1.30U/毫升的結(jié)果，但在反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)時(shí)，2種濃度之間對(duì)低聚糖產(chǎn)率影響差異不大，有趣的是觀察到，不同的酶濃度對(duì)不同低聚糖合成的影響并不一致低濃度(0.625U/毫升)酶有利于產(chǎn)生更多的蔗果三糖，高濃度(1.30U/毫升)酶有利于產(chǎn)生更多的蔗果四糖，2種酶濃度對(duì)蔗果三糖合成的影響并無大的差異。此種特性為本研究首次發(fā)現(xiàn)。葡萄糖產(chǎn)率與低聚糖產(chǎn)率之間具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r＝-0.9896)，由現(xiàn)有資料建立的直線回歸方程為低聚糖產(chǎn)率＝-1.2898葡萄糖產(chǎn)率+0.9201(r＝-0.9896)；從反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC測(cè)定結(jié)果來看，反應(yīng)所得低聚糖種類明顯為3種，并沒有干擾結(jié)果分析的雜峰或拖尾等現(xiàn)象出現(xiàn)(圖4)。
實(shí)施例1發(fā)酵生產(chǎn)果糖轉(zhuǎn)移酶以4％的接種量，將FW9901搖瓶母種接種到含有前述發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，在30℃，800rpm/分鐘下培養(yǎng)48小時(shí)，此時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶高峰，酶活性為272U/毫升。
實(shí)施例2果糖轉(zhuǎn)移酶的分離和初步純化取發(fā)酵罐發(fā)酵液，在4℃下離心，5000r/分鐘，15分鐘，棄菌體沉淀，上清為粗酶液，粗酶液活性265U/毫升，比活性156.3U/毫克(蛋白質(zhì))，粗酶液經(jīng)飽和硫酸銨〖75％〗鹽析，比酶活提高到1652.6U/毫克(蛋白質(zhì))，純化倍數(shù)為10.57。
表1、反應(yīng)體系產(chǎn)物/底物(％)*
*1號(hào)和2號(hào)處理體系酶FTase活性分別為0.625和1.30U/ml。CK和處理體系中蔗糖濃度均為62.5％(W/V)。CK反應(yīng)前100℃下滅活20min，其余與對(duì)照相同。pH值5.5，溫度55℃，表2、反應(yīng)產(chǎn)物中各低聚糖比例(％)
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權(quán)利要求
1.一種果糖轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株，它是出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)FW9901 CGMCC No.0436。
2.生產(chǎn)果糖轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵方法，該方法包括將權(quán)利要求1所述的菌株經(jīng)過斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后接種到搖瓶培養(yǎng)基中，再接種到發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)，回收發(fā)酵罐產(chǎn)生的果糖轉(zhuǎn)移酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中發(fā)酵罐培養(yǎng)的條件為溫度25-32℃，時(shí)間40-70小時(shí)，轉(zhuǎn)速為500-1200rpm/分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基(克/升)K2HPO3，5；(NH4)2SO4，6；NaCl，1；MgSO4.7H2O，0.2；酵母抽提物，3；蔗糖，200；，聚氧丙烯甘油，0.5；聚氧乙烯氧丙烯甘油，0.5。
全文摘要
篩選到一株出芽短梗霉菌株FW9901,在30℃下液態(tài)發(fā)酵48小時(shí)達(dá)到果糖轉(zhuǎn)移酶(Ftase)分泌高峰,搖瓶最高達(dá)到440U/毫升,發(fā)酵罐水平最高酶活性為272U/毫升;該酶的最適宜的反應(yīng)溫度為55℃,最適宜的反應(yīng)pH值為5.5。利用所產(chǎn)酶以62.5%(W/V)蔗糖為原料在55℃下合成低聚果糖,低聚糖產(chǎn)率高達(dá)68.70%,大大超過55—60%的最高水平,酶效率比前人結(jié)果高出100倍,由此將相應(yīng)節(jié)約低聚糖產(chǎn)品生產(chǎn)中的酶成本100倍;反應(yīng)時(shí)間以48小時(shí)為宜,該酶最佳反應(yīng)條件為:0.1U/g(蔗糖),55℃。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1265422SQ0010044
公開日2000年9月6日 申請(qǐng)日期2000年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月1日
發(fā)明者王建華 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所