一種百合種球脫毒方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種百合種球脫毒方法，包括以下步驟：(1)將百合種球在3?8℃放置40?50天；(2)選取芽長為4?8cm的百合種球，剝?nèi)ネ鈱喻[片，留3?5個內(nèi)層鱗片的鱗莖盤，將鱗莖盤放入培養(yǎng)箱中進行預(yù)處理，預(yù)處理條件為：光照強度1500?2000Lux，溫度35?40℃，處理時間2?5天；(3)選擇生長正常的鱗莖盤，剝?nèi)?.4?0.7cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在23?25℃下暗培養(yǎng)1?2天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強度為1500?2000Lux，光照時間為12?16小時/天，并以1?5℃/d的速度升溫，溫度升至35?45℃后，保持該溫度培養(yǎng)35?45天。本發(fā)明將熱處理和化學(xué)處理結(jié)合脫除百合種球病毒，不僅縮短了誘導(dǎo)培養(yǎng)周期，還具有脫毒率高，增值系數(shù)高等特點，為培育百合無病毒植株，推廣無毒化栽培的研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種百合種球脫毒方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物組培快繁技術(shù)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種百合種球脫毒方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 百合是單子葉植物綱百合科(Li Iiaceae)百合屬(Li Iium)的總稱，為多年生宿根 草本花卉。百合屬在世界上有90余種，原產(chǎn)我國的約有47種，占世界總數(shù)的51%。百合栽培 品種繁多，其花朵碩大，色彩豐富，花姿優(yōu)美，既能作切花、盆花，又能在園林綠地中應(yīng)用，且 大多數(shù)百合可以食用，是上等的滋補佳品。百合素有"百年好合"之意，深受人們的喜愛。百 合主要分布在中國、日本、北美和歐洲等溫帶地區(qū)，我國近年來的百合切花生產(chǎn)發(fā)展較快， 在昆明、上海、深圳已形成三大生產(chǎn)基地。但其繁殖主要還是采用常規(guī)分球、分珠芽鱗片扦 插，鱗片包埋等繁殖的方式。長期的無性繁殖使百合體內(nèi)逐漸積累大量病毒致使百合患病 毒病，影響百合的產(chǎn)量和質(zhì)量。
[0003] 在已報道的十余種侵染百合的病毒中，發(fā)生最為普遍，危害最為嚴(yán)重的病毒有3 種：黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus,CMV)、百合無癥病毒（Lily symptomless virus，LSV)和百合斑駁病毒(Lily mottle virus，LMoV)，它們常表現(xiàn)為復(fù)合侵染，造成植 株的莖、葉或花出現(xiàn)斑駁或畸形，嚴(yán)重的導(dǎo)致植株矮小、退化甚至死亡，而且隨著病毒的傳 播，常導(dǎo)致百合大面積感病，嚴(yán)重影響了百合鮮切花的產(chǎn)量和品質(zhì)。
[0004] 龍牙百合的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，種球繁殖是關(guān)鍵。在百合規(guī)?；N植中，我國百合種球繁 殖尚處于探索階段，繁殖方法可分為有性繁殖(種子繁殖)和無性繁殖兩種。其中有性繁殖 因為繁殖周期需要3-4年，因為多數(shù)百合雜種系不易結(jié)實，而且百合繁殖的后代容易發(fā)生變 異，不能完全保持原品種的優(yōu)良性狀，所以在實際生產(chǎn)中，百合較少用有性繁殖，而以無性 繁殖為主。其中無性繁殖主要采取的繁殖方式包括莖生小鱗莖繁殖、珠芽繁殖、鱗片扦插繁 殖和組織培養(yǎng)等。莖生小鱗莖繁殖獲得的種球質(zhì)量好，但繁殖系數(shù)低;珠芽繁殖形成商品球 的時間較長，一般要經(jīng)過2-3年;鱗片扦插繁殖成本低、操作方便，且繁殖系數(shù)高，是快速繁 殖百合的有效方法。小鱗莖、珠芽、鱗片扦插的無性繁殖方法，均導(dǎo)致后代容易積累病毒，品 種退化現(xiàn)象十分嚴(yán)重。
[0005] 植物組織培養(yǎng)技術(shù)在以無性繁殖為主的植物上應(yīng)用廣泛，技術(shù)也相對成熟。采用 組織培養(yǎng)快繁龍牙百合，可在短時間內(nèi)獲得大量保持原有品種優(yōu)良性狀的優(yōu)質(zhì)種苗，如能 推行組織培養(yǎng)工廠化育苗，還能產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟效益。目前，針對龍牙百合組織培養(yǎng)快繁的 專利還未見報道，文獻研究也主要集中在以獲得種苗形式的組織培養(yǎng)上，對種球形式的組 織培養(yǎng)產(chǎn)品研究較少，對于生長于地下的龍牙百合鱗莖，帶菌多，外植體消毒十分困難，存 在污染率較高的問題仍未得到較好的解決。
[0006] 百合病毒進行檢測的方法主要有指示植物法、電鏡檢測法、血清學(xué)方法等，1990年 以來，國外逐漸開展了針對百合病毒的RT-PCR檢測技術(shù)研究。RT-PCR技術(shù)用于百合病毒檢 測在便捷性、靈敏度、特異性等方面均優(yōu)于上述幾種方法。而在傳統(tǒng)RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來 的多重RT-PCR技術(shù)，因其快速、靈敏、特異性強、操作簡單等優(yōu)點(Bertolini et al.，2001; Nie and Singh，2001)，近年來在百合病毒檢測方面得到了一定的研究。多重RTPCR又稱復(fù) RT-PCR，指將多對引物加入到一個反應(yīng)體系中，同時擴增多個序列。應(yīng)用該技術(shù)可以一次檢 測多種病毒。
[0007] 目前國際上阻斷病毒傳播獲得脫毒苗的基本方法有:莖尖培養(yǎng)、珠芽培養(yǎng)、化學(xué)處 理、熱處理。
[0008] 因此建立簡便易行、脫毒率高的脫毒體系是減少病毒對百合的危害、恢復(fù)種性的 關(guān)鍵問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種百合種 球脫毒方法。
[0010] 本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0011] -種百合種球脫毒方法，包括以下步驟：
[0012 ](1)將百合種球在3-8 °C放置40-50天；
[0013] (2)選取芽長為4-8cm的百合種球，剝?nèi)ネ鈱喻[片，留3-5個內(nèi)層鱗片的鱗莖盤，將 鱗莖盤放入培養(yǎng)箱中進行預(yù)處理，預(yù)處理條件為:光照強度1500-2000LUX，溫度35-40°C，處 理時間2-5天；
[0014] (3)選擇預(yù)處理后生長正常的鱗莖盤，剝?nèi)?.4-0.7cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中， 先在23-25°C下暗培養(yǎng)1-2天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強度為1500-2000Lux，光照時間 為12-16小時/天，并以1-5 °C/天的速度升溫，溫度升至35-45°C后，保持該溫度培養(yǎng)35-45 天。
[0015] 優(yōu)選地，所述的分化培養(yǎng)基的配方為:MS培養(yǎng)基+6-BA1.2-1.8mg/L+NAA 0.35- 0 · 65mg/L+抗病毒劑 5_15mg/L。
[0016] 優(yōu)選地，所述的抗病毒劑為二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍中一種或多種的 混合物。
[0017] 更優(yōu)選地，所述的抗病毒劑由二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍混合而成，所 述二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍的質(zhì)量比為（I-3): (1 -3): (1 -3)。
[0018] 具體的，在本發(fā)明中：
[0019] MS培養(yǎng)基的成份：
[0020] (1)大量元素：NH4NO3 1.65g/L、KN03 1.90g/L、KH2P〇4 0· 17g/L、MgS〇4 · 7H20 0 · 37g/L、CaCl2(2H20)0 · 44g/L;
[0021] (2)微量元素：MgS〇4 · 4H20 22.3mg/L、N3B03 6.2mg/L、ZnS〇4 · 7H208.6mg/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo〇4· 2H20 0.25g/L、CuS〇4 · 5H20 0.025mg/L、CoCl · 6H2O 0.025mg/L、 FeS〇47H20 27 · 8mg/L、Na2-EDTA，37 · 3mg/L;
[0022] (3)有機成分:肌醇10〇11^凡、煙酸0.511^凡、1^-甘氨酸211^凡、維生素136 0.511^凡、維 生素 BI 0.1mg/L;
[0023] (4)蔗糖 3〇g/L;
[0024] (5)瓊脂 12g/L。
[0025] 6-BA，即6-芐氨基腺嘌呤，CAS號：1214-39-7。
[0026] NAA，即 1-萘乙酸，CAS 號：86-87-3。
[0027] 二氫尿嘧啶，CAS 號：504-07-4。
[0028] 2-硫脲嘧啶，CAS 號：141-90-2。
[0029]鹽酸嗎啉胍，CAS 號：3160-91-6。
[0030]本發(fā)明百合種球脫毒方法，將熱處理和化學(xué)處理結(jié)合脫除百合種球病毒，不僅縮 短了誘導(dǎo)培養(yǎng)周期，還具有脫毒率高，增值系數(shù)高等特點，為培育百合無病毒植株，推廣無 毒化栽培的研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實質(zhì)對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0032] 實施例1
[0033] 百合種球脫毒方法，包括以下步驟：
[0034] (1)將百合種球（品種為西伯利亞，Siberia)在4°C放置45天；
[0035] (2)選取芽長為5cm的百合種球，剝?nèi)ネ鈱喻[片，留4個內(nèi)層鱗片的鱗莖盤，將鱗莖 盤放入培養(yǎng)箱中進行預(yù)處理，預(yù)處理條件為:光照強度1600LUX，溫度38°C，處理時間3天； [0036] (3)選擇預(yù)處理后生長正常的鱗莖盤，剝?nèi)?.6cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在 24°C下暗培養(yǎng)1天（即在24 °C黑暗無光的條件下放置1天），然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強 度為1500LUX，光照時間為12小時/天，移入培養(yǎng)箱中第1天溫度為24°C，并以2°C/天的速度 升溫，溫度升至36 °C后，以36 °C培養(yǎng)35天。
[0037] 所述的分化培養(yǎng)基的配方為:MS培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+抗病毒劑 9mg/L〇
[0038] 所述的抗病毒劑由二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍按質(zhì)量比為1: 1:1混合而 成。
[0039] 實施例2
[0040]與實施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于:所述的抗病毒劑由2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍 按質(zhì)量比為1:1混合而成。
[0041 ] 實施例3
[0042] 與實施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于:所述的抗病毒劑由二氫尿嘧啶、鹽酸嗎啉胍 按質(zhì)量比為1:1混合而成。
[0043] 實施例4
[0044] 與實施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于:所述的抗病毒劑由二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶 按質(zhì)量比為1:1混合而成。
[0045] 實施例5
[0046] 與實施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于，所述步驟(3)為:選擇生長正常的鱗莖盤，剝 取0.6cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在24°C下放置1天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強度 為1500LUX，光照時間為12小時/天，并保持溫度為24 °C培養(yǎng)30天。
[0047] 實施例6
[0048]與實施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于，所述步驟（3)為:選擇生長正常的鱗莖盤，剝 取0.6cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在24°C下放置1天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強度 為1500Lux，光照時間為12小時/天，并保持溫度為30 °C培養(yǎng)30天。
[0049] 實施例7
[0050] 與實施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于，所述步驟（3)為:選擇生長正常的鱗莖盤，剝 取0.6cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在24°C下放置1天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強度 為1500Lux，光照時間為12小時/天，并保持溫度為36 °C培養(yǎng)30天。
[0051] 測試?yán)?
[0052] 將實施例1-7中步驟(3)的莖尖在分化培養(yǎng)基中成活率進行統(tǒng)計。具體測試結(jié)果見 表1。
[0053] 表1:成活率結(jié)果表
L 〇〇55 J 比較實施例1和實施例2-4,實施例1(二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍復(fù)配） 成活率明顯高于實施例2-4(二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍中任意二者復(fù)配）。比較 實施例1與實施例5-7,實施例1(采用以2°C/天的速度升溫)成活率明顯高于于實施例2-4 (保持恒定溫度）。
[0056] 測試?yán)?
[0057]將實施例1-7中培養(yǎng)得到的莖尖脫毒率進行測試。
[0058]利用多重RT-PCR檢測百合三種病毒（百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒、百合斑駁病 毒)具體參照陳進等發(fā)表在《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報》上的文獻《百合三種主要病毒的RT-PCR檢 測及脫毒技術(shù)研究》中的方法。脫毒率結(jié)果見表2。
[0059] 表2:三種病毒脫毒率結(jié)果表
[0062]比較實施例1和實施例2-4，實施例1 (二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍復(fù)配） 三種病毒脫毒率明顯高于實施例2_4(二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍中任意二者復(fù) 配）。比較實施例1與實施例5-7,實施例1(采用以2°C/天的速度升溫)三種病毒脫毒率明顯 高于于實施例2-4(保持恒定溫度）。
【主權(quán)項】
1. 一種百合種球脫毒方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將百合種球在3-8 °C放置40-50天； (2) 選取芽長為4-8cm的百合種球，剝?nèi)ネ鈱喻[片，留3-5個內(nèi)層鱗片的鱗莖盤，將鱗莖 盤放入培養(yǎng)箱中進行預(yù)處理，預(yù)處理條件為:光照強度1500-2000LUX，溫度35-40°C，處理時 間2-5天； (3) 選擇預(yù)處理后生長正常的鱗莖盤，剝?nèi)?.4-0.7cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在 23-25°C下暗培養(yǎng)1-2天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強度為1500-2000Lux，光照時間為 12-16小時/天，并以1-5 °C/天的速度升溫，溫度升至35-45 °C后，保持該溫度培養(yǎng)35-45天。2. 如權(quán)利要求1所述的百合種球脫毒方法，其特征在于:所述的分化培養(yǎng)基的配方為： MS培養(yǎng)基+6-BA 1 · 2-1 · 8mg/L+NAA 0 · 35-0 · 65mg/L+抗病毒劑5-15mg/L。3. 如權(quán)利要求2所述的百合種球脫毒方法，其特征在于：所述的抗病毒劑為二氫尿嘧 啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍中一種或多種的混合物。4. 如權(quán)利要求3所述的百合種球脫毒方法，其特征在于：所述的抗病毒劑由二氫尿嘧 啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍混合而成，所述二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍的質(zhì)量比 為(1-3):(1-3):(1-3)〇
【文檔編號】A01H4/00GK105941143SQ201610268132
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】鄒聲達, 鄒先佼, 鄒先佑, 張美鳳, 吳楊, 李曉紅, 胡雪華, 賀根和, 吳政元
【申請人】江西綠百合生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司