用于增加器官和組織保存溶液的穩(wěn)定性和儲存壽命的溶液的制作方法
【專利摘要】公開了具有改進(jìn)的穩(wěn)定性的器官和組織保存溶液。該溶液包括兩種單獨的溶液。第一溶液，溶液A，包括平衡鹽溶液，其在為7.0或更高的pH下的溶液中是穩(wěn)定的。第二溶液，溶液B，包括水性溶液，所述水性溶液含有L?谷胱甘肽和/或半胱氨酰甘氨酸，諸如D?葡萄糖的糖，L?精氨酸，諸如抗壞血酸的還原劑和水，溶液B的pH低于7.0，優(yōu)選為從約3.0至5.0。然后在使用時將這兩種溶液混合在一起，并將pH調(diào)節(jié)至約7.3，得到具有改善的穩(wěn)定性的器官和組織保存溶液。優(yōu)選地，溶液A具有為約7.6的pH以及溶液B具有為約5.0的pH。本發(fā)明還包括試劑盒20，其包括在兩個單獨的容器22，24中的兩種溶液。在一個替代的實施例中，糖可在溶液A中。
【專利說明】用于増加器官和組織保存溶液的穩(wěn)定性和儲存壽命的溶液
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求于2013年11月22日提交的序列號為61/963,093的在先提交的待決美 國臨時專利申請的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容由此以其全文通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及用于保存組織和器官功能的配制物，以及更具體地涉及用于保存組織 和器官功能(具體是移植之前的血管導(dǎo)管功能）的儲存穩(wěn)定的配制物。
【背景技術(shù)】
[0004] 本文引用的所有參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)以其全文通過引用并入。
[0005] 美國專利7，981，596公開了組織和器官保存溶液，通常稱為GALA。其由以下三種成 分命名：谷胱甘肽，抗壞血酸和L-精氨酸。GALA溶液還包括平衡鹽溶液。這些溶液特別適用 于保存諸如動脈和靜脈的血管導(dǎo)管。血管導(dǎo)管被用作適于各種旁路外科手術(shù)的移植物，所 述手術(shù)包括但不限于周圍血管旁路分流手術(shù)和冠狀動脈旁路移植(CABG)手術(shù)。旁路移植是 其中血管導(dǎo)管以如此的方式移植以旁路繞過被阻塞的動脈以至于將血流恢復(fù)到目標(biāo)組織 的方法。在血管手術(shù)期間，在血管導(dǎo)管被移植之前獲取血管導(dǎo)管、對其進(jìn)行沖洗并暫時保存 在儲存溶液中。
[0006] 內(nèi)皮功能障礙是在導(dǎo)致血管導(dǎo)管發(fā)生故障的相互關(guān)聯(lián)的發(fā)病中的主要決定因素。 移植失敗之后會導(dǎo)致移植血栓形成、內(nèi)膜增生和加速移植動脈粥樣硬化，所有這些在血管 導(dǎo)管內(nèi)皮的以往功能和/結(jié)構(gòu)損傷之前都已預(yù)知。已經(jīng)認(rèn)識到用于在手術(shù)中獲取的隱靜脈 段的存儲溶液的選擇對血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能以及因此移植通暢方面具有顯著影響。這些 溶液無法充分保存保持血管導(dǎo)管已被許多研究者(Thatte HS，BisWas KS，Najjar SF等人， 隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的多光子顯微鏡評估及其用新溶液
[0007] GALA的保存（Multi-photon microscopic evaluation of saphenous vein endothelium and its preservation with a new solution,GALA.,Ann Thorac Surg 2003;75:1145-52和Hussaini 2011))所證實。在Wilbring等人的2011體外研究中證實在從 患者獲取的導(dǎo)管存放在通常適用于血管導(dǎo)管存儲的緩沖鹽溶液中之后血管功能完全喪失。 該數(shù)據(jù)表明內(nèi)皮細(xì)胞功能也顯著下降，但這些功能失調(diào)的導(dǎo)管在本研究中被成功地用作適 于旁路手術(shù)的移植物。
[0008] 在體外研究中對于GALA?保存溶液對人體隱靜脈段的影響進(jìn)行了評估。雖然當(dāng)今 在臨床上使用的溶液導(dǎo)致在血管導(dǎo)管(隱靜脈)的內(nèi)皮細(xì)胞活力上的顯著下降，但GALA?維 持內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)活性至少達(dá)24小時（Thatte 2003, Circulation 2013: 127e6-e245Hussaini BE，Lu XG,Wolfe JA和Thatte S.Evalation of endoscopic vein extraction on structural and functional viability of saphenous vein endothelium.J Cariothorac Surg 2011;6:82-90)。因而體外數(shù)據(jù)表明通過將GALA?用作 血管導(dǎo)管保存溶液而提供血管導(dǎo)管的更好保存。然而，所公開的溶液由于溶液的不穩(wěn)定性 而具有有限的儲存壽命。
[0009] 因此，需要生產(chǎn)GALA器官和組織保存溶液的改進(jìn)的溶液以便提高溶液的穩(wěn)定性和 儲存壽命。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明基于實現(xiàn)下述為前提，即GALA配制物的穩(wěn)定性可通過將配制物分離成具有 pH為至少7、通常為7.4-8的第一溶液A和具有pH為小于7、通常更低的第二溶液B來改進(jìn)。溶 液A包括平衡鹽溶液。溶液B包括水，諸如抗壞血酸的抗氧化劑，具體為L-谷胱甘肽的還原 劑，諸如L-精氨酸的一氧化氮底物和諸如D-葡萄糖的糖。該溶液保持在低于7、優(yōu)選5,4或3 的pH，優(yōu)選具有為以每百萬零份的氧含量。在本發(fā)明的一個替代實施例中，溶液A和B如上所 述配制，不同之處在于所述糖被添加到溶液A而不是溶液B。此外，在替代的配制物中，可添 加紅細(xì)胞生成素(ΕΡ0)，優(yōu)選添加到溶液B。
【附圖說明】
[0011]圖1是適于在本發(fā)明中使用的多室袋的透視圖；
[0012] 圖2是適于與本發(fā)明一起使用的具有第一和第二容器的試劑盒的透視圖；
[0013] 圖3A和圖3B是表示在谷胱甘肽、抗壞血酸和精氨酸的加速儲存條件下隨時間變化 的濃度曲線圖；
[0014] 圖4是描繪L-谷胱甘肽在溶液B中降解速率的兩幅曲線圖；以及 [0015]圖5A-5D是實施本發(fā)明的方法的不意性視圖。
【具體實施方式】
[0016] 除非另有定義，否則文中所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有由本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員所通常理解的相同含義。盡管在本發(fā)明的實踐或測試中可使用與本文中所述那 些類似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒安牧?，但對?yōu)選的方法及材料進(jìn)行描述。出于本發(fā)明的目的，下 列術(shù)語定義如下。
[0017] 如本文中所用，術(shù)語"患者"包括動物界的成員，包括但不限于人類。
[0018] 如本文中所用，"器官"包括但不限于心臟、靜脈、動脈、肺、肝、胰腺及腎。亦涵蓋器 官的部分。
[0019] 如本文中所用，"無菌水"包括但不限于：（a)注射用無菌水，USP;(b)無菌蒸餾去離 子水;及(c)灌洗用無菌水。
[0020] 如本文中所用，"心麻痹(cardioplegia)"包括但不限于心臟麻痹。
[0021] 如本文中所用，"亞低溫"為約10攝氏度-21攝氏度。
[0022] 如本文中所用，"抗氧化劑"為當(dāng)存在于包含可氧化底物生物分子的混合物或結(jié)構(gòu) 中時，延遲或防止底物生物分子氧化的物質(zhì)。例如，抗壞血酸為抗氧化劑。
[0023] "平衡鹽溶液"被定義為滲透上平衡以防止急性細(xì)胞或組織損傷的水性溶液。
[0024] "緩沖鹽溶液"被定義為平衡的鹽溶液，化學(xué)物質(zhì)添加到其以保持預(yù)定的生理pH值 范圍。
[0025] "GALA"是指包括谷胱甘肽、抗壞血酸、L-精氨酸和平衡鹽溶液的一種類型的組織 保存溶液。
[0026] "移植物"被定義為在身體的一部分中移植或植入以修復(fù)缺陷的組織。
[0027] "獲取的旁路導(dǎo)管"被定義為用于使得血液旁路繞過阻塞的外科手術(shù)安裝的替代 路徑。
[0028] "心麻痹溶液"被定義為在運輸或手術(shù)過程中輔助保存心臟的溶液。
[0029] "細(xì)胞還原劑"被定義為容易失去電子從而引起其它物質(zhì)被化學(xué)還原的物質(zhì)。
[0030] "緩沖劑"是用于維持溶液的酸度(pH)接近選定值的酸或堿。用于生產(chǎn)本發(fā)明溶液 的優(yōu)選的緩沖劑是4N的鹽酸和84 %的NaHC03。
[0031] "等滲溶液"是指具有跨半透膜的相同滲透壓的兩種溶液。等滲溶液是具有與細(xì)胞 相同的鹽濃度的溶液。
[0032] "生理溶液"被定義為通過與正常間質(zhì)流體等滲而與正常組織兼容的鹽水性溶液。
[0033]本發(fā)明提供包含兩種溶液(溶液A和溶液B)的GALA類型的組織保存配制物，其相比 于現(xiàn)有GALA類型的單一溶液的組織保存溶液具有出乎意料之外的更高穩(wěn)定性。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明，第一溶液或溶液A包括平衡鹽溶液。該平衡鹽溶液包括水和生理學(xué)上 可接受的鹽。典型的平衡鹽溶液將包括水，鈣離子，氯離子，鉀離子，磷酸根離子，鎂離子和 鈉咼子。
[0035]平衡鹽溶液包括選自如下的鹽:二水合氯化鈣、氯化鉀、磷酸二氫鉀、六水合氯化 鎂、七水合硫酸鎂、氯化鈉、碳酸氫鈉、七水合磷酸氫二鈉及其組合。平衡鹽溶液以第一及第 二溶液混合在一起時將產(chǎn)生等滲溶液的濃度提供。在示例性實施例中，平衡鹽溶液包括約 0.14克/升二水合氯化鈣、約0.4克/升氯化鉀、0.06克/升磷酸二氫鉀、約0.1克/升六水合氯 化鎂、約0.1克/升七水合硫酸鎂、約8克/升氯化鈉、約0.36克/升碳酸氫鈉及約0.03克/升七 水合磷酸氫二鈉。
[0036]溶液A的成分在水中一起溶解，并且所得溶液的pH通過加入堿(諸如碳酸氫鈉）調(diào) 節(jié)至約7.4-8.0。
[0037] 任選地，溶液A可包含非甾體抗炎劑，諸如阿司匹林，萘普生和布洛芬。任選地，局 部麻醉藥物可加入，優(yōu)選加入到溶液A中，或在替代方案中，麻醉藥物可在使用時加入。這樣 的局部麻醉藥物的實例包括但不限于利多卡因，阿替卡因/腎上腺素，甲哌卡因，布比卡因， 羅比卡因和氯普魯卡因。
[0038]根據(jù)本發(fā)明，GALA的以下成分將在第二溶液或者溶液B中：還原型谷胱甘肽，諸如 抗壞血酸的還原劑，諸如D-葡萄糖的糖，L-精氨酸，緩沖劑和水，其已用諸如氬氣的惰性氣 體吹掃以基本上除去所有溶解的氧(優(yōu)選至小于O.lppm)。所得溶液B的pH小于7,且通常為 從3至5。作為替代方案，半胱氨酰甘氨酸可取代還原型谷胱甘肽，或半胱氨酰甘氨酸和還原 型谷胱甘肽的混合物可存在于溶液B中。在一種最優(yōu)選的配制物中，溶液A的pH為8.0以及溶 液B的pH為約3.0。
[0039]更具體地，溶液B是在單獨的容器中來自溶液A的有機(jī)成分的溶液，且包括L-谷胱 甘肽，L-精氨酸，L-抗壞血酸，D-葡萄糖和水，用于在為3.0-5.0的pH下注射?？纱嫫咸烟?使用的其它糖是任何糖，但優(yōu)選任何單糖，所述單糖包括但不限于果糖，甘露糖和核糖。當(dāng) 將溶液A和B在使用時混合的時候，混合溶液的pH為7.3 ± 0.4。溶液A和B的pH可使用許多已 知的緩沖劑來調(diào)節(jié)。優(yōu)選的緩沖劑是4N的HC1和84%的NaHC03。在一種優(yōu)選的配制物中，溶 液A的pH為約7.8以及溶液B的pH為約4.0。在一種最優(yōu)選的配制物中，溶液A的pH為8.0以及 溶液Β的pH為3.0。
[0040]溶液中的鹽用于緩沖(保持pH)并保持相對于血管導(dǎo)管的等滲性。有機(jī)成分是為了 維持額外的緩沖能力、重量克分子滲透壓濃度(osmolality)和給血管導(dǎo)管提供非氧化性的 環(huán)境。四種有機(jī)成分(L-谷胱甘肽，L-抗壞血酸，L-精氨酸和D-葡萄糖)是血液的正常組分并 且為了它們在保存和維持血管導(dǎo)管的細(xì)胞外環(huán)境的作用而被包括在內(nèi)。
[0041 ] L-谷胱甘肽和L-抗壞血酸是通過吸收自由基而防止對細(xì)胞造成氧化性損傷的抗 氧化劑。在組織保存溶液中的這些抗氧化劑的功能是：1)通過防止氧化來穩(wěn)定溶液的其它 成分，從而改善產(chǎn)品的穩(wěn)定性和儲存壽命;和2)防止對細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的氧化性 損傷。氧化性損傷已經(jīng)表明破壞細(xì)胞外體系結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)完整性，從而導(dǎo)致中斷血管內(nèi)皮細(xì) 胞襯里。中斷內(nèi)皮襯里是血管移植物受損的一個指標(biāo)。糖的目的是提供用于組織或器官的 能量來源。
[0042]當(dāng)溶液A和溶液B相混合時，L-精氨酸的濃度應(yīng)為從約250μΜ至約2000μΜ。葡萄糖 的濃度應(yīng)為從約50mM至約120mM，L-谷胱甘肽為50μΜ至約2000μΜ和L-抗壞血酸為25μΜ至 約 1000μΜο
[0043] 第一或第二配制物可任選包括其量足以協(xié)助防止組織或器官血管內(nèi)的血液凝固 的抗凝劑。示例性的抗凝劑包括肝素和水蛭素，但也可以使用其它抗凝劑，諸如阿司匹林。 示例性實施例包括濃度在從約50單位/毫升至約250單位/毫升范圍內(nèi)的肝素。肝素也可在 溶液Α和Β相混合之后并在使用前之前單獨加入。
[0044] 在一個示例性實施例中，溶液A和溶液B的體積比為約19:1。例如，在一個實施例 中，950毫升的溶液A與50毫升溶液B混合以得到用于保存組織或器官功能的最終配制物。 [0045] 如果ΕΡ0添加到溶液A或B，當(dāng)溶液A和溶液B相混合時，ΕΡ0的濃度應(yīng)為約5單位/毫 升。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明，第二替代性組織保存溶液包括溶液A和第二溶液溶液B，所述溶液A包 括糖，諸如葡萄糖，甘露糖，果糖等，所述糖與pH在7.4至8下的平衡鹽溶液混合，而第二溶液 溶液B包括還原型谷胱甘肽，抗壞血酸，L-精氨酸，在pH低于7、通常為5、4或3下的在水中的 緩沖劑，其可以存儲在無氧環(huán)境中。
[0047] 通常，在任一實施例中的溶液A或B都將不包括除具體所列那些以外的其它有機(jī)成 分，因為這些其它有機(jī)成分會是不必要的并增加生產(chǎn)成本。具體地，除了前面所列那些以外 的在其它類型的組織保存溶液中發(fā)現(xiàn)的其它有機(jī)化合物將不包括在溶液A或B中，以最大限 度地降低成本并減少可能對最終產(chǎn)品不利的潛在副反應(yīng)。
[0048] 制造過程是穩(wěn)健的，并在cGMP條件下進(jìn)行。該產(chǎn)品由無菌灌裝過程滅菌，并且穩(wěn)定 性測試提供至少2年的建議儲存壽命。
[0049] 圖1和圖2示出用于運輸、存儲和最后使用本發(fā)明的組織保存溶液的試劑盒或容器 的示例性典型實施例。這些是示例性的且其它容器可用于提供單獨的溶液A和B，它們在使 用時混合以便組織保存。
[0050] 圖1示出具有兩個腔室12和14的袋子10,兩個腔室12和14通過夾具16從彼此隔開 或夾斷。腔室12含有溶液A而腔室14含有溶液B。當(dāng)夾具16被移除時，腔室12和14變成袋子10 的一個腔室，以及溶液A與溶液B混合得到袋子10中的整體器官和組織保存溶液。參見號為 5,257,985的美國專利。
[00511圖2示出具有兩個容器22和24的器官和組織保存試劑盒20。溶液A被包含在容器22 中以及溶液B被包含在容器24中。在使用時，容器24中的內(nèi)容物可被排空到容器22內(nèi)，或者 兩個容器22和容器24的內(nèi)容物都可被排空到動脈或靜脈可放置于其中的盆或碗內(nèi)，以產(chǎn)生 整體的器官和組織保存溶液。
[0052]在如圖2中所示的一個優(yōu)選實施例中，溶液A被無菌裝填到預(yù)先滅菌的Nalgene瓶 中，然后將其用預(yù)先滅菌的HDPE螺帽固定。
[0053]溶液B被無菌地裝填到預(yù)先滅菌的硼硅酸鹽I型玻璃小瓶內(nèi)，其用預(yù)先滅菌的 Stelmi隔膜固定，所述隔膜通過可撕開的密封件保持在位?？伤洪_的密封件在制造商推薦 的壓接設(shè)置下使用有效的壓接過程壓接至瓶。在混合和裝填過程中瓶B可用氬氣氣體脫氣 以減少氧的存在，但是這可能不是必要的。
[0054]含有溶液A的瓶和含有溶液B的瓶然后被放置在卡片紙(card-stock)預(yù)印箱內(nèi)。此 時包裝說明書也放置在箱內(nèi)。然后將箱密封并標(biāo)記以便分配。
[0055] 在使用時，溶液A和B混合在一起以便完成GALA的最終溶液C且pH將被調(diào)節(jié)至約7.3 ± 0.4。如果溶液A的pH為8.0，則溶液B的pH將為約3.0。如果溶液A的pH為7.8，則溶液B的pH 將為約4.0。并且，如果溶液A的pH為7.6，則溶液B的pH將為約5.0。
[0056] 下面是用于實踐本發(fā)明的推薦過程。
[0057]將溶液22和24升溫至環(huán)境或房間溫度。在使用之前，通過檢查封閉情況來檢查每 個容器22和24是否有泄漏。如果發(fā)現(xiàn)泄漏，則丟棄溶液容器。執(zhí)行對溶液的目視檢查以便檢 查是否有微粒物質(zhì)。如果在溶液中明顯見到明顯的顆粒物、沉淀物或污染物，則不使用該溶 液。在即將使用前執(zhí)行以下步驟：
[0058] 1.將溶液A的全部內(nèi)容物從小瓶22倒入到無菌容器26 (例如托盤，杯子或小盆）內(nèi)， 血管導(dǎo)管32在移植之前被存儲在容器26內(nèi)，如圖5A中所示。
[0059] 2.用無菌注射器28從小瓶24無菌地取出12.5毫升的溶液B，并將其添加到具有溶 液A的容器26 (圖5B)以便形成GALA溶液34。
[0060] 3.將12，500單位的肝素加入到含有溶液A和B的容器26，如圖5C中所示。
[0061] 4.通過輕輕旋動在容器26中進(jìn)行混合。
[0062] 溶液用于沖洗剛從患者取出之后的分離的血管導(dǎo)管32?；旌系娜芤篈和B也可與注 射器組合使用以便將靜水壓力施加到導(dǎo)管以便存儲在溶液內(nèi)之前評估導(dǎo)管泄漏。然后血管 導(dǎo)管32被存儲在容器26中的混合溶液34內(nèi)直至血管導(dǎo)管可被移植到患者體內(nèi)為止。
[0063] 本發(fā)明的溶液、裝置和灌注方法并不限于用于特定的組織、器官或細(xì)胞類型。例 如，本發(fā)明可用于所獲取的隱靜脈、上腹部動脈、胃網(wǎng)膜動脈和冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG) 中使用的橈動脈。本發(fā)明還可用于在移植手術(shù)期間保持器官和組織。本發(fā)明不限于任何特 定的組織或器官。例如，預(yù)期這樣的器官或組織可以是心臟，肺，腎，腦，血，血小板，肌肉移 植物，皮膚，腸道，骨骼，附屬器官，眼睛等或其部分。此外，本發(fā)明亦可用作原位組織或器官 防腐劑?？深A(yù)期本發(fā)明的溶液用于洗滌和浸泡尚未從患者取出的組織及器官。例如，可預(yù)期 本發(fā)明在心臟停搏期間使用。例如，還可預(yù)期到本發(fā)明亦可用于急救程序，其中會需將組織 或器官浸泡于配制物中以保存其直到可進(jìn)行手術(shù)或獲得其它醫(yī)療護(hù)理為止。就此而言，該 溶液可供醫(yī)院環(huán)境及"現(xiàn)場"（即，在救護(hù)車或臨時緊急醫(yī)療設(shè)施中）的緊急醫(yī)療人員使用。
[0064] GALA溶液(混合的溶液A和B)也可用作手術(shù)(具體是塑形或重建手術(shù)）中的灌洗溶 液。這包括但不限于吸脂，乳房重建，乳房切除術(shù)或其中將需要等滲的pH平衡的溶液諸如 GALA的其它操作。該GALA溶液也可用于使用制造商的用于沖洗或灌注的程序來沖洗或灌注 透析機(jī)。該GALA溶液也可與靜脈的外部支撐配合使用。這種支撐的一個實例是由以色列的 Vascular Graft Solutions of Tel-Aviv開發(fā)的Vest?血管外部支持。
[0065] 器官和組織保存溶液的成分也可摻入到膠體、乳膏、或水凝膠中。水凝膠的實例在 號為6,339,074的美國專利中公開。
[0066] 下面的表1示出本發(fā)明的實施例，其中溶液A的pH為約8.0以及溶液B的pH為約3.0。
[0067] 表 1
[0068] -個實施例的溶液A和B的定性和定量組分
[0069]
[0070]
[0071 ] 表2中示出混合的溶液A和溶液B的成分：
[0072] 表 2
[0073] 混合的溶液A和B的定性和定量組分
[0074]
[0075]
[0076] 以下實例意在說明本發(fā)明，但不以任何方式進(jìn)行限制。
[0077] 實例 1
[0078] 制備來自表1的多個批次的溶液A和溶液B。來自三個單獨批次的二^^一組溶液A和 B容器被放置在保持在40°C具有75%相對濕度的合格的穩(wěn)定性腔室內(nèi)。來自每個批次的溶 液容器被定期取出并在這些加速條件下進(jìn)行測試。該數(shù)據(jù)結(jié)果被外推以確定產(chǎn)品的存儲壽 命，如果它在2-8 °C下儲存的話。存儲壽命的確定基于產(chǎn)品溶液處于設(shè)置規(guī)范（set specification)內(nèi)的最短持續(xù)時間的評估。研究溶液A和B的pH、重量克分子滲透壓濃度和 電導(dǎo)率。構(gòu)成溶液A的八種無機(jī)鹽是惰性的，并且在水性介質(zhì)中在延長的時間段下保持穩(wěn) 定。
[0079]溶液B成分中的兩種，L-精氨酸和D-葡萄糖，也被發(fā)現(xiàn)在為3的pH下在延長的時間 段下保持穩(wěn)定。因此由于所有其余規(guī)范符合驗收標(biāo)準(zhǔn)，影響產(chǎn)品的存儲壽命的最后結(jié)果的 兩種成分是L-抗壞血酸和L-谷胱甘肽，其原因在于它們的抗氧化性能。
[0080] 對于溶液而言，對于整體穩(wěn)定性限制性能的理由是要保持必要的整體還原環(huán)境條 件。當(dāng)溶液不再提供這項益處時，則其將不符合規(guī)范。只要一些還原型L-谷胱甘肽和L-抗壞 血酸(無論量多少）在氧化還原、平衡和溶液中仍保持處于它們的還原狀態(tài)下，就可達(dá)到還 原環(huán)境。換言之，只要L-谷胱甘肽和L-抗壞血酸分別保持在上述分析方法的檢測極限之上 即可。
[0081] 將溶液存儲在40°C下時所得到的數(shù)據(jù)使用為2的Q10因子外推到這樣的溶液的平 均5度的儲存溫度?；谠撏馔?，可以預(yù)測到溶液B的儲存穩(wěn)定性為約900天，提供至少兩年 的存儲壽命，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過行業(yè)內(nèi)的要求，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過當(dāng)前配制物的穩(wěn)定性。表明谷胱甘肽的濃 度的所獲得的原始數(shù)據(jù)在圖3A中示出，并且在圖3B中示出抗壞血酸和精氨酸隨時間變化的 濃度。
[0082] 實例2:
[0083]根據(jù)Q10原理，在速率常數(shù)、溫度和存儲壽命之間的關(guān)系可以表示為：
[0087] 其中kl和k2是在溫度T1和T2下以及儲存壽命SL1和SL2下的速率常數(shù)。溫度系數(shù) Q10的值取決于反應(yīng)的激活能量Ea。因此如果已知針對至少兩個不同溫度的速率常數(shù)，則可 使用上述公式來計算Q10。取決于存儲壽命的所需估計值是否分別是a)保守的 (conservative) ;b)可能且合理;或者c)不保守但卻可能，Q10的值通常為2,3或4。作為經(jīng)驗 法貝IJ，為2的Q10對應(yīng)于12.2千卡/摩爾的Ea，3對應(yīng)于19.4千卡/摩爾的Ea，且4對應(yīng)于24.5千 卡/摩爾的Ea。
[0088] 在產(chǎn)品監(jiān)管提交(regulatory submission)的早期階段過程中，當(dāng)可能尚未得到 詳細(xì)的溫度依賴性反應(yīng)動力學(xué)數(shù)據(jù)時，必須對存儲壽命進(jìn)行保守的估計。因此，用于降解反 應(yīng)的低活化能采取為2的Q10值，以便確定產(chǎn)品存儲壽命的保守估計。根據(jù)該原理，反應(yīng)速率 在儲存溫度每上升10度會增加大約一倍，表現(xiàn)出適于反應(yīng)的"最有可能的活化能"。
[0089]從溶液B的兩個批次的加速研究確定適于在40°C下在溶液B中的L-谷胱甘肽分解 的一階速率常數(shù)為0.0643天4，兩個批次為:一個批次在頂部空間中具有氬氣，另一個批次 在頂部空間中沒有氬氣。這些屬性(profiles)-起在圖4中示出。一階指數(shù)衰減在下面的曲 線圖中示出，以及相應(yīng)的線性對數(shù)圖在上面的曲線圖中示出。此外，在該溫度(40°C)下，適 于L-谷胱甘肽的產(chǎn)品規(guī)范接近其期滿約73天的極限。使用上面公式中的參數(shù)，在5°C下存儲 的存儲壽命的保守估計可使用為2的Q10值通過外推法如下估計：
[0091] 其中：
[0092] Shelf Life:存儲壽命
[0093] Days:天
[0094] Months:月
[0095] 因此從該計算可以推斷出當(dāng)產(chǎn)品在5°C下存儲時，溶液B的存儲壽命將被預(yù)測為最 起碼為27個月。
[0096]但是在收集15個月的數(shù)據(jù)之后對在2-8°C下的三個GMP批次的溶液B的穩(wěn)定性的詳 細(xì)實時研究表明，從加速研究的27個月的存儲壽命的估計值可能是非常保守的，并且實際 Q10因子是2.94。
[0097]在5°C下的實時穩(wěn)定性研究迄今進(jìn)展約一年左右。來自這些批次的L-谷胱甘肽降 解的可用的12-15個月的反應(yīng)動力學(xué)數(shù)據(jù)可通過約1.40χ10-3天-1的速率常數(shù)擬合到一階反 應(yīng)動力學(xué)。在這些速率下，L-谷胱甘肽的產(chǎn)品規(guī)范接近其期滿約100個月的極限。出人意料 的是，使用Q10外推技術(shù)基于40°C的加速研究所確定的存儲壽命顯著短于（27個月）由實際 實時數(shù)據(jù)所確定的存儲壽命。這種差異可基于在如下所述的Q10外推期間所做的假設(shè)而被 合理化。
[0098]在圖4中示出在65天的階段期間在40 °C /75 % RH的加速條件下所觀察到的溶液B的 溶液B中L-谷胱甘肽的降解速率。對于幾個其它批次的溶液B而言已經(jīng)觀察到類似的趨勢。 在所有情況下，該反應(yīng)的速率在特性(一階)方面是純指數(shù)性的，暗示相同的消逝時間賦予 分析物濃度(在這種情況下是L-谷胱甘肽的濃度)上隨所研究的時間范圍的相等分?jǐn)?shù)減少。 在表3中總結(jié)出在40°C和5°C二者下對所有十一個批次研究的速率常數(shù)。從指數(shù)擬合導(dǎo)出的 方程中的指數(shù)值是一階速率常數(shù)κι (以天-1為單位）。在每個所研究溫度下的這些值也列于 表3中。
[0099]溫度系數(shù)Q10的為2.94的該實驗導(dǎo)出值高于在存儲壽命的之前計算中使用的為2 的值。Ql〇 = 2的值表示從12千卡/毫摩爾的相對低活化能產(chǎn)生的存儲壽命的非常保守的估 計。另一方面具有Ql〇 = 2.94的值的19千卡/毫摩爾的較高活化能意味著反應(yīng)速率在儲存溫 度每上升10度會增加大約兩倍，與存儲壽命具有相應(yīng)的反比關(guān)系。
[0100]通過為2.94的修正Q10值(其是針對L-谷胱甘肽分解的更具有代表性的為19.0千 卡/摩爾的真實活化能量），溶液B的存儲壽命可通過外推40 °C的存儲壽命數(shù)據(jù)和/或直接從 在5°C下的一年的實時數(shù)據(jù)的指數(shù)擬合來重新計算。修正值列于表3中。
[0101]由這兩種方法得到的結(jié)果差異通過使用Q10值為2(保守）和2.94(經(jīng)驗)通過40°C 的經(jīng)驗數(shù)據(jù)外推在5°C和60°C之間的各種溫度下的存儲壽命的比較中示出。結(jié)果示于表4 中。
[0103]
[0104] 因此，通過下述顯著改善存儲壽命，即通過將GALA溶液的成分分離成較高pH的平 衡鹽溶液(其任選可包括葡萄糖），并在低得多的pH下存儲有機(jī)成分，尤其是L-精氨酸、抗壞 血酸和谷胱甘肽加任選的糖。已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，增加還原型谷胱甘肽的穩(wěn)定性也增加抗壞 血酸和L-精氨酸的穩(wěn)定性。兩種溶液的存儲穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過商業(yè)期望或需求，使得該配制 物更可行和廣泛適用于各種不同的環(huán)境。這提供了改進(jìn)的移植性能的最終結(jié)果，提高移植 物材料的細(xì)胞生存力。
[0105] 這是對本發(fā)明連同實施本發(fā)明的優(yōu)選方法的描述。然而，本發(fā)明本身應(yīng)只由所附 權(quán)利要求限定。
【主權(quán)項】
1. 器官和保存試劑盒，其包括： 包含在第一容器中的第一水性溶液，其中所述第一水性溶液包括平衡鹽溶液，并且所 述第一溶液具有至少為7.0的pH;和 包含在第二容器中的第二溶液，其中所述第二溶液包括水、還原型谷胱甘肽、抗壞血 酸、糖、L-精氨酸，并且所述第二溶液具有為約5.0或更小的pH。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述第一和第二容器是在單個容器內(nèi)的第一和 第二腔室，以及第一和第二腔室通過隔開物從彼此分隔開，其中當(dāng)移除所述隔開物時，所述 第一溶液與所述第二溶液混合以形成整體的器官和組織保存溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述第一溶液的pH為約7.8以及第二溶液的pH為 約 4.0。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述第一溶液的pH為約7.6以及第二溶液的pH為 約5 ·0〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中溶液A和/或B在膠體、軟膏、洗劑或水凝膠中配 制。6. 用于制備器官或組織保存溶液的方法，包括； 制備第一溶液，包括形成具有pH為7.6至約8.0的平衡鹽溶液； 制備pH為約3 - 5的第二溶液，所述第二溶液包括水、D-葡萄糖、L-精氨酸、谷胱甘肽和抗 壞血酸；以及 在使用時將第一溶液與第二溶液混合在一起，以形成具有pH為7.3 ± 0.4的混合溶液。7. 用于保存組織或器官的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法形成溶液，并將組織或 器官與所述溶液接觸。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述組織或器官選自于由下述構(gòu)成的組：隱靜脈、 上腹部動脈、胃網(wǎng)膜動脈、橈動脈、心臟、肺、腎、腦、肌肉移植物、皮膚、腸道、骨骼、附屬器 官、眼睛、以及所述組織或器官的部分。8. 用于保存器官和組織的試劑盒，其包括： 包含在第一容器中的第一水性溶液，其中所述第一水性溶液包括平衡鹽溶液和糖，并 且所述第一溶液具有從約7.6至約8.0的pH;和 包含在第二容器中的第二溶液，其中所述第二溶液包括水、L-精氨酸、還原型谷胱甘肽 和抗壞血酸，并且所述第二溶液具有為約3-5的pH。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中所述第一溶液的pH為約7.6以及第二溶液的pH為 約5 ·0〇10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中將溶液A和/或B在膠體、軟膏、洗劑或水凝膠中 配制。11. 用于制備器官或組織保存溶液的方法，包括； 制備具有PH為約7.6至8.0的第一溶液，其包括水性平衡鹽溶液和糖； 制備PH為約3-5的第二溶液，其包括水、L-精氨酸、谷胱甘肽和抗壞血酸；以及 將第一溶液與第二溶液混合在一起。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述第一溶液的pH為約7.6以及第二溶液的pH為 約5 ·0〇13. 制備溶液的方法，包括將水、谷胱甘肽、L-精氨酸、糖和還原劑混合，并用緩沖劑緩 沖所述溶液，以使溶液具有為從3.0至約5.0的pH。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中糖是葡萄糖。15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述還原劑是抗壞血酸。16. 溶液，其包括水、L-精氨酸、谷胱甘肽、糖、還原劑和緩沖劑。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的溶液，其中所述糖是葡萄糖。18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的溶液，其中所述還原劑是抗壞血酸。19. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的溶液，其中所述緩沖劑是鹽酸溶液。20. 器官和保存試劑盒，其包括： 包含在第一容器中的第一水性溶液，其中所述第一水性溶液包括平衡鹽溶液，并且所 述第一溶液具有至少為7.0的pH;和 包含在第二容器中的第二溶液，其中所述第二溶液包括水、半胱氨酰甘氨酸、抗壞血 酸、糖、L-精氨酸，并且所述第二溶液具有為約5.0或更低的pH。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的器官保存，其中所述第二溶液進(jìn)一步包括還原型谷胱甘肽。22. 用于制備器官或組織保存溶液的方法，包括； 制備第一溶液，包括形成具有為從7.6至約8.0的pH的平衡鹽溶液； 制備pH為約3 - 5的第二溶液，其包括水、D-葡萄糖、L-精氨酸、半胱氨酰甘氨酸和抗壞血 酸；以及 其中所述第一和第二溶液中之一包括糖； 在使用時候?qū)⑺龅谝蝗芤号c第二溶液混合在一起。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述第二溶液進(jìn)一步包括還原型谷胱甘肽。24. 保存活體組織的方法，包括： 將第一水性溶液與第二水性溶液混合，以形成混合溶液，其中所述第一和第二溶液中 之一包括糖； 其中所述第一水性溶液包括平衡鹽溶液且pH至少為7; 其中所述第二溶液包括水、還原型谷胱甘肽、抗壞血酸、L-精氨酸，所述第二溶液的pH 為5.0或更??；以及 將所述組織與所述混合溶液接觸。25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第一溶液的所述pH為約8以及所述第二溶液 的pH為約3。26. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第一溶液的所述pH為約7.6以及所述第二溶 液的所述pH為約5。27. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第二溶液還包括半胱氨酰甘氨酸。28. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述糖是葡萄糖。29. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述混合溶液具有為約7.3 ± 0.4的pH。30. 保存活體組織的方法，包括： 將第一水性溶液與第二水性溶液混合； 其中所述第一水性溶液包括平衡鹽溶液，所述平衡鹽溶液具有為7.6至約8.0的pH;以 及 其中所述第二溶液包括水、葡萄糖、L-精氨酸、還原型谷胱甘肽、抗壞血酸和任選的半 胱氨酰甘氨酸，所述第二溶液的pH為3-5，從而形成混合的溶液并使得所述組織與所述混合 溶液接觸。
【文檔編號】A01N1/02GK105916374SQ201480061943
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年11月18日
【發(fā)明人】馬亨德拉·瑟亞納
【申請人】索瑪解有限公司