金鐵鎖四倍體植株的誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)誘導(dǎo)植物多倍體的育種方法。
【背景技術(shù)】
[000引金鐵鎖（/feMZfflosWene )為石竹科單屬種植物，別名獨(dú)定子、娛蟻?zhàn)?等，生長在海拔2400~3400m的爍石或石灰質(zhì)巖石山中的陽坡、緩坡的云南松林下、林緣、 次生灌叢中或石縫中，能在-22. 4°C低溫生存，較耐寒而不耐高溫，分布于云南、貴州、四川、 西藏等中國西南地區(qū)，其根具有散癒定痛、止血、消痛排賊之功，用于治療跌打損傷、風(fēng)濕 痛、胃痛、創(chuàng)傷出血等，是西南地區(qū)著名的民間藥用植物，也是云南白藥的重要成分。近年來 人為地造成生態(tài)環(huán)境不斷惡化和過度采挖，金鐵鎖資源數(shù)量急劇減少，目前已列入《中國植 物紅皮書》珍稀瀬危物種，屬于國家二級重點(diǎn)保護(hù)植物。
[0003] 在植物育種上，相關(guān)文獻(xiàn)主要目的在于組織的離體培養(yǎng)和快速繁殖。例如，歐陽志 勤，胡化等，"金鐵鎖的離體培養(yǎng)和快速繁殖"W培養(yǎng)基誘導(dǎo)莖段生長叢生芽，切取帶芽莖 段和愈傷組織接種做分化培養(yǎng)形成叢芽等，(植物生理學(xué)通訊[J] ,2002, 38(4): 361)。又 女口，李景濱，易繼財(cái)，張宗申等，"金鐵鎖組培苗快繁技術(shù)研究"WBs+NAAO.Img/L+IBAO. 05 mg/L作為金鐵鎖較適生根培養(yǎng)基，生根率達(dá)83% (廣州農(nóng)業(yè)科學(xué)[J]，2011 (2): 29-31)。 與二倍體相比，多倍體染色體的數(shù)目的增加，通常較二倍體具有明顯優(yōu)勢，除了根、莖、葉等 營養(yǎng)器官具有較粗壯的巨型性特征外，還具有植株的生長速率快、抗倒伏、抗干旱、抗水潰、 抗病蟲、抗低溫和適應(yīng)性強(qiáng)的特性。盡管多倍體植株育性的普遍下降，對于收獲子粒為目 的農(nóng)作物來說是個(gè)致命的缺點(diǎn)，但送不影響根莖類、全草類、葉類、花類之植物，加大植株器 官，可增加藥用活性成分的含量。金鐵鎖主要W根莖為藥用部分，因此，其多倍體育種在生 產(chǎn)上具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是利用組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合秋水仙素處理，進(jìn)行金鐵鎖多倍體的誘 導(dǎo)，并經(jīng)多次分化培養(yǎng)，選育出性狀穩(wěn)定的金鐵鎖四倍體植株。
[0005] 上述目的是通過W下方式實(shí)現(xiàn)的： (一）金鐵鎖四倍體植株的誘導(dǎo)方法 包括W下步驟： (1) 金鐵鎖莖段在MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 05mg/L巧DZ0.Olmg/L的分化培養(yǎng)基中預(yù)培 養(yǎng)2~3d，取出莖段，轉(zhuǎn)接至含濃度30~40mg/L秋水仙素的上述分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng) 1~3d; (2) 金鐵鎖莖段接種在未附加秋水仙素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d，該分化培養(yǎng)基為： MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 05mg/L+TDZ0.Olmg/L； (3) 切取步驟（2)變異明顯且長至I~2cm芽苗的幼嫩莖段，接種在未附加秋水仙素的 MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 05mg/L+TDZ0.Olmg/L的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d，再次誘導(dǎo)芽苗； (4) 重復(fù)步驟（3) 5~7次，得到穩(wěn)定的多倍體性狀的變異芽苗； (5) 當(dāng)變異芽苗的苗長至2cm時(shí)，將其接種在1/2MS+0. 3mg/LIBA+0.Img/LNAA+ 0. 3g/ LCA的生根培養(yǎng)基上，其生根率可達(dá)91. 7%;該變異株組培苗根尖細(xì)胞的中期染色體數(shù)目 為化=4x=56,即為四倍體。
[0006] 所述的方法是：步驟（1)所述金鐵鎖莖段在上述分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3d， 秋水仙素濃度為40mg/L，秋水仙素誘導(dǎo)處理2d。
[0007] 所述的方法是：步驟（2)金鐵鎖莖段接種在未附加秋水仙素的分化培養(yǎng)基 MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 05mg/L+TDZ0.Olmg/L上培養(yǎng) 25d，其誘導(dǎo)變異率達(dá)到 41. 59〇/〇。
[000引本發(fā)明的積極效果和意義是： (1)秋水仙素濃度與多倍體誘變率相關(guān)，本發(fā)明試驗(yàn)表明，在相對較低的死亡基礎(chǔ)上，W上金鐵鎖幼嫩莖段誘導(dǎo)處理時(shí)間和濃度的組合獲得的誘導(dǎo)率較高。
[0009] (2)W金鐵鎖幼嫩莖段為多倍體誘導(dǎo)的外植體，經(jīng)分化培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)，繼而在附加 秋水仙素的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)處理，之后轉(zhuǎn)入未附加秋水仙素的上述分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 可誘導(dǎo)出變異明顯的芽苗，其變異率可達(dá)到41. 59%;截取明顯變異的芽苗莖段重復(fù)分化培 養(yǎng)多次，得到變異穩(wěn)定的多倍化芽苗，再進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根率達(dá)91. 7%。
[0010] (3)金鐵鎖變異植株葉片長、寬和厚度的平均值均大于二倍體。其中，長、寬和厚度 分別是二倍體的1. 36倍、1. 69倍和1. 44倍。變異植株根、莖平均值同樣大于二倍體，分別 是二倍體的3. 39倍和2. 00倍。與二倍體植株相比，金鐵鎖多倍體植株葉片變大變厚，莖桿 變粗變短，尤其是根莖明顯粗壯，為二倍體的3倍W上，研究表明，多倍體植物在生長過程 中可加速積累次生代謝物，顯著提高植物的生物活性物質(zhì)含量。為此，將大幅提高藥材的產(chǎn) 量，增加經(jīng)濟(jì)收入。
【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明金鐵鎖變異植株。
[0012] 圖2是本發(fā)明金鐵鎖對照植株。
[0013] 圖3是本發(fā)明四倍體金鐵鎖根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為化=4X=56。
[0014] W下結(jié)合本發(fā)明【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說明。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 一、多倍體材料的誘導(dǎo)培養(yǎng) 試驗(yàn)材料是金鐵鎖組培苗。經(jīng)組培苗根尖細(xì)胞染色體鑒定為二倍體，數(shù)目為化=2x=28。 該組培苗莖段在WMS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA0. 5mg/L、NAA0. 05mg/L和TDZO.Olmg/L的分 化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2~3d后移至附加30mg/L、40mg/L秋水仙素的上述培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng) 1~3d，再接入未附加秋水仙素的上述培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d，獲取變異植株。
[0016] 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)方案共9種預(yù)培養(yǎng)處理方法，如表1所示，分別在附加有30mg/L和 40mg/L秋水仙素的上述培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并設(shè)W對照1組，共計(jì)處理19個(gè)。
[0017] 表1 30mg/L和40mg/L秋水仙素誘導(dǎo)培養(yǎng)基

死亡率=死亡的外植體數(shù)/接種時(shí)的總外植體數(shù)X100% ; 誘導(dǎo)率=發(fā)生變異莖段數(shù)/誘導(dǎo)莖段總數(shù)X100% ; 變異率=形態(tài)發(fā)生變異的株數(shù)/植株總數(shù)X100%。
[0018] 二、秋水仙素對金鐵鎖的誘導(dǎo)效果 從表2中可看出，30和40mg/L兩種秋水仙素濃度對金鐵鎖多倍體的誘導(dǎo)都有一定的效 果。數(shù)據(jù)顯示，金鐵鎖莖段在分化培養(yǎng)基上預(yù)處理3d后，用含40mg/L秋水仙素處理2d的 誘導(dǎo)效果最佳，經(jīng)在未附加秋水仙素的分化培養(yǎng)基上繼續(xù)分化25d后，其誘導(dǎo)變異率可達(dá) 41. 59%，見表 14 行。
[0019] 表2秋水仙素對金鐵鎖誘導(dǎo)效應(yīng)
H、變異芽苗的生根培養(yǎng) 當(dāng)變異穩(wěn)定的多倍化芽苗長至2cm高時(shí)，去除其基部愈傷組織，將其接種在 1/2MS+0. 3mg/LIBA+0.Img/LNAA+ 0. 3g/LCA的生根培養(yǎng)基上，生根率可達(dá) 91. 7〇/〇。
[0020] 四、變異植株的形態(tài)觀察和染色體計(jì)數(shù) (1)形態(tài)觀察 對具有多倍體特性的多倍化幼苗進(jìn)行外部形態(tài)的觀察巧日圖1)，并與對照植株巧口圖 2)做比較，觀察葉片長寬、葉片厚度、節(jié)間距、莖的直徑、根的直徑等，觀察結(jié)果如表3所示。
[0021] 表3變異株與二倍體對照植株的外部形態(tài)平均值比較
由表3可W看出，變異植株的葉片與對照植株有明顯變化，平均葉長、葉寬和葉厚都變 大，其長、寬和厚度平均值分別是二倍體植株的1. 36倍、1. 69倍和1. 44倍。變異株的莖和 根的直徑與對照株相比較都明顯變大，與此同時(shí)，節(jié)間距與對照株比較明顯變短。
[0022] (2)對變異株組培苗的根尖細(xì)胞染色體進(jìn)行觀察，獲得的多倍體變異植株的染色 體數(shù)目為化=4X=56 (如圖3 )，為四倍體。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 金鐵鎖四倍體植株的誘導(dǎo)方法，其特征是包括以下步驟： (1) 金鐵鎖幼嫩莖段在MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 05mg/L+TDZ0.Olmg/L的分化培養(yǎng)基中 預(yù)培養(yǎng)2~3d，取出莖段，轉(zhuǎn)移至含濃度30~40mg/L秋水仙素的上述分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培 養(yǎng)1~3d，使部分金鐵鎖二倍體細(xì)胞成為四倍體細(xì)胞； (2) 取步驟（1)經(jīng)秋水仙素分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)的莖段接種在未附加秋水仙素的分化 培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d，該分化培養(yǎng)基為： MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 05mg/L+TDZ0. 01mg/L； (3) 切取步驟（2)變異明顯且長至1~2cm芽苗的幼嫩莖段，接種在未附加秋水仙素的 MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 05mg/L+TDZ0. 01mg/L的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d，再次誘導(dǎo)芽苗； (4) 重復(fù)步驟（3) 5~7次，得到多倍體性狀穩(wěn)定的變異芽苗； (5) 當(dāng)變異芽苗的苗長至2cm時(shí)，將其接種在l/2MS+0.3mg/LIBA+0.1mg/LNAA+ 0.3g/ LCA的生根培養(yǎng)基上，其生根率可達(dá)91. 7%，該變異株組培苗根尖細(xì)胞的中期染色體數(shù)目為 2n=4x=56，即為四倍體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是：所述步驟（1)金鐵鎖莖段在上述分化培養(yǎng)基 上預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3d，秋水仙素濃度為40mg/L，秋水仙素誘導(dǎo)處理2d。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是：步驟（2)金鐵鎖莖段接種在未附加秋水 仙素的分化培養(yǎng)基MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 05mg/L+TDZ0. 01mg/L上培養(yǎng)25d，其誘導(dǎo)變異率 達(dá)到 41. 59%。
【專利摘要】金鐵鎖四倍體植株的誘導(dǎo)方法，屬于化學(xué)誘導(dǎo)植物多倍體的育種方法。本發(fā)明金鐵鎖莖段在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2～3d，用含40mg/L秋水仙素處理2d，然后再將誘導(dǎo)后的莖段接種至未附加秋水仙素的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)25d，其誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)變異率達(dá)到41.59%。與正常二倍體芽苗比較，變異芽苗的葉片大、葉色深、葉片厚、節(jié)間短、莖桿和根粗。切取變異的芽苗莖段重復(fù)7次分化培養(yǎng)，使其體細(xì)胞同質(zhì)化，得到穩(wěn)定的變異芽苗；將其接種于1/2MS+0.3mg/L？IBA+0.1mg/L？NAA+0.3g/L？CA生根培養(yǎng)基，生根率為91.7%。對變異后的組培苗根尖染色體計(jì)數(shù)，該細(xì)胞中期染色體數(shù)目為2n=4x=56，即為四倍體。
【IPC分類】A01H1/08, A01H4/00
【公開號】CN105340735
【申請?zhí)枴緾N201510668992
【發(fā)明人】辛培堯, 羅一然, 唐軍榮, 李斌, 何承忠, 孫正海, 田斌, 施蕊
【申請人】西南林業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年10月13日