一種間歇浸沒式蘭科植物類原球莖增殖快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蘭花類原球莖(Protocrm-1ikeBody，PLB)的增殖和再生的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具有繁殖數(shù)量多且快速、實驗條件易控制、可連續(xù)生產(chǎn)、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于作物育種及種質(zhì)資源保存以及花卉、果樹、蔬菜、林木及中草藥的脫毒苗生產(chǎn)與快繁無性繁殖等方面，例如百合脫毒籽球的無性快速繁殖。
[0003]傳統(tǒng)的固體或半固體組織培養(yǎng)方式需要耗費大量的瓊脂，并且在灌裝及清洗時需處理大量容器，故耗費大量勞動力，導(dǎo)致生產(chǎn)成本居高不下。
[0004]目前國內(nèi)外設(shè)計發(fā)明了一些植物組織間歇浸沒式培養(yǎng)裝置，其優(yōu)勢:一方面間歇式浸沒培養(yǎng)方式使氣體交換充分，氧氣供應(yīng)充足，降低了普通液體培養(yǎng)易產(chǎn)生畸形苗與玻璃化苗的機率，從而提高了培養(yǎng)質(zhì)量與繁殖效率，另外，間歇式浸沒培養(yǎng)方式利用自動化調(diào)控元件，輔助組織培養(yǎng)過程，減少了勞動密度，降低培養(yǎng)成本。但是，這類裝置通常設(shè)備龐大，不易拆卸或移動，且控制元件復(fù)雜，維護成本較高，而且它們也不易于簡便的無菌人工接種操作以及高效的裝置整體清洗以及滅菌處理。
[0005]目前國內(nèi)關(guān)于間歇浸沒培養(yǎng)蘭花PLB的報道極少，文心蘭組培體系的優(yōu)化及其圓球莖在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的研究(楊金風，碩士論文)對比了固體培養(yǎng)，液體振蕩培養(yǎng)，5L氣球型生物反應(yīng)器全浸沒培養(yǎng)及間歇浸沒培養(yǎng)對圓球莖干鮮重增加及增殖系數(shù)的作用，發(fā)現(xiàn)生物反應(yīng)器效果最好，其次液體振蕩培養(yǎng)，最后是固體培養(yǎng)。專利號為CN 101768566A公開了一種鐵皮石斛的間歇式發(fā)酵培養(yǎng)方法，但是兩項研究均未對最為重要的間歇浸沒培養(yǎng)裝置進行介紹和改進，而該裝置的大小形狀及植物材料的放置方式均會外植體的增殖效率產(chǎn)生重大影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種間歇浸沒式蘭科植物類原球莖增殖快繁方法。
[0007]本發(fā)明提供一種間歇浸沒式蘭科植物類原球莖增殖快繁方法，其包括如下步驟:
[0008]I)將外植體進行無菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得蘭科植物類原球莖(PLB);
[0009]2)將步驟I)獲得的PLB置于連通器式間歇式植物組織培養(yǎng)裝置內(nèi)進行間歇浸沒式培養(yǎng);
[0010]所述的連通器式間歇式植物組織培養(yǎng)裝置包括培養(yǎng)容器裝置、載物構(gòu)件和運輸配件，所述的培養(yǎng)容器裝置包括容器主體以及通過螺紋嚙合的密封蓋體；所述容器密封蓋體頂部設(shè)有氣體交換的通孔；所述容器主體側(cè)壁的一端其底部與頂部均各設(shè)一外伸開孔；所述載物構(gòu)件包括載物篩盤以及固定框架，單個載物篩盤通過多個摞疊置于固定框架內(nèi)，而固定框架再擱置于所述培養(yǎng)容器內(nèi)；所述的運輸配件包括硅膠軟管、蠕動栗和儲液容器，通過兩條硅膠軟管與所述的培養(yǎng)容器、蠕動栗、儲液容器相連接。
[0011]其中，所述通孔的向下延伸管內(nèi)裝有殺菌纖維團和微孔濾膜，底部由不封口的螺紋塞固定。
[0012]其中，所述固定框架包括空心圓盤底座、垂直焊接于圓盤直徑兩邊的固定桿和連接固定桿的提手；所述的空心圓盤底座包括空心圓環(huán)以及由空心圓環(huán)圓心輻射出三條兩兩角度為120度且與空心圓環(huán)相接的焊接桿，且焊接桿連接于空心圓環(huán)的位置再垂直向下延伸出支腿。
[0013]其中，兩條硅膠軟管使所述的容器主體與儲液容器相連接，其中，第一條硅膠軟管一端與容器主體底部外伸開孔相連，另一端與儲液容器下部開口相連；第二條娃膠軟管一端與容器主體頂部外伸開孔相連，另一端與儲液容器上部開口相連；所述第一條硅膠軟管嵌入婦動栗。
[0014]其中，所述儲液容器還設(shè)置有液體培養(yǎng)基注入口。所述的主入口還設(shè)置有密封蓋。
[0015]其中，所述培養(yǎng)容器裝置整體為透明可高壓滅菌PC材質(zhì)。
[0016]其中，所述連通器式間歇式植物組織培養(yǎng)裝置使用前，整體或各個部件經(jīng)高溫高壓滅菌，將蘭科植物的無菌PLB平鋪于滅菌后的載物篩盤上，每個載物篩盤放置100-150個PLB，將多個裝有PLB的載物篩盤摞疊并置于固定框架內(nèi)，再將其放入培養(yǎng)容器內(nèi)，使用蓋體密封。
[0017]在本發(fā)明一個實施方案中，設(shè)置間歇式培養(yǎng)的程序，分別設(shè)為早上9 一 10點，下午15-17點和晚上21 — 22點各I個小時，蠕動栗會在設(shè)定時間內(nèi)將儲液袋內(nèi)的培養(yǎng)基推入與排出培養(yǎng)容器主體。
[0018]其中，每培養(yǎng)5-10天，更新儲液溶液內(nèi)的液體培養(yǎng)基。
[0019]在本發(fā)明一個實施方案中，所述的液體培養(yǎng)基為可將蘭科植物PLB進行增殖的液體培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所培養(yǎng)的蘭科植物的種類，選擇適合適合該物種的增殖液體培養(yǎng)基。
[0020]本發(fā)明優(yōu)點:培養(yǎng)空間利用率高且利于培養(yǎng)氣體成分交換，從而提高培養(yǎng)物質(zhì)量與繁殖系數(shù)，適宜大規(guī)模生產(chǎn)；培養(yǎng)裝置及配件，易于整體消毒滅菌，培養(yǎng)過程全封閉，污染機率??；結(jié)構(gòu)簡單緊湊，耗能低，節(jié)約了培養(yǎng)空間，降低了組培成本。蘭科植物類原球莖為分化能力非常強的胚性組織，任意方向均有增殖和分化能力，于液體培養(yǎng)基中間歇浸沒培養(yǎng)更有利于其各個表面的對培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的快速吸收，同時能保證氧氣供給，因此該方法能大大提高PLB的培養(yǎng)效率。
[0021]若按每個載物篩盤放置100 - 150個PLB進行培養(yǎng)，每隔4周進行一次切割，扣除損耗每個PLB能切割為3-4個PLB，即增殖3_4倍。此培養(yǎng)容器若摞疊9層載物篩盤，單個培養(yǎng)容器經(jīng)過4周可使900-1350個GGB增殖到3000-5000個PLB，大大提高了 PLB增殖效率。
【附圖說明】
[0022]圖1所示為本發(fā)明連通器式間歇式植物組織培養(yǎng)裝置示意圖。
[0023]圖2所示為本發(fā)明連通器式間歇式植物組織培養(yǎng)裝置中的載物構(gòu)件示意圖。
【具體實施方式】
[0024]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0025]結(jié)合附圖1-2對本發(fā)明的連通器式間歇式植物組織培養(yǎng)裝置進行詳細說明。
[0026]本發(fā)明的連通器式間歇式植物組織培養(yǎng)裝置包括培養(yǎng)容器裝置、載物構(gòu)件和運輸配件。所述的培養(yǎng)容器裝置整體為透明可滅菌PC材質(zhì)，包括容器主體I以及通過螺紋嚙合的密封蓋體2 ;其中所述容器主體為圓柱形腔體，其側(cè)壁的一端頂部與底部均各設(shè)一外伸開孔3和4 ;所述密封蓋體其頂部設(shè)有氣體交換的通孔5，其中通孔5的向下延伸管內(nèi)裝有殺菌纖維團和微孔濾膜，底部由不封口的螺紋塞固定。
[0027]所述的載物構(gòu)件放置于所述培養(yǎng)容器內(nèi)，包括可摞疊的單個圓柱形不銹鋼載物篩盤8以及承載載物篩盤的不銹鋼固定框架9 ;所述的載物篩盤8底壁與側(cè)壁均由篩網(wǎng)構(gòu)成，可多個摞疊置于固定框架9內(nèi)；所述固定框架包括空心圓盤底座、垂直焊接于圓盤直徑兩邊的固定桿902和連接固定桿的提手903 ;所述的空心圓盤底座包括空心圓環(huán)901以及由空心圓環(huán)901圓心輻射出三條兩兩角度為120度且與空心圓環(huán)901相接的焊接桿904，且焊接桿904連接于空心圓環(huán)901的位置再垂直向下延伸出支腿905。
[0028]所述運輸配件包括兩條耐高溫硅膠軟管、蠕動栗以及非PVC復(fù)合膜圓柱形儲液容器6 ;其中通過兩條硅膠軟管使所述的容器主體I與儲液容器6相連接，所述的第一條硅膠軟管7 —端與容器主體I頂部外伸開孔4相連，另一端與儲液容器開口 10相連。此開口主要調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器與儲液容器之間氣體的交換，保證培養(yǎng)過程氣體的循環(huán)流通。所述第二條娃膠軟管11 一端與容器主體I底部外伸開孔3相連，另一端與儲液容器開口 14相連。此開口主要是控制培養(yǎng)容器與儲液容器之間液體的交換，保