一種寶興百合組培快繁和離體保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及植物寶興百合(Lilium duchartreiFranch.)的組培快繁和離體保存方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]寶興百合(Lilium duchartrei Franch.)為百合科百合屬植物，中國特有，主要分布于我國四川、云南、西藏和甘肅等省區(qū)，生于海拔2300-3500米的高山草地、林緣或灌木叢中。寶興百合是亞洲產(chǎn)百合種類中唯一具香味、花白色、花瓣反卷的野生種類。寶興百合以鱗莖入藥，潤肺止咳，清熱安神，可用于治療肺結(jié)核，慢性支氣管炎等癥。寶興百合是培育香花型百合品種的潛在親本，不僅是百合育種研宄中的優(yōu)異種質(zhì)材料，而且其自身也具有極大的商業(yè)開發(fā)潛力。我國百合屬植物資源豐富，是世界百合育種重要的親本來源。百合屬植物組培繁殖相關(guān)工作已有報(bào)道，但大多集中在具有觀賞價值的園藝品種或雜交種。目前，針對我國的野生百合種質(zhì)資源組培繁殖和離體保存方面的工作有很少報(bào)道。其中如專利公開號為CN104663458A的關(guān)于川百合的組培快繁，CN102204512B的關(guān)于細(xì)葉百合的組培快繁的報(bào)道，這兩種野生百合的組培繁殖強(qiáng)度也較大，在不定芽誘導(dǎo)方面采用了不同的培養(yǎng)基。寶興百合雖已有組培快繁和離體保存方面的探索，但在增殖情況和離體保存繼代周期方面仍不盡如人意，如，傅伊倩(2012，幾種野生百合離體保存技術(shù)的研宄)以寶興百合的葉片為外植體，在MS+NAA2.0mg/L+TDZ 0.2mg/L培養(yǎng)基中，其增值系數(shù)僅為3.29，在1/2MS+NAA 0.5mg/L+活性炭2g/L的離體保存培養(yǎng)基中，繼代周期也僅為I個月。為使寶興百合這一中國特有的野生種質(zhì)資源能實(shí)現(xiàn)人工大規(guī)模繁殖，實(shí)現(xiàn)更加有效的離體保存，節(jié)省人力物力，需要提供一種寶興百合更有效率的組培快繁和離體保存方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0003]本發(fā)明的目的在于提供現(xiàn)有技術(shù)中未有的一種中國特有、極具觀賞和藥用潛力的植物寶興百合的組培快繁和離體保存方法。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
[0005]寶興百合(Lilium duchartrei Franch.)的組培快繁和離體保存方法，取寶興百合的中層鱗片進(jìn)行消毒后，接種在不定芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基上，獲得小鱗莖后，轉(zhuǎn)接到可使鱗莖增大及生根的培養(yǎng)基中，經(jīng)過煉苗處理后，即可移栽。去除長根且增大的鱗莖的根和葉，置于離體保存培養(yǎng)基中，在低溫條件下培養(yǎng)，離體保存周期可延長至4年。
[0006]上述方法的不定芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基為⑴MS+BA 0.5mg/L+2, 4_D 1.0mg/L ; (2)鱗莖增大及生根培養(yǎng)基:MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L ; (3)離體保存培養(yǎng)基:MS+PPP3330.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ0.06mg/L。以上培養(yǎng)基(I)和(3)添加蔗糖20g/L，(2)添加蔗糖90g/L，(2)和(3)添加活性炭l_2g/L。所有培養(yǎng)基均添加瓊脂5.6g/L固化，pH5.8，除離體保存培養(yǎng)條件為13±2°C外，其余培養(yǎng)溫度均為25±2°C，光照強(qiáng)度 10-20 μ mol/ (m2.s)，光照 12h/d。
[0007]具體地，本發(fā)明的方法是野外獲取寶興百合的鱗莖，用濕苔蘚包裹帶回實(shí)驗(yàn)室，將鱗莖表面泥土用紗布搽洗干凈，選取中層鱗片放入已滴加2-3滴洗潔精的自來水中浸泡5min，再用流動自來水沖洗30-40min，再用75%酒精進(jìn)行表面消毒20_30s，并用無菌水沖洗5遍，再用0.1 % HgCljK溶液進(jìn)行消毒16-20min，在無菌條件下用無菌水反復(fù)水洗3遍，將鱗片接種至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L+2, 4_D 1.0mg/L中，15天后長出愈傷組織，30天后出現(xiàn)芽分化，并有新葉片長出，繼續(xù)在此培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)2-3次，20天繼代一次，增值率可達(dá)1: 10 ;將新增殖的鱗莖轉(zhuǎn)接在生根培養(yǎng)基MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L，培養(yǎng)15天，可長根4條以上，在此培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，在誘導(dǎo)生根的同時鱗莖能增大至直徑1.5-2.0cm0將已生根增大的鱗莖去除根葉，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基MS+PPP3330.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.06mg/L中，培養(yǎng)瓶口用保鮮膜纏繞6圈以上封嚴(yán)，在培養(yǎng)溫度為13±2°C條件下，繼代周期可延長至4年以上。將生根4條左右、根長為l-2cm的小苗煉苗處理移栽至經(jīng)5%甲醛水溶液消毒過的腐葉土:沙土:珍珠巖=1:1:1的基質(zhì)中，移栽成苗率90%以上。
[0008]更具體地，寶興百合的組培快繁和離體保存方法包括獲取外植體、誘導(dǎo)不定芽與增殖培養(yǎng)、鱗莖增大及生根培養(yǎng)、離體保存、移栽步驟，培養(yǎng)條件為:(1)不定芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基:MS+BA 0.5mg/L+2, 4_D 1.0mg/L ；⑵鱗莖增大及生根培養(yǎng)基:MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L ;(3)離體保存培養(yǎng)基:MS+PPP3330.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ0.06mg/L，以上培養(yǎng)基(I)和(3)添加蔗糖20g/L，(2)添加蔗糖90g/L，(2)和(3)添加活性炭l_2g/L，所有培養(yǎng)基均添加瓊脂5.6g/L固化，pH5.8，除離體保存培養(yǎng)條件為13±2°C夕卜，其余培養(yǎng)溫度均為25±2°C，光照強(qiáng)度10-20 μ mol/(m2.s)，光照12h/d ；
[0009]所述獲取外植體步驟是取野生寶興百合的鱗莖，洗凈，選取中層鱗片放入已滴加2-3滴洗潔精的自來水中浸泡5min，再用流動自來水沖洗30_40min以清除鱗片表面雜質(zhì)。將經(jīng)過初步清洗的鱗片用75%酒精進(jìn)行表面消毒20-30S，并用無菌水沖洗5遍，用0.1%HgCljK溶液進(jìn)行消毒16_20min，在無菌條件下用無菌水反復(fù)水洗3遍，用濾紙吸干表面水分，切去已經(jīng)損傷的組織待用；
[0010]所述誘導(dǎo)不定芽與增殖培養(yǎng)步驟是將鱗片接種至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(I)上，每瓶接種5個外植體；待長出愈傷組織，出現(xiàn)芽分化，長出新葉片后，繼續(xù)在此培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)2-3次，20天繼代一次，增值率可達(dá)1: 10 ;
[0011]所述的鱗莖增大及生根培養(yǎng)是將新增殖的鱗莖轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基(2)上，每瓶接種5個，培養(yǎng)15天，長根4條以上，生根率100% ;在此培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，在誘導(dǎo)生根的同時鱗莖增大至直徑達(dá)1.5-2.0cm ；
[0012]所述的離體保存步驟是將生根且增大的鱗莖去除根葉，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基(3)中，每瓶接種5個，培養(yǎng)瓶口用保鮮膜纏繞6圈以上封嚴(yán)，以減弱后期瓶苗的呼吸作用，培養(yǎng)條件調(diào)整為13±2°C，光照強(qiáng)度為10ymOl/(m2.s)，光照12h/d，繼代周期可延長至4年以上；
[0013]所述的移栽步驟是當(dāng)寶興百合鱗莖生根達(dá)4條以上，根長為l-2cm時，先將瓶苗放在大棚內(nèi)煉苗2天，后半開蓋煉苗5天，然后進(jìn)行移栽；移栽基質(zhì)為經(jīng)5%甲醛水溶液消毒過的腐葉土:沙土:珍珠巖=I: I: 1，栽好后澆透定根水，先期用塑料薄膜覆蓋保濕，視苗生長狀況進(jìn)行及時通風(fēng)以防過濕霉變，待試管苗長出新葉后，揭膜粗放管理，移栽成苗率達(dá)90%以上。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)益性在于:
[0015]本發(fā)明以寶興百合的鱗片為外植體，通過不定芽誘導(dǎo)、鱗莖增殖、生根和離體保存等步驟，建立了寶興百合的組培快繁和離體保存體系，增值系數(shù)高達(dá)1: 10，離體保存繼代周期達(dá)4年以上。該方法有效地解決了寶興百合的組培快繁問題，大大延長了離體保存周期，有利于寶興百合種質(zhì)資源的保存和開發(fā)利用，為寶興百合的育種工作奠定了基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
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[0016]為了更好地說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案和實(shí)施例的描述，也許同領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上還可以對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行一些修改和改進(jìn)。因此，在不偏離本發(fā)明主要技術(shù)方案的基礎(chǔ)上所做的修改和改進(jìn)，均應(yīng)屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0017]實(shí)施例1:
[0018]1、材料:寶興百合(Lilium duchartrei Franch.)。
[0019]2、材料類別:寶興百合的中層鱗片。
[0020]3、培養(yǎng)條件:(