一種鐵皮石斛化學(xué)消毒組培方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，具體涉及一種鐵皮石斛化學(xué)消毒組培方法， 屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo)為蘭科氣生草本植物，又名 黑節(jié)草，為石斛之極品，具有獨(dú)特的藥用價值，鐵皮石斛生長環(huán)境特殊及其自我繁殖能力較 為低下，加之人們的過度采挖，造成其野生資源日趨減少甚至瀕臨絕種，因此通過組織培養(yǎng) 技術(shù)，對鐵皮石斛進(jìn)行集約化人工栽培，是保護(hù)和利用鐵皮石斛資源的必要途徑。建立高 效的鐵皮石斛組織快繁體系成為解決種苗問題，推進(jìn)鐵皮石斛良性發(fā)展的有效途徑。
[0003]采用鐵皮石斛的莖段進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，具有取材易、繁殖系數(shù)高、遺傳變異 率低、繁殖速度快等優(yōu)點(diǎn)，能在較短時間內(nèi)為商業(yè)栽培提供大量標(biāo)準(zhǔn)化優(yōu)良種苗。實現(xiàn)鐵皮 石斛的商業(yè)栽培不但為種植者創(chuàng)造豐厚的經(jīng)濟(jì)效益，還一定程度上對保護(hù)野生資源和生態(tài) 環(huán)境具有重要意義。
[0004] 鐵皮石斛組織培養(yǎng)，一方面可以擴(kuò)大其繁殖系數(shù)，從而實現(xiàn)規(guī)?；敝?；另一方 面，可以在保存其原有的優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)鐵皮石斛的種質(zhì)資源保存和轉(zhuǎn)基因研宄 等。鐵皮石斛組織培養(yǎng)的成本主要包括組培苗生產(chǎn)所需的培養(yǎng)基、設(shè)施設(shè)備、供電成本、耗 材和人工成本。常規(guī)的鐵皮石斛組織培養(yǎng)方法要求外植體接種在高溫高壓滅菌后的無菌培 養(yǎng)基中才能正常生長，耗能大，人工操作成本高。如果能通過化學(xué)消毒的方法來改造培養(yǎng) 基，使培養(yǎng)基在不需要進(jìn)行高溫高壓滅菌，就能夠獲得鐵皮石斛的正常生長。這樣，一方面 可以降低鐵皮石斛組織培養(yǎng)對設(shè)施設(shè)備的要求，尤其不需要高溫高壓滅菌所需配置的高壓 鍋設(shè)備，縮減了投資成本，電能消耗也將大幅度降低；另一方面，采用這種培養(yǎng)基開展鐵皮 石斛組織培養(yǎng)，組培環(huán)節(jié)大為簡化，人工操作的速度大幅提高，從而降低了人工成本。此外， 由于改造后的培養(yǎng)基自身具有殺菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制組織培養(yǎng)過程中的污染 問題，又不會對鐵皮石斛生長產(chǎn)生毒害或抑制，即不影響鐵皮石斛的正常生長，從根本上簡 化了鐵皮石斛組織培養(yǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種鐵皮石斛化學(xué)消毒組培方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0007] 本發(fā)明的一種鐵皮石斛化學(xué)消毒組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、誘導(dǎo) 培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽，其特征在于：
[0008] 1.培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶瓶蓋及接種用的不銹鋼盤在100mg/L次氯酸鈉+IOmg/ L乳酸鏈球菌素+100mg/L丙酸鈣的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?br>[0009] 2.培養(yǎng)基配制：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1~3mg/L6-BA+0. 1~I. 0mg/LNAA+40~ 100mg/L次氯酸鈉+1~5mg/L乳酸鏈球菌素+10~50mg/L丙酸1? +20g/L鹿糖+3. 0g/L瓊 脂粉，pH5. 8 ;增殖培養(yǎng)基為：MS+1.O~2mg/L6-BA+O. 1~I.Omg/LNAA+40~lOOmg/L次氯 酸鈉+1~5mg/L乳酸鏈球菌素+10~50mg/L丙酸1? +20g/L鹿糖+3.Og/L瓊脂粉，pH5. 8 ; 壯苗培養(yǎng)基為 MS+0. 1~0? 5mg/L6-BA+0. 5~I.Omg/LNAA+40~100mg/L次氯酸鈉+1~ 5mg/L乳酸鏈球菌素+10~50mg/L丙酸鈣+20g/L蔗糖+3.Og/L瓊脂粉，pH5. 8 ;生根培養(yǎng) 基為1/2MS+0. 5~I. 5mg/LNAA+40~100mg/L次氣酸納+1~5mg/L乳酸鏈球菌素+10~ 50mg/L丙酸鈣+20g/L蔗糖+3.Og/L瓊脂粉，pH5. 8 ;所述MS培養(yǎng)基為1962年，Murashige 和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述6-BA，指6-芐氨基嘌吟；所述NAA，指^-萘乙酸；配制培 養(yǎng)基時，先稱各培養(yǎng)基配方中蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總體積1/2的自來水，加熱至瓊脂粉 完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容、然后用lmol/L的NaOH或lmol/L的 HCl調(diào)pH值至5. 8,分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固后備用；
[0010] 3.誘導(dǎo)培養(yǎng)：取健壯的鐵皮石斛莖段，剪除葉、根，洗凈后在無菌操作臺上切成帶 有莖節(jié)的1~2cm小段，于體積比為75%酒精中浸20s，然后在重量比為0. 1 %升采溶液中 消毒10~20min，取出用無菌水沖洗3次后，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40d后出現(xiàn)黃綠色 斑點(diǎn)，60d后斑點(diǎn)變綠出現(xiàn)小芽；培養(yǎng)室溫度為26°C，光照12h，光照強(qiáng)度為14001x ;
[0011] 4.增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)培養(yǎng)的小芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，每30d轉(zhuǎn)接一次，大量增殖叢 生芽；培養(yǎng)室溫度為26°C，光照12h，光照強(qiáng)度為14001x ;
[0012] 5.壯苗培養(yǎng)：將增殖培養(yǎng)的叢生芽接種到壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d成為叢生芽苗； 培養(yǎng)室溫度為26°C，光照12h，光照強(qiáng)度為14001x ;
[0013] 6.生根培養(yǎng)：取壯苗培養(yǎng)的高度為4~6cm的叢生芽苗，切成單株，接種到生根培 養(yǎng)基上，25d后形成完整植株；培養(yǎng)室溫度為25°C，光照12h，光照強(qiáng)度為15001x ;
[0014] 7.瓶苗移栽：將生根培養(yǎng)獲得的完整植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的多 菌靈浸泡30min后移栽至鐵皮石斛的栽培基質(zhì)，所述栽培基質(zhì)，指含有占基質(zhì)體積為1/2的 發(fā)酵后的花生殼、或發(fā)酵后的松樹皮（或泥炭、或鋸末、或上述各原料的混合物，以及占基 質(zhì)體積1/2的碎石、珍珠巖，然后，在基質(zhì)表面覆以苔蘚；大棚上層用遮光網(wǎng)遮蓋，移栽的環(huán) 境溫度為15~30 °C。
[0015] 本發(fā)明的應(yīng)用效果：
[0016] 由于本發(fā)明的化學(xué)消毒組培方法，利用化學(xué)試劑添加到各種培養(yǎng)基中，達(dá)到滅菌 或抑菌的效果。所以，配制的培養(yǎng)基無需高溫高壓滅菌。因此，在鐵皮石斛誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖 培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)各個階段的影響，除了要考慮常用的評價指標(biāo)外，還要考慮污染 率的問題。
[0017] 1.誘導(dǎo)培養(yǎng)：通過實驗證實，本發(fā)明的一種鐵皮石斛的化學(xué)消毒組培方法與常規(guī) 的鐵皮石斛組培方法比較，結(jié)果如表1所示，誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的外植體培養(yǎng)的成活率和污染 率都沒有太大差異。
[0018] 表1本發(fā)明的化學(xué)消毒組培方法對鐵皮石斛誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響
[0019]

[0020] 2.增殖培養(yǎng)：本發(fā)明的化學(xué)消毒組培方法與常規(guī)組培鐵皮石斛的增殖倍數(shù)和污 染率的比較，結(jié)果如表2所示，增殖倍數(shù)和污染率二個指標(biāo)都沒有顯著差異。
[0021] 表2本發(fā)明的化學(xué)消毒組培方法對鐵皮石斛增殖倍數(shù)和污染率的影響
[0022]
[0023] 3.壯苗培養(yǎng)：壯苗培養(yǎng)的試驗結(jié)果如表3所示，本發(fā)明的鐵皮石斛化學(xué)消毒組培 方法的每瓶平均壯苗數(shù)明顯高于常規(guī)的鐵皮石斛組培方法，瓶苗也更壯、更綠。在污染率方 面沒有差異。
[0024] 表3本發(fā)明的化學(xué)消毒組培方法對鐵皮石斛壯苗數(shù)和污染率的影響
[0025]
[0026] *苗高大于5cm的瓶苗為壯苗。
[0027] 4本發(fā)明的化學(xué)消毒組培方法對鐵皮石斛生根率和污染率的影響：在生根過程 中，本發(fā)明的化學(xué)消毒組培方法與常規(guī)的鐵皮石斛組培方法相比，結(jié)果如表4所示，生根率 和污染率都沒有差異；從瓶苗的生長狀況看，用本發(fā)明的方法，鐵皮石斛組培苗莖更粗，葉 片更大。
[0028] 表4本發(fā)明的化學(xué)消毒組培方法的鐵皮石斛瓶苗生根情況
[0029]
[0030] 5.成本分析：本發(fā)明的化學(xué)消毒組培方法與常規(guī)組培的成本分析見表5。
[0031] 本發(fā)明組培省去了高壓滅菌環(huán)節(jié)，簡化了組培程序，提高了工作效率。從可以直 接計算出來的費(fèi)用來算，每年可以節(jié)約5萬元左右（以每天配制50L培養(yǎng)基計算）。另外， 還有一些不容易計算的項目，如高壓鍋維修，安全，節(jié)約空間等：
[0032] 表5本發(fā)明的鐵皮石斛簡便組培方法培養(yǎng)與常規(guī)組培的成本分析表
[0033]
[0034] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0035] 1.本發(fā)明的鐵皮石斛化學(xué)消毒組培方法中，培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基都無需高溫高壓滅 菌，減少了工作量和能源消耗，簡化了鐵皮石斛組培環(huán)節(jié)，降低了鐵皮石斛組培成本。
[0036] 2.本發(fā)明的鐵皮石斛化學(xué)消毒組培方法，操作簡單，只要按不同的培養(yǎng)基配方配 制后即可，實用性強(qiáng)，推廣性好。
[0037] 3.本發(fā)明的鐵皮石斛化學(xué)消毒組培方法與常規(guī)的鐵皮石斛組培方法對比，可以降 低成本1