抗壞血酸在提高鋁脅迫下植物硝態(tài)氮吸收中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于促進植物硝態(tài)氮吸收的植物生長調(diào)節(jié)劑領域，具體涉及抗壞血酸(ASA)促進鋁脅迫下植物吸收硝態(tài)氮的新用途。
技術背景
[0002]銷是地殼中含量最豐富的金屬元素，其含量僅次于氧和娃，占總量的7.1%。在自然環(huán)境下，難溶性的硅酸鹽或氧化鋁是鋁的主要存在形式，這種形式的鋁對植物的生長發(fā)育和各種經(jīng)濟作物的產(chǎn)量都沒有直接毒害作用。當土壤pH低于4.5時，土壤中的鋁以Al3+離子態(tài)的形式釋放出來，對作物造成危害。鋁毒首先對作物根系產(chǎn)生毒害作用，影響植物對養(yǎng)分和水分吸收，干擾各種生理生化過程，同時使植物葉綠素含量下降，光合速率降低，直接影響植物干物質(zhì)累積和產(chǎn)量形成。鋁毒是酸性土壤影響植物生長的主要限制因子。全世界有大面積的酸性土壤，約占40%的世界耕地面積，主要分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，大多數(shù)分布在發(fā)展中國家。在我國，酸性土壤主要分布在南方的大部分地區(qū)，約占耕地面積的21%。為了增加作物產(chǎn)量，人們對土壤進行集約管理，通過施用大量化肥來提高單位面積產(chǎn)量，使作物總產(chǎn)量增加，滿足人口增加對糧食的需求。然而，大量的化學肥料施用使土壤pH下降，土壤酸化使土壤釋放出大量的對植物具有毒性的三價鋁離子，造成了很大的環(huán)境問題。
[0003]H2O2是活性氧(Active Oxygen Species, AOS)的一種，是細胞有氧代謝的產(chǎn)物。植物細胞能夠通過非常多的代謝途徑來產(chǎn)生H2O2，特別是在逆境脅迫下(干旱脅迫、鹽脅迫、重金屬脅迫等)會通過一些列的代謝活動產(chǎn)生大量的活性氧，如果這些扮演活性氧角色的H2O2不能夠被及時清除，在細胞中累積過多，就會破壞生物大分子。植物體為了減少或者防止H2O2對自身所產(chǎn)生的毒害，體內(nèi)形成了極其復雜的氧化應激機制。
[0004]硝態(tài)氮和銨態(tài)氮是植物吸收利用的兩種主要礦質(zhì)形態(tài)氮。旱地土壤硝態(tài)氮對于作物的前期供氮有著重要的作用，與植物氮素吸收量的相關性達到極顯著水平，而銨態(tài)氮與植物氮素吸收量相關性很低。大量研宄表明，鋁對植物氮素吸收具有抑制作用，鋁干擾對N03_的吸收作用較NH4+嚴重。植物對NO 3_的吸收是個主動運輸過程，一般認為細胞膜上存在N03_的專性載體，這種載體借助于質(zhì)膜H+-ATPase建立的質(zhì)子泵驅(qū)動力，在質(zhì)膜H+-ATPase的作用下，ATP供能將H+泵出胞外(H+分泌和釋放)，在H+形成的電勢梯度下，伴隨H+的同向運輸NO 3'通過通道蛋白逆濃度梯度進入細胞內(nèi)。吸收進入植物細胞內(nèi)的Nor一部分被同化為氨基酸、蛋白質(zhì)，或以氨基酸的形式運往地上部，另一部分N03_則被貯存在液泡中。因此，找到一種高效、低廉而又易于使用的提高植物在酸性土壤上吸收硝態(tài)氮的促進劑來解決鋁脅迫抑制硝態(tài)氮吸收的問題具有重大的現(xiàn)實和應用意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種提高植物在鋁脅迫下吸收硝態(tài)氮的增強劑，即抗壞血酸ASA在鋁脅迫下提高植物對硝態(tài)氮吸收中的應用。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明的技術方案如下:
(1)選擇云南本地的鋁敏感大豆SB(下稱SB)、耐鋁型大豆RB (下稱RB)的飽滿種子進行24小時過夜消毒，25°C黑暗下催芽萌發(fā)，待根長出2cm左右轉(zhuǎn)入0.5mmol/L CaCl2溶液中平衡一天，再轉(zhuǎn)移至1/4的Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)一周，長出二葉后轉(zhuǎn)移至Hoagland完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；
(2)待SB、RB苗長到四對葉片時選擇長勢一致的健壯植株，分別在Hoagland培養(yǎng)液加不同鋁濃度梯度(O、50、100、200、400 μ mo I.L—1) AlCl3梯度濃度脅迫處理24h后，取樣進行硝態(tài)氮吸收和體內(nèi)H2O2含量的測定；
(3)用濃度為2mmol/L的ASA和100μ mo I.L—1的AlCl 3濃度處理鋁敏感型(SB)和抗鋁型(RB)大豆幼苗，24h后取樣進行硝態(tài)氮吸收以及各項生理生活指標測定。
[0007]本發(fā)明提供的抗壞血酸ASA作為植物在鋁脅迫下對硝態(tài)氮吸收的調(diào)節(jié)劑，使用方便，成本較低。該調(diào)節(jié)劑顯著提高了植物對硝態(tài)氮的吸收能力，開辟了用調(diào)節(jié)劑提高植物對營養(yǎng)元素吸收的新途徑，有助于研宄水體富營養(yǎng)化治理的科學工作者提供解決的新思路，同時也為設施農(nóng)業(yè)栽培，尤其是有利于土壤酸化引起阻礙植物硝態(tài)吸收問題解決提供科學依據(jù)。此方法無論是在農(nóng)業(yè)還是環(huán)境治理領域都顯得切實可行。
[0008]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所述的鋁脅迫下ASA作為植物吸收硝態(tài)氮的增強劑，具有投入低、操作簡單、效率高的特點。常溫下，ASA是比較理想的植物吸收硝態(tài)氮的增強劑，ASA處理可以減少在不同鋁濃度脅迫下大豆葉片細胞內(nèi)H2O2積累，增強植物根系對硝態(tài)氮的吸收，提高細胞膜上H+-泵活性，以及提高質(zhì)膜H+-ATPase磷酸化水平、14-3-3蛋白表達水平等，在不同鋁脅迫的大豆，通過ASA處理，不僅能夠減緩了植株受到的鋁脅迫作用，同時葉增加了氮吸收相關酶的活性，提高了大豆對硝態(tài)氮的吸收和利用，從而提高大豆的生長，對提高大豆的經(jīng)濟效益具有重要意義。
【附圖說明】
[0009]圖1是本發(fā)明中不同濃度ASA處理SB、RB幼苗24h的H2O2含量(A圖)和葉片凈光合作用速率(B圖)的變化；
圖2本發(fā)明中不同鋁濃度脅迫處理下I天，SB、RB幼苗對硝態(tài)氮吸收情況；
圖3是本發(fā)明中100 mM鋁脅迫I天，添加ASA或不添加ASA大豆SB (A圖)、RB (B圖)幼苗根和葉片中H2O2的測定結(jié)果，其中CK為不添加ASA和AlCl 3溶液；
圖4是本發(fā)明中不同濃度鋁脅迫處理I天，添加ASA或不添加ASA大豆SB幼苗對硝態(tài)氮吸收情況，其中CK為不添加ASA ；
圖5是本發(fā)明中100 mM鋁脅迫I天，添加ASA或不添加ASA大豆SB幼苗葉片中的H+ATPase活性(A圖)、氫泵活性(B圖)測定結(jié)果，其中CK為不添加ASA ；
圖6是本發(fā)明中100 mM鋁脅迫I天，添加ASA或不添加ASA大豆SB幼苗根中的H+ATPase活性(A圖)、氫泵活性(B圖)測定結(jié)果，其中CK為不添加ASA ；
圖7是本發(fā)明中100 mM鋁脅迫I天，添加ASA或不添加ASA (CK)大豆SB幼苗根和葉片中的質(zhì)膜ATP酶磷酸化水平(A圖)、14-3-3蛋白表達水平(B圖)檢測結(jié)果，其中CK為不添加ASA。
【具體實施方式】
[0010]下面通過實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi)容。實施例中方法如無特殊說明，按常規(guī)操作進行，如無特殊說明使用試劑均為常規(guī)購試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。
[0011]實施例1:SB、RB植株的栽培和處理，步驟如下:
1、實驗材料為SB、RB幼苗
SB、RB種子消毒催芽后，25°C黑暗下催芽萌發(fā)，待根長出2cm轉(zhuǎn)入0.5mmol/L CaCl2S液中平衡一天，再轉(zhuǎn)移至1/4的Hoagland培養(yǎng)液一周，長出二葉后轉(zhuǎn)移至Hoagland完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，待幼苗長至四對葉時用于本實驗；
2、配置不同濃度(0、0.5、1、2、5、10 mmoI/L)的ASA處理液，配置不同濃度(50、100、200,400 μ mo I.Γ1)的 AlCl3 處理液；
3、分別用濃度0、0.5、1、2、5、10 mmol/L的ASA處理液處理SB、RB幼苗24小時，取樣進行H2O2含量、凈光合作用速率的測定；
4、分別用不同濃度(50、100、200、400μπιο1.L-1MlCl3鋁溶液處理RB和SB幼苗，以AlCl3濃度為O的Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)為空白對照，處理24小時后取樣進行硝態(tài)氮吸收和H2O2含量的測定，每個處理設置三個重復；實驗期間，Hoagland培養(yǎng)液ρΗ4.5，晝夜氣溫變化在13-22°C，光照和黑暗處理時間設定為12h/12h ；
5、用濃度為2mmol/L 的 ASA 處理濃度梯度為(0,50,100,200,400 μ mo I.L-1) AlCl3鋁溶液下的鋁敏感型(SB)和抗鋁型(RB)大豆幼苗，以AlCl3濃度和ASA濃度均為O的Hoagland’ s培養(yǎng)液培養(yǎng)的SB幼苗為空白對照，處理24小時；取樣進行硝態(tài)氮吸收和H2O2含量測定；
6、用濃度為2mmol/L的ASA處理10ymol噸_11(:13濃度脅迫下的鋁敏感型(SB)大豆幼苗，以AlCl3濃度和ASA濃度均為O的Hoagland’s培養(yǎng)液培養(yǎng)的SB幼苗為空白對照，處理24小時，取樣進行相關酶活和蛋白表達水平檢測。
[0012]實施例2:采用實施例1中第3步處理后的SB、RB葉片進行H 202含量及光合作用速率測定
UH2O2含量測定:采用二甲酚橙法。稱取新鮮植物葉片，按照材料與提取劑1:1的比例加入預冷丙酮和少許石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入離心管于12000g、4°C下離心20min，棄去殘澄，上清即為樣品提取液。分別用ddH20配制試劑A (內(nèi)含3.3 mmol/L FeSO4, 3.3 mmol/L (NH4 )2S04，412.5 mmol/L H2SO4)和試劑 B (內(nèi)含 165 μ mol/L 二甲酚橙，165 mmol/L 山梨醇)，使用前試劑A和試劑B按照1:10的比例混合構(gòu)成工作試劑。此工作試劑與H2O2待測液按照2:1的比例混合，30°C水浴顯色30min，于560nm處測定OD值，計算H2O2含量(圖1A)0
[0013]2、葉片凈光合作用速率測定:選取實施例1第3步中處理了 I小時的植物，從下往上數(shù)第三、四葉片測定其凈光合速率。葉片凈光合作用速率采用北京理儀科技有限公司Yaxin-1lOl植物光合儀進行測定，光合作用的測定在9: 00?10: 00進行。
[0014]從圖1A可以看出，用不同濃度的ASA處理24小時后，SB、RB大豆葉片的H2O2含量和未用ASA處理的植株相比均有不同程度的減少；2 mmol/L ASA處理組H2O2含量減少最多，ASA濃度再升高，H2O2含量不再有明顯變化。
[0015]從圖1B看，不同濃度ASA處理SB、RB大豆葉片凈光合速率有不同程度的恢復，但2 mmol/L ASA濃度處理時葉片凈光合作用