一種以金錢松葉片為外植體的金錢松植株再生方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種金錢松植株的再生方法，特別是涉及一種以金錢松葉片為外植體的金錢松植株再生方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金錢松是我國特有的古老孑遺松科樹種。根據(jù)世界保護聯(lián)盟(IUCN)新制定的物種受威脅的分類系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)和中國植物紅皮書的標(biāo)準(zhǔn)，金錢松被定為漸危種，并被列為國家二級保護植物。
[0003]金錢松既是重要的園林植物，同時更是一種重要的、應(yīng)用前景廣闊的藥用植物。研宄發(fā)現(xiàn)，金錢松最主要的藥用成分是從其樹皮和根皮中提取出來的二萜類化合物土槿酸，它具有抗腫瘤、抗真菌、抗早孕和使膽囊自截等功效，尤其是抗腫瘤的功效使得金錢松的藥用價值更加凸顯?，F(xiàn)代藥理研宄發(fā)現(xiàn)，土槿酸及其衍生物能作用于多種癌細胞如胃癌細胞、宮頸癌細胞、肺癌細胞、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞等，并具有明顯的量效關(guān)系。
[0004]目前金錢松人工種植主要采用有性繁殖和無性繁殖兩種方式。有性繁殖即種子繁殖，由于金錢松存在結(jié)實率低、結(jié)實間隔期較長(一般3?5年結(jié)實)、采種條件苛刻(采種母樹年齡以100年左右為最好)、種子成活率低(僅為60% -70% )、以及種子需低溫保存等因素的限制，因此目前通過有性繁殖大量種植金錢松植物還存在一定的困難。無性繁殖即扦插繁殖，金錢松為菌根性樹種，宜在海拔500m左右的山地建立永久性育苗基地或在土內(nèi)有菌的林間育苗，植物生長周期長，并易受金錢松小卷蛾的嚴(yán)重危害，這些因素限制了金錢松的大量無性繁殖。由于人工種植金錢松植物存在上述問題，因此目前迫切需要利用組織培養(yǎng)技術(shù)來大規(guī)模生產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)良的金錢松植物及其培養(yǎng)物，以滿足人們對金錢松植物和相關(guān)產(chǎn)物的需要。
[0005]目前關(guān)于對金錢松植物的研宄，主要集中在對金錢松有效成分的提取及其內(nèi)生真菌的篩選方面，而在植物生物技術(shù)的研宄報道方面，有王躍華等人發(fā)明的“一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養(yǎng)方法”(專利號:ZL 201210104866.8)和“一種金錢松細胞的懸浮培養(yǎng)方法”(專利號:ZL 201210472291.5)的研宄報道；然而上述兩個專利是采用金錢松植物的芽和葉原基為外植體，通過固體和液體兩種培養(yǎng)方式，完成了對其愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)，目前還沒有涉及到以金錢松葉片為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)獲得愈傷組織后，再進一步完成不定芽的分化和無根苗的生根培養(yǎng)，最后成功培育出金錢松植物的組培苗的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種以金錢松葉片為外植體的金錢松植株再生方法，該方法通過誘導(dǎo)金錢松葉片產(chǎn)生愈傷組織、以及芽分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和煉苗與移栽等步驟，可獲得生長速度快、不帶任何病蟲害且具有優(yōu)良性狀的金錢松組培苗。
[0007]本發(fā)明提供的以金錢松葉片為外植體的金錢松植株再生方法包括如下步驟:
[0008](I)外植體的選取和消毒:選取生長健康、無病蟲害的金錢松葉片，先用濃度為75%的酒精消毒10?30s，用無菌水沖洗后，再用濃度為0.1 %的升未消毒3?6min，最后用無菌水沖洗后用已滅菌的濾紙吸干表面的水分；
[0009](2)外植體的處理:將消毒后的葉片放在濾紙上，用刀切傷金錢松葉片，傷口以不切斷葉片為準(zhǔn)；
[0010](3)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng):將處理后的金錢松葉片接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基⑶+ΝΑΑ0.5?1.5mg/L+GA30.5?1.5mg/L中進行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0011](4)芽分化培養(yǎng):選取質(zhì)地較緊密、生長狀況良好的愈傷組織，接入芽分化培養(yǎng)基MS+TDZ0.1?0.3mg/L+Ad 10?30mg/L中進行不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0012](5)生根培養(yǎng):當(dāng)不定芽長至1.0?2.5cm時，將其切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基1/3MS+IAA0.5?1.5mg/L+活性炭20?40mg/L中進行生根培養(yǎng)；
[0013](6)煉苗和移栽:當(dāng)組培苗不定根生長健壯時，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗2?4天后，將其從培養(yǎng)瓶中取出，洗去不定根上的培養(yǎng)基，將其移栽至松軟的土壤中生長；
[0014]上述所有培養(yǎng)基的pH值5.5?6.7、蔗糖15?50g.L-1、瓊脂4.0?6.0g.L-1;所有培養(yǎng)條件為:每天光照12?24小時、光照強度為2000?30001x、培養(yǎng)溫度20?30°C。
[0015]進一步地，步驟(I)中所述金錢松葉片為剛伸展I?7天的金錢松幼嫩葉片。
[0016]進一步地，步驟⑴中用濃度為0.1 %的升未消毒時，每10ml的0.1 %升未溶液中還滴加了 5?1ml吐溫20。
[0017]進一步地，步驟(6)中移栽后的培養(yǎng)條件為適當(dāng)遮光，溫度保持在20?28°C，相對濕度保持在75?85%。
[0018]本發(fā)明利用組織培養(yǎng)技術(shù)，以金錢松葉片為外植體，建立了金錢松再生植株的快速繁殖技術(shù)，為金錢松植株的大規(guī)?？焖俜敝程峁┝艘粭l新途徑，有效地解決了當(dāng)前金錢松植物資源和種苗資源短缺的問題。另外實施本發(fā)明方法，只需有簡單的植物組織培養(yǎng)設(shè)備即可進行，因此實用性強，可行性高，且不受季節(jié)限制。
[0019]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
[0021](I)外植體的選取和消毒:在晴天選取生長健康、無病蟲害和幼葉剛伸展了 I天的金錢松葉片，將其放在超凈工作臺上，先用濃度為75%的酒精消毒10s，用無菌水沖洗3次后，再用濃度為0.1%的升未(每10mL的0.1 %升未溶液中滴加了 5mL吐溫20)消毒3min，最后用無菌水沖洗2次后用已滅菌的濾紙吸干表面的水分；
[0022](2)外植體的處理:將消毒后的葉片放在濾紙上，用刀切傷金錢松葉片，傷口以不切斷葉片為準(zhǔn)；
[0023](3)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng):將處理后的金錢松葉片接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基⑶+NAA0.5mg/L+GA30.5mg/L中進行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，葉片在接入培養(yǎng)基中第7天，在其傷口處開始有愈傷組織產(chǎn)生，在培養(yǎng)30天后統(tǒng)計其愈傷組織誘導(dǎo)率為39% ；
[0024](4)芽分化培養(yǎng):選取質(zhì)地較緊密、生長狀況良好的愈傷組織，接入芽分化培養(yǎng)基MS+TDZ0.lmg/L+Ad I Omg/L中進行不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，在培養(yǎng)35天后統(tǒng)計其不定芽誘導(dǎo)率為 19.38% ；
[0025](5)生根培養(yǎng):當(dāng)不定芽長至1.0cm時，將其切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基1/3MS+IAA0.5mg/L+活性炭20mg/L中進行生根培養(yǎng)，在培養(yǎng)35天后統(tǒng)計其生根率為38.60% ；
[0026](6)煉苗和移栽:當(dāng)組培苗不定根生長健壯時，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗2天后，將其從培養(yǎng)瓶中取出，洗去不定根上的培養(yǎng)基，將其移栽至松軟的土壤中生長，適當(dāng)遮光，溫度保持在20°C，相對濕度在75%，組培苗快速生長，成活率在93%以上；
[0027]上述所有培養(yǎng)基的pH值5.5、蔗糖15g.L_\瓊脂4.0g.L—1;上述培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為:每天光照12小時、光照強度為20001x、培養(yǎng)溫度20°C。
[0028]實施例2
[0029](I)外植體的選取和消毒:在晴天選取生長健康、無病蟲害和幼葉剛伸展了 2天的的金錢松葉片，將其放在超凈工作臺上，先用濃度為75%的酒精消毒15s，用無菌水沖洗3次后，再用濃度為0.1 %的升未(每10mL的0.1 %升未溶液中滴加了 7mL吐溫20)消毒4min，最后用無菌水沖洗4次后用已滅菌的濾紙吸干表面的水分；
[0030](2)外植體的處理:將消毒后的葉片放在濾紙上，用刀切傷金錢松葉片，傷口以不切斷葉片為準(zhǔn)；
[0031](3)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng):將處理后的金錢松葉片水平接在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基⑶+NAA1.0mg/L+GA3l.0mg/L表面進行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，葉片在接入培養(yǎng)基中第7天，在其傷口處開始有愈傷組織產(chǎn)生，在培養(yǎng)30天后統(tǒng)計其愈傷