大規(guī)模生產(chǎn)包含共生體的人工種子的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于選擇和培育生物，特別是在植物中表現(xiàn)出與共生生物（如內(nèi)生真 菌或附生植物或細菌微生物組（microbiome))具有共生行為的生物的新方法，以及由此產(chǎn) 生的新的生物和共生體。
【背景技術】
[0002] 多種家畜、作物和牧草的表型取決于該個體的基因型和共生生物的基因型之間的 相互作用。通常發(fā)現(xiàn)重要的植物（包括飼草、豆科植物、樹木、灌木和藤本植物）與內(nèi)生菌 (包括真菌、細菌、病毒和微生物）存在關聯(lián)。類似地，重要的動物（包括牛、綿羊、豬、山羊 等）在其腸道和瘤胃中存在這樣的內(nèi)生菌。
[0003] 這類聯(lián)合體（association)同時引起有益和有害的園藝學、農(nóng)藝學和獸醫(yī)特性， 包括對水脅迫和營養(yǎng)脅迫的改善的耐受性以及對蟲害的抗性。
[0004] 例如，如果正確基因型的內(nèi)生真菌寄居在黑麥草植物中，則該植物可表現(xiàn)出改善 的干旱耐受性和持久性。類似地，在禾本科植物中，由內(nèi)生菌產(chǎn)生的特定代謝物（特別是黑 麥草堿和波胺（peramine))可提供抗蟲性。由內(nèi)生真菌產(chǎn)生的其他代謝物，例如黑麥草震 顫素（Iolitrem)和麥角生物堿類，可對食草動物有毒并可降低食草動物攝食。
[0005] 已知在共生生物如內(nèi)生菌的代謝物譜中存在大量變化。例如，已將缺少所述動物 毒素之一或兩者的內(nèi)生真菌菌株引入到商業(yè)黑麥草品種中。
[0006] 在動物中，存在于腸道中的微生物負責消化動物飼料。瘤胃微生物-牛共生體可 在例如改善飼料轉(zhuǎn)化效率和降低甲烷生產(chǎn)上是重要的。在反芻動物中，對劣質(zhì)飼料的成功 消化可依賴于具有特定瘤胃微生物組譜。
[0007] 已經(jīng)將分子遺傳標記物（如簡單序列重復（SSR)標記物）開發(fā)為區(qū)分共生生物分 類群和檢測分類群內(nèi)遺傳變異的診斷測試?？蓪⑺鰳擞浳镉糜趨^(qū)分具有不同毒素譜的共 生生物菌株。
[0008] 但是，仍然需要鑒定、分離和/或表征表現(xiàn)出與共生生物（如內(nèi)生菌）具有共生行 為的生物的方法。人工培育這些共生體中的困難限制其實用性。例如，許多已知對牧草農(nóng) 業(yè)有利的新型內(nèi)生菌表現(xiàn)出低接種頻率并且在優(yōu)良種質(zhì)中的穩(wěn)定性較差。
[0009] 另外，在傳統(tǒng)育種技術中，例如在飼草（如多年生黑麥草和高羊茅）中，使用傳統(tǒng) 雜交育種技術培育禾本科植物品種，并且在多年時間內(nèi)監(jiān)測它們的性能之后，選擇禾本科 植物基因型的優(yōu)越特性。然后用單一內(nèi)生菌接種構成所述實驗品種的所選擇的禾本科植物 基因型，并且評估所產(chǎn)生的禾本科植物-內(nèi)生菌聯(lián)合體（association)的任何有利特性例 如抗蟲性。隨后評估每一個在其中采用單一內(nèi)生菌的實驗性合成品種的農(nóng)藝學性能以及通 過在數(shù)年時間內(nèi)牧養(yǎng)動物評估所產(chǎn)生的動物性能。該評估方法可揭示：在不同的實驗性合 成品種中使用的單一內(nèi)生菌可能在一些所述品種中不具有營養(yǎng)穩(wěn)定性和/或代間穩(wěn)定性， 或者由所述單一內(nèi)生菌賦予的所需生物堿譜可在不同的合成品種中變化，無法賦予適當水 平的抗蟲性或引起動物中毒。如果該耗時的方法可被加速或改進，這會是本領域中的一個 重大的發(fā)展。
[0010] 因此，本發(fā)明的目的是克服、或至少緩解與現(xiàn)有技術相關的一種或多種困難或缺 陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 于2012年6月1日和2012年9月7日提交的、題為"NovelOrganisms"的美國 專利申請一一其全部公開內(nèi)容以引用的方式納入本文一一描述了在多種生物中使用多種 共生生物的方法以及在培育過程早期選擇改善的共生相容性和性能的方法。即，從頭開始 培育共生生物-生物基因型組合并篩選包括改善的共生體相容性和性能的所需特性。為促 進這一點，申請人已開發(fā)了用于通過人工種子生產(chǎn)和接種方法大規(guī)模建立共生體的方法。
[0012] 因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了用于制備人工種子的方法，所述方法包括：
[0013] 提供植物種子來源；
[0014] 將所述種子進行表面消毒；
[0015] 從所得表面消毒的種子中分離種子胚；和
[0016] 用包衣包被所述胚以形成人工種子。
[0017] 所述種子可來自任何合適的植物。所述植物可以是禾本科植物，優(yōu)選多年生禾本 科植物、豆科植物、藤本植物、灌木、喬木、草本植物、花、灌木或灌木叢。依據(jù)本發(fā)明這一方 面的方法特別適用于禾本科植物和豆科植物。
[0018] 可用任何合適的技術將所述種子進行表面消毒。優(yōu)選地，通過使用酸（如鹽酸）和 漂白劑（如次氯酸鈉）處理所述種子對其進行消毒。優(yōu)選地，依次進行所述酸處理和漂白 劑處理。所述酸處理可持續(xù)1小時至24小時的時間，優(yōu)選過夜。所述漂白劑處理可持續(xù)5 分鐘至1小時的時間，優(yōu)選約20分鐘。可連續(xù)幾日進行兩次所述漂白劑處理，同時例如使 用無菌蒸餾水洗滌經(jīng)處理的種子，并將其保存在約4至30°C，優(yōu)選約24°C。
[0019] 可通過本領域技術人員已知的技術從處理過的種子中分離胚。
[0020] 在一個優(yōu)選的實施方案中，可處理所述胚以形成一個或多個共生生物（例如，內(nèi) 生菌）的進入點。例如，可穿刺所述胚或破壞其表面，例如通過擦傷或蝕刻，從而促進共生 生物的進入。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，可以使用皮下注射針頭或類似物在所述胚表 面產(chǎn)生單個或多個穿孔。
[0021] 所述包衣可以是用于包裹所述胚的任何合適的類型，包括藻酸鹽、瓊脂、polyco 2133、羧甲基纖維素、角叉菜膠、結(jié)冷膠（gelrite)、瓜爾膠、果膠酸鈉、黃蓍膠等。在一個優(yōu) 選的實施方案中，所述包衣是藻酸鹽，更特別是藻酸鈣。
[0022] 在一個優(yōu)選的實施方案中，可將所述胚與所述包衣混合并且將含單個胚的包衣液 滴置于聚合溶液如氯化鈣溶液中，優(yōu)選同時進行攪拌，以形成人工種子?？稍诩s1至60分 鐘攪拌后收集人工種子，優(yōu)選在約15分鐘攪拌后。
[0023] 在一個優(yōu)選的實施方案中，可在包衣前用共生生物如內(nèi)生真菌接種所述胚。在一 種優(yōu)選的形式中，可用內(nèi)生菌菌絲體直接接種所述胚。
[0024] 或者，在一個特別優(yōu)選的實施方案中，可將分離的胚用含共生生物的包衣層（如 含內(nèi)生真菌的包衣層）包被。
[0025] 在該實施方案中，所述接種步驟可包括：
[0026] 提供種子胚來源；
[0027] 用一種或多種共生生物如內(nèi)生真菌接種所述胚；和
[0028] 用包衣包被所述經(jīng)接種的胚以形成人工種子。
[0029] 或者，所述接種步驟可包括：
[0030] 提供種子胚來源；和
[0031 ] 用含共生生物如內(nèi)生真菌的包衣包被所述胚以形成人工種子。
[0032] 在一個優(yōu)選的實施方案中，可用第二包衣層雙層包被所述種子。優(yōu)選地，所述第二 包衣層為藻酸鹽，更優(yōu)選為藻酸鈣，甚至更優(yōu)選為有色藻酸鈣。在一個優(yōu)選的實施方案中， 可將所述具有第一包衣層的人工種子在用第二層包被之前進行風干。
[0033] 在一個優(yōu)選的實施方案中，本方法還包括用第二包衣層包被所述人工種子，所述 第二包衣層優(yōu)選包含添加的適于維持所述胚和/或共生生物的營養(yǎng)物。
[0034] 或者，所述第二包衣層可不含添加的營養(yǎng)物，該不含營養(yǎng)物的層被設計用于，例 如，降低內(nèi)生菌在萌發(fā)過程中的向外生長（out-growth)并將內(nèi)生菌的生長限制在該胚周 圍。
[0035] 在本發(fā)明的另一方面，提供了選自以下的人工種子：
[0036] (a)植物胚，其接種了一種或多種共生生物的植物胚并被包衣包被以包裹所述胚； 和
[0037] (b)植物胚，其被含共生生物的包衣層包被。
[0038] 優(yōu)選地，所述人工種子用第二包衣層進行雙層包被。如本文所述，第二包衣層可包 括添加的營養(yǎng)物或可是不含營養(yǎng)物的層。
[0039] 優(yōu)選地，所述胚來自選自禾本科植物和豆科植物的植株。優(yōu)選地，通過上文所述的 技術分離所述胚。優(yōu)選地，將所述胚進行處理以形成共生生物的一個或多個進入點。
[0040] 在一個特別優(yōu)選的實施方案中，共生生物可為內(nèi)生真菌。
[0041] 在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，可通過上文所述的方法產(chǎn)生所述人工種子。
[0042] 在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法還可包括：
[0043] 培養(yǎng)所述人工種子以形成小植株或幼苗；和
[0044] 從所述小植株或幼苗中篩選共生生物的存在，如內(nèi)生真菌的存在。
[0045] 可使用任何合適的生長培養(yǎng)基進行培養(yǎng)所述人工種子的步驟。特別優(yōu)選萌發(fā)培養(yǎng) 基如MS(MurashigeandSkoog)、改良MS或MS+BAP(6-芐基氨基嗓呤）。
[0046] 例如，可篩選所述幼苗的共生生物-特異性的，例如內(nèi)生真菌-特異性的簡單序列 重復（SSR)。
[0047] 已進行了大規(guī)模的內(nèi)生菌發(fā)現(xiàn)項目以建立內(nèi)生真菌菌株的"文庫"。已經(jīng)建立了多 年生黑麥草和高羊茅的種質(zhì)（accession)的庫（collection)。
[0048] 可利用于2012年6月1日提交的、題為"NovelEndophytes"的澳大利亞專利申 請中描述的技術選擇所選擇的用于接種所述胚的內(nèi)生菌，所述申請的全部公開內(nèi)容以引用 的方式納入本文。特別優(yōu)選其中所述的新型內(nèi)生菌。
[0049] 對這些種質(zhì)中的內(nèi)生菌的遺傳分析已導致鑒定出大量新型內(nèi)生菌菌株。這些新型 內(nèi)生菌菌株在基因上不同于已知內(nèi)生菌菌株。可以進行代謝譜分析以確定這些菌株的毒素 譜。
[0050] 用SSR標記物對植物中的內(nèi)生菌的特異性檢測可被用于確認人工接種至例如植 物、植物株系、植物品種和植物栽培種中的內(nèi)生菌菌株的存在和種類。
[0051] 可通過遺傳分析和/或代謝譜分析篩選所述經(jīng)接種的種質(zhì)（germplasm)。例如，可 使用題為"NovelEndophytes"的澳大利亞臨時專利申請中描述的遺傳分析技術。
[0052] 可選地，或另外地，可對所述經(jīng)接種的種質(zhì)進行遺傳分析（遺傳表征）以證明與已 知的共生生物-基因型的共生體的基因區(qū)別，并確認共生生物（例如，人工接種至例如植 物、植物株系、植物品種和植物栽培種中的內(nèi)生真菌、菌株）的種類。
[0053] "遺傳分析"意指分析所述共生生物如內(nèi)生真菌的細胞核DNA和/或線粒體DNA。
[0054] 該分析可包括檢測多態(tài)性標記物如簡單序列重復（SSR)或接合型標記物的存在 或缺失。SSR，也稱為微衛(wèi)星，是基于串聯(lián)重復的1-7個核苷酸核心元件，更常見地1-4個核 苷酸核心元件。所述SSR陣列嵌入在復雜的側(cè)翼DNA序列中。微衛(wèi)星的出現(xiàn)被認為是由于 復制滑動的性質(zhì)造成的，在復制滑動中DNA聚合酶中止并沿其模板短暫滑動，從而使得短 的相鄰序列產(chǎn)生重復。一些序列基序比其他序列基序更易于滑動，產(chǎn)生了基于不同基序類 型的SSR位點的相對數(shù)量的變化。由于進一步滑動和/或不平等姐妹染色單體交換，一旦 被復制，所述SSR陣列可進一步擴張（或收縮）。SSR位點的總數(shù)很高，以至于原則上這些 位點能夠為任何聯(lián)鎖基因提供標簽。
[0055] 由于重復數(shù)目的變化，SSR是高度多態(tài)性的并且是共顯性遺傳的。其檢測是基于 聚合酶鏈式反應（PCR)，僅需要少量DNA并適合自動化。它們普遍存在于真核生物基因組 (包括真菌和植物基因組）中，并且已被發(fā)現(xiàn)在植物基因組中每21至65kb出現(xiàn)一次。因 此，SSR是廣泛應用如遺傳多樣性分析、基因型鑒定、基因組定位、性狀定位和標記物輔助選 擇的理想的標記物。
[0056] ZijlldeJongetal(2003)Genome46 (2) : 277-290 記載了 已知的可被用于研宄 多年生黑麥草中內(nèi)生菌多樣性的SSR標記。
[0057] 可選地，或另外地，所述遺傳分析可包括測序基因組DNA和/或線粒體DNA以及進 行序列比較以評估共生生物如內(nèi)生