一種生產(chǎn)西洋參皂甙的懸浮培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種天然產(chǎn)物領(lǐng)域，尤其涉及的是一種生產(chǎn)西洋參皂甙的懸浮培 養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 西洋參（Panax quinquefolium)系五加科人參屬多年生草本植物。西洋參是生長(zhǎng) 于北美原始森林中的古老植物，具有"活化石"之稱，是一種名貴的中藥，藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值頗 高。我國(guó)自20世紀(jì)80年代成功大面積引種西洋參以來(lái)，已發(fā)展成為繼美國(guó)、加拿大后世界 第三大西洋參生產(chǎn)國(guó)和世界第一大消費(fèi)國(guó)。西洋參味苦，性涼，入心、肺、腎經(jīng)，以補(bǔ)益為主， 可滋陰降火、益氣生津。服用方法分為煮、燉、蒸食、切片含化、研成細(xì)粉沖服等。西洋參中 含有皂甙、多糖、黃酮類、揮發(fā)油、微量元素等豐富的生物活性物質(zhì)，對(duì)人體，在免疫調(diào)節(jié)、抗 癌、抗衰老等方面具有獨(dú)特效果，因此常用于保健品開(kāi)發(fā)利用。
[0003] 無(wú)論野生或人工栽培西洋參，因自身生理特性，生長(zhǎng)緩慢，大多需4至6年才能收 獲入藥。并且，西洋參種子培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，資源稀少，價(jià)格昂貴。因此，開(kāi)展西洋參細(xì)胞培養(yǎng)技 術(shù)研宄，利用西洋參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法生產(chǎn)人參皂甙，即，工廠化生產(chǎn)皂甙，具有十分重 要的現(xiàn)實(shí)意義和商業(yè)價(jià)值。
[0004] 西洋參細(xì)胞培養(yǎng)是指在無(wú)菌條件下，將離體的西洋參器官（如，根尖、莖尖、葉、 花、未成熟的果實(shí)、種子等）、組織、細(xì)胞、胚胎、原生質(zhì)體，等材料，在人工調(diào)控的培養(yǎng)基上， 給予適宜的條件，誘導(dǎo)此產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽，或生長(zhǎng)成完整植株的方法。
[0005] 西洋參皂甙的生產(chǎn)主要是種植西洋參，需要選擇特定的氣候、生態(tài)和土壤環(huán)境條 件，并且在保護(hù)地條件下生長(zhǎng)，一般需要4~5年才可以收獲。然后，利用種植的西洋參根 直接使用，或?qū)⒏?、葉等器官作為原料，提取分離其中的皂甙類化合物。這種方法周期長(zhǎng)，需 用土地，對(duì)栽培條件，環(huán)境條件要求嚴(yán)格?，F(xiàn)有技術(shù)中，也有利用西洋參果實(shí)發(fā)酵方法生產(chǎn) 或富集西洋參總皂甙，主要是利用酵母菌發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生酶的作用，這種方法，可以增加總皂甙 的量，但并不屬于真正意義上的"生產(chǎn)"，而且該方法無(wú)法"定向"生產(chǎn)皂甙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種生產(chǎn)西洋參皂甙的懸浮培養(yǎng) 方法，以提供一種能夠穩(wěn)定生產(chǎn)人參皂甙，并能夠定向生產(chǎn)總皂甙和單體皂甙的西洋參懸 浮細(xì)胞。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 一種生產(chǎn)西洋參皂甙的懸浮培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0009] (1)無(wú)菌條件下，取西洋參根尖組織，將其形態(tài)學(xué)上的下端接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上， 然后置于暗箱中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得致密型愈傷組織，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為： 在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1. 5~2. 5mg/L的2,4-D和0. 5~1.0 mg/L的6-BA，滅菌前調(diào)節(jié) pH 至 4. 5 ~5. 8 ;
[0010] (2)將步驟（1)的致密型愈傷組織轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中，然后置于暗箱中進(jìn)行繼 代培養(yǎng)，獲得疏松型愈傷組織，所述繼代培養(yǎng)基的配方為：在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1. 5~ 2. 5mg/L的2,4-D和0? 5~1.0 mg/L的6-BA，調(diào)節(jié)鹿糖濃度為20~30g/L，滅菌前調(diào)節(jié)pH 至 4. 5 ~5. 8;
[0011] (3)將步驟（3)的疏松型愈傷組織轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基中，置于自然光照下振蕩懸 浮培養(yǎng)，獲得懸浮細(xì)胞，所述懸浮培養(yǎng)基的配方為：在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0. 8~1.0 mg/L 的 2,4-D、0. lmg/L 的激動(dòng)素 KT、0. 3 ~0? 5mg/L 的 6-BA、0. 3 ~0? 5mg/L 的 NAA、調(diào)節(jié)蔗糖濃 度為20~30g/L，滅菌前調(diào)節(jié)pH至4. 5~5. 8,此時(shí)，該懸浮細(xì)胞中的總皂甙的含量最高， 單體皂甙的含量較少；
[0012] (4)調(diào)節(jié)步驟（3)的懸浮培養(yǎng)基的激素配方，將步驟（3)的懸浮細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的 定向培養(yǎng)，其中：
[0013] 總皂甙定向培養(yǎng)的懸浮培養(yǎng)基的配方為：在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.7~I. 2mg/ L 的 2,4-D、0. 1 ~0? 3mg/L 的 KT、0. 5mg/L 的 6-BA、0. 4 ~0? 8mg/L 的 NAA，調(diào)節(jié)蔗糖濃度為 20~30g/L，獲得富含總皂甙的懸浮細(xì)胞；
[0014] 單體皂甙Rgl定向培養(yǎng)的懸浮培養(yǎng)基的配方為：在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.5~ 1.0 mg/L 的 2,4_D、0. lmg/L 的 KT、0. 5 ~1.0 mg/L 的 6_BA、0. 5mg/L 的 NAA，調(diào)節(jié)鹿糖濃度為 20~30g/L，獲得富含單體皂甙Rgl的懸浮細(xì)胞；
[0015] 單體皂甙Rhl定向培養(yǎng)的懸浮培養(yǎng)基的配方為：在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.8~ 1.0 mg/L 的 2, 4-D、0. lmg/L 的 KT、0. 5 ~1.0 mg/L 的 6-BA、0. 8 ~1.0 mg/L 的 NAA，調(diào)節(jié)蔗糖 濃度為20~30g/L，獲得富含單體皂甙Rhl的懸浮細(xì)胞。
[0016] 所述步驟（1)中，西洋參根尖組織的無(wú)菌處理步驟為：
[0017] 步驟一：將西洋參根尖先用清水清洗，再用質(zhì)量比為0. 1~0. 3%洗衣粉漂洗，毛 刷刷除表面泥土，流水沖洗1~2h;
[0018] 步驟二：將西洋參根尖轉(zhuǎn)移至無(wú)菌室中，先用體積比為75%的酒精浸泡消毒20~ 3〇min，再用體積比為0. 1 %的升采浸泡消毒10~20s ;
[0019] 步驟三：重復(fù)步驟二的消毒步驟1次以上。
[0020] 所述步驟（1)中，將西洋參根尖組織切成厚度為0. 1~〇.2_的薄片，再接種至誘 導(dǎo)培養(yǎng)基上。
[0021] 所述步驟⑵中，繼代培養(yǎng)的周期為15天。
[0022] 所述步驟⑶中，懸浮培養(yǎng)的周期為20~25天。
[0023] 所述步驟⑷中，定向培養(yǎng)的周期為20~25天。
[0024]所述步驟（1)~（4)中，培養(yǎng)的溫度為18~27°C，所述步驟（3)中，振蕩的轉(zhuǎn)速為 110 ~140rpm。
[0025] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)西洋參皂甙的懸浮培 養(yǎng)方法，該方法公開(kāi)了西洋參根尖愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)相關(guān)因素及組合配 比，避免了因培養(yǎng)條件的改變導(dǎo)致皂甙含量的變化，利用該方法能夠穩(wěn)定生產(chǎn)人參皂甙，生 產(chǎn)周期短；通過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件的控制，還能夠?qū)崿F(xiàn)總皂甙與單體皂甙的定向培育，為西洋參皂 甙的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)；本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、容易控制、方法可靠，為西 洋參細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)，為西洋參資源有效利用開(kāi)辟了新途徑， 其定向培育計(jì)數(shù)，能夠獲得定向活性物質(zhì)，對(duì)資源深度開(kāi)發(fā)利用具有深遠(yuǎn)的意義。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 1、材料
[0029] 1. 1、誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方：
[0030] 在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入I. 5mg/L的2,4-D和0?5mg/L的6-BA，滅菌前調(diào)節(jié)pH至 4. 5~5. 8,用150mL的三角瓶分裝，每瓶分裝30mL，滅菌；
[0031] 1.2、繼代培養(yǎng)基的配方：
[0032] 在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入I. 5mg/L的2,4-D和0?5mg/L的6-BA，調(diào)節(jié)蔗糖濃度為 20g/L，滅菌前調(diào)節(jié)pH至4. 5~5. 8,用150mL的三角瓶分裝，每瓶分裝30mL，滅菌；
[0033] 1. 3、懸浮培養(yǎng)基的配方