非動(dòng)物源性防凍液及其對(duì)食蟹猴精液的冷凍保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種非動(dòng)物源性防凍液及其對(duì)食蟹猴精液的冷凍保存方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]雖然很多動(dòng)物的精子都能夠被成功冷凍保存，但相當(dāng)一部分精子會(huì)因冷凍復(fù)蘇過程中受到的損傷而喪失其運(yùn)動(dòng)能力。對(duì)大多數(shù)動(dòng)物而言，即使采用最先進(jìn)的儀器設(shè)備和最佳冷凍程序，也僅有約50%的精子能夠存活下來。精子冷凍的效率之所以這么低，主要是因?yàn)槿藗儗?duì)精子冷凍損傷的機(jī)制及某些具有冷凍保護(hù)作用物質(zhì)的作用機(jī)理缺乏了解所致。
[0004]在大多數(shù)動(dòng)物精子冷凍保存中，防凍液中除甘油外一般還加入一些動(dòng)物源性物質(zhì)如卵黃、脫脂奶、牛奶等，有的甚至加入血清。由于這些動(dòng)物源性物質(zhì)成分復(fù)雜且含有許多化學(xué)成分不確定的分子，這就使得在分析某種物質(zhì)對(duì)精子冷凍起何作用的時(shí)候極為困難。此外，卵黃等動(dòng)物源性物質(zhì)不僅可能會(huì)含有一些致病性因子，如病毒、細(xì)菌、真菌、朊蛋白等，而且對(duì)它們的質(zhì)控也不容易。
[0005]鑒于以上這些原因，成分確定的稀釋液有助于人們更好地理解精子低溫冷凍損傷的機(jī)制以及某些物質(zhì)的冷凍保護(hù)機(jī)理。
[0006]卵黃、脫脂奶等動(dòng)物源性物質(zhì)在動(dòng)物精液冷凍中主要起著抗冷休克、提高冷凍精液存活率的作用，用非動(dòng)物源性防凍液凍存的精子其存活率通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于40%，不能用于進(jìn)行體外受精或人工受精。以前的研究表明，小鼠、山羊和人精子可成功凍存于化學(xué)成分確定的非動(dòng)物源性防凍液中，但類似技術(shù)在靈長(zhǎng)類動(dòng)物精子冷凍中還未見報(bào)道。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是為了杜絕體外受精或人工受精系統(tǒng)中引入致病性因子的風(fēng)險(xiǎn)，更好地理解精子低溫冷凍損傷機(jī)制以及冷凍保護(hù)機(jī)理，對(duì)防凍液的質(zhì)控易于進(jìn)行，提供一種非動(dòng)物源性防凍液及其對(duì)食蟹猴精液的冷凍保存方法，使食蟹猴精液冷凍復(fù)蘇后精子存活率超過40%，用于相關(guān)的科研及動(dòng)物繁殖工作。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下:
一種非動(dòng)物源性防凍液及其對(duì)食蟹猴精液的冷凍保存方法，步驟如下:
(1)取0.2gTrisU.2g TES、2g乳糖、2g葡萄糖、0.2g棉籽糖、10000IU青霉素G鈉鹽和5mg硫酸鏈霉素，依次溶于80mL Mill1-Q超純水中，混合均勻后加Mill1-Q超純水定容至10mL,用IN NaOH或IN HCl調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，制成稀釋液；
(2)取18mL稀釋液，加入2mL的甘油制成2X防凍液；
(3)在室溫下，將食蟹猴精液與所述稀釋液按1:9的體積比在試管中混合并放置I小時(shí)，得稀釋精液； (4)室溫下，所得稀釋精液中加入等體積的、含甘油的2X防凍液，混勻后于室溫平衡30分鐘得防凍精液；
(5)將防凍精液吸入0.25 mL冷凍麥管并封口，然后將麥管轉(zhuǎn)入4°C冰箱緩慢降溫45分鐘；
(6)將降溫后的麥管置于液氮面上方5cm處熏蒸冷凍10分鐘后投入液氮中保存；
(5)復(fù)蘇時(shí)將冷凍麥管由液氮中迅速轉(zhuǎn)移至37°C的水浴中解凍2分鐘。
[0010]所述的室溫為20-23°C。
[0011]所述2X防凍液分五次加入試管，每次間隔5分鐘加入1/5體積，甘油的終濃度為5%。
[0012]所述Tris和TES分別為三羥甲基氨基甲烷和N-三(羥甲基)甲基_2_氨基乙烷磺酸鈉的英文縮寫。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
本發(fā)明杜絕了體外受精或人工受精系統(tǒng)中引入致病性因子的風(fēng)險(xiǎn)，便于更好地理解精子低溫冷凍損傷機(jī)制以及冷凍保護(hù)機(jī)理，對(duì)防凍液的質(zhì)控也易于進(jìn)行。利用本發(fā)明的非動(dòng)物源性防凍液可使食蟹猴精液冷凍復(fù)蘇后精子的存活率超過40%，可用于相關(guān)的科研及動(dòng)物繁殖工作，同時(shí)為用非動(dòng)物源性防凍液冷凍保存其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物的精子提供借鑒作用。
[0014]
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
[0016]實(shí)施例:
稱取0.2g TrisU.2g TES、2g乳糖、2g葡萄糖、0.2g棉籽糖、10000IU青霉素、5mg硫酸鏈霉素依次溶于80mL Mill1-Q超純水中，混合均勻后加Mill1-Q超純水定容至10mL,用IN NaOH或IN HCl調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，制成冷凍保存稀釋液。向精液稀釋液中加入體積比10%的甘油制成精液冷凍保存的2X防凍液。在室溫條件下20-23°C，將食蟹猴的精液與稀釋液按1:9的體積比在4mL的試管中混合并放置I小時(shí)。然后，在室溫下向試管中加入等體積的、含甘油的2X防凍液，分五次添加，每次加入1/5體積，每次間隔5分鐘，甘油的終濃度為5%，混勻后于室溫平衡30分鐘。接著，將所得精液吸入0.25 mL冷凍麥管并封口，然后將麥管轉(zhuǎn)入4°C冰箱緩慢降溫45分鐘。將麥管置于液氮面上方5cm處熏蒸冷凍10分鐘后投入液氮中保存。復(fù)蘇時(shí)將冷凍麥管由液氮中迅速轉(zhuǎn)移至37°C的水浴中解凍2分鐘。
[0017]對(duì)冷凍保存的食蟹猴精液，在顯微鏡下檢測(cè)冷凍復(fù)蘇后精子的運(yùn)動(dòng)度、運(yùn)動(dòng)度復(fù)蘇率，精子運(yùn)動(dòng)度復(fù)蘇率的記算:以Mpr代表冷凍前精子的運(yùn)動(dòng)度，Mps代表復(fù)蘇精子運(yùn)動(dòng)度，則精子運(yùn)動(dòng)度的復(fù)蘇率(％)=Mps/Mpr X 100%。用熒光染料Hoechst 33258熒光染色法實(shí)驗(yàn)測(cè)定冷凍精子復(fù)蘇后的質(zhì)膜完整率，其結(jié)果表明:冷凍復(fù)蘇精子運(yùn)動(dòng)度為43%，運(yùn)動(dòng)度復(fù)蘇率為56%，精子質(zhì)膜完整率為50%。
[0018]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種非動(dòng)物源性防凍液及其對(duì)食蟹猴精液的冷凍保存方法，其特征在于，步驟如下: (1)取0.2gTrisU.2g TES、2g乳糖、2g葡萄糖、0.2g棉籽糖、10000IU青霉素G鈉鹽和5mg硫酸鏈霉素，依次溶于80mL Mill1-Q超純水中，混合均勻后加Mill1-Q超純水定容至10mL,用IN NaOH或IN HCl調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，制成稀釋液； (2)取18mL稀釋液，加入2mL的甘油制成2X防凍液； (3)在室溫下，將食蟹猴精液與所述稀釋液按1:9的體積比在試管中混合并放置I小時(shí)，得稀釋精液； (4)室溫下，所得稀釋精液中加入等體積的、含甘油的2X防凍液，混勻后于室溫平衡30分鐘得防凍精液； (5)將防凍精液吸入0.25 mL冷凍麥管并封口，然后將麥管轉(zhuǎn)入4°C冰箱緩慢降溫45分鐘； (6)將降溫后的麥管置于液氮面上方5cm處熏蒸冷凍10分鐘后投入液氮中保存； (5)復(fù)蘇時(shí)將冷凍麥管由液氮中迅速轉(zhuǎn)移至37°C的水浴中解凍2分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非動(dòng)物源性防凍液對(duì)食蟹猴精液的冷凍保存方法，其特征在于，所述室溫為20-23°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非動(dòng)物源性防凍液對(duì)食蟹猴精液的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(2)所述的2X防凍液分五次加入試管，每次間隔5分鐘加入1/5體積，甘油的終濃度為5%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種非動(dòng)物源性防凍液及其對(duì)食蟹猴精液的冷凍保存方法，該防凍液由0.2g Tris、1.2g TES、2g 乳糖、2g 葡萄糖、0.2g 棉籽糖、10000IU 青霉素G鈉鹽、5mg硫酸鏈霉素依次溶于80mL Milli-Q 超純水中，混合均勻后加Milli-Q 超純水定容至100mL，用1N NaOH 或1N HCl調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，制成稀釋液，再取稀釋液，加入甘油制成2×防凍液；本發(fā)明杜絕了體外受精或人工受精系統(tǒng)中引入致病性因子的風(fēng)險(xiǎn)，便于更好地理解精子低溫冷凍損傷機(jī)制以及冷凍保護(hù)機(jī)理，對(duì)防凍液的質(zhì)控也易于進(jìn)行。
【IPC分類】A01N1-02
【公開號(hào)】CN104521944
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410847275
【發(fā)明人】李亞輝, 楊明華
【申請(qǐng)人】云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月31日