專利名稱：：一種改良雜交稻恢復(fù)系抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物新品種選育的方法，具體涉及到一種改良雜交稻恢復(fù)系抗性的方法。其國際專利分類號為A01H1／00。我國自1973年實現(xiàn)雜交稻三系配套以來，培育了許多優(yōu)良的雜交稻恢復(fù)系親本，配制了許多強優(yōu)勢的雜交稻組合，為我國的糧食生產(chǎn)作出了卓越的貢獻。但目前應(yīng)用的大多數(shù)恢復(fù)系的抗性較差，嚴重制約了我國雜交稻的進一步推廣應(yīng)用?；亟挥N長期以來是對綜合性狀優(yōu)良但個別性狀較差的現(xiàn)有品種實施改良的有效手段，尤其是提高現(xiàn)有品種抗性的常用方法。通常以待改良的品種為輪回親本，以帶有理想目標性狀的材料為供體親本，二者雜交后雜種再與輪回親本回交，從回交后代中選擇含有目標性狀的單株與輪回親本再次回交。如此回交數(shù)代后可以得到遺傳背景大致與輪回親本相同但導(dǎo)入了目標性狀的單株。但常規(guī)回交育種的周期往往較長，且存在輪回親本基因型恢復(fù)的偏離等問題，難以適應(yīng)對雜交稻恢復(fù)系進行抗性改良的需要。究其原因，主要是由于常規(guī)回交育種是基于田間表型的選擇，而不是對基因型的選擇。發(fā)明者認為，由于存在多因一效、一因多效，以及調(diào)控基因、修飾基因等的作用，許多性狀與基因間并非一對一的關(guān)系，加之表型又是基因型與環(huán)境相互作用的結(jié)果，因此以表型來推測基因型存在著一定程度的不可靠性。而且，植株的表型選擇本身要求具有豐富的實踐經(jīng)驗和藝術(shù)家般的鑒賞眼光。表型選擇的效率較低，制約了品種改良的進程。此外，對某些特殊性狀的直接鑒定還受到許多條件的限制。例如對某些抗病蟲性的選擇，有時依靠自然鑒定難以進行，采用人工接種或接蟲的方法也很困難或費用太高，或基于安全考慮受到明令禁止。因此，在育種過程中，如何將基因型選擇與表型選擇有機結(jié)合，從而提高選擇的效率，是進一步加快新品種選育進程的關(guān)鍵。近年來發(fā)展起來的分子標記輔助選擇技術(shù)，為解決上述問題創(chuàng)造了條件。所謂分子標記輔助選擇，就是借助與目標基因緊密連鎖的分子標記基因型的分析，鑒定分離群體中含有目標等位基因的個體，從而加速育種的進程。由于分子標記輔助選擇技術(shù)使得傳統(tǒng)的表型選擇發(fā)展到對理想基因型的直接選擇，從而可以大大提高選擇的效率，縮短育種的周期。近年來，將分子標記輔助選擇技術(shù)應(yīng)用于作物遺傳改良的嘗試已有報道。例如，在水稻中，Yoshimura等(1995)和Huang等(1997)借助分子標記輔助選擇技術(shù)將數(shù)個白葉枯病抗性基因聚合在一起。然而，他們既沒有跟蹤導(dǎo)入抗性基因片段的大小，也沒有對抗性基因區(qū)段外的遺傳背景實施選擇，因而不可能用于雜交稻恢復(fù)系的抗性改良。發(fā)明者認為，作為一種雜交稻恢復(fù)系抗性改良的方法，最重要的兩個方面是(1)在導(dǎo)入目標抗性基因的同時，要盡可能避免供體親本中與目標基因緊密連鎖的其他不利基因滲入到改良體中，導(dǎo)致改良體與預(yù)期目標不盡一致；(2)在改良目標抗性的同時，要確保原恢復(fù)系所特有的高配合力、強適應(yīng)性等優(yōu)良性狀得以保持。因此，作為一種高效、可靠的分子標記輔助的雜交稻恢復(fù)系抗性改良的新方法，不但要有效地跟蹤導(dǎo)入抗性基因片段的大小，而且要對抗性基因區(qū)段外的遺傳背景實施快速而有效的選擇。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高效、可靠的分子標記輔助的雜交稻恢復(fù)系抗性改良方法。本發(fā)明可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種改良雜交稻恢復(fù)系抗性的方法，包括雜交，回交，抗性鑒定和分子標記檢測方法，其特征在于，采用一次雜交，三次回交和一次自交的育種程序，將目標基因?qū)氲酱牧嫉碾s交稻恢復(fù)系中，采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測并選擇與目標基因共分離和／或緊密連鎖的分子標記基因型，使含有目標基因的導(dǎo)入片段盡可能小，應(yīng)用擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)標記對遺傳背景實施選擇，使除開目標基因區(qū)段之外，改良型恢復(fù)系基因組與原恢復(fù)系相同，并對改良型恢復(fù)系進行抗性鑒定，繁殖和雜種生產(chǎn)。下面詳細敘述本發(fā)明的細節(jié)一種改良雜交稻恢復(fù)系抗性的方法如下所述改良雜交稻恢復(fù)系抗性的方法采用如下步驟a．以含有目標抗性基因的品系為供體親本，以待改良的雜交稻恢復(fù)系為輪回親本，二者雜交，所得雜種一代(F1)再與輪回親本回交，得到回交一代(BC1F1)；b．對BC1F1單株進行PCR檢測，選出含目標基因者進行AFLP篩選，選出輪回親本遺傳背景最多的單株再與輪回親本回交，得到回交二代(BC2F1)；c．對BC2F1單株進行PCR檢測，選出含目標基因且在該基因一側(cè)與緊密連鎖的分子標記發(fā)生交換者進行AELP篩選，選出輪回親本遺傳背景最多的單株再與輪回親本回交，得到回交三代(BC3F1)；d．對BC3F1單株進行PCR檢測，選出含目標基因且在該基因另一側(cè)與另一緊密連鎖的分子標記發(fā)生交換的單株，套袋自交，得到BC3F2；e．對BC3F2單株進行PCR檢測，選出目標基因純合者進行AFLP篩選，選出除目標基因區(qū)段外的遺傳背景全為輪回親本的單株，即為改良型恢復(fù)系。所述PCR檢測方法包括a．PCR反應(yīng)體系為，各待檢測單株的DNA各10-50ng，依據(jù)與目標基因共分離或緊密連鎖的分子標記設(shè)計的特異正向引物和反向引物各0．25uM，TaqDNA聚合酶各0．5-1．5U，四種脫氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dGTP和dCTP各0．1mM，Tris-HCl(pH8．3)和KCl各10mM，以及MgCl2各2mM，PCR反應(yīng)體積為15-25uL；b．PCR循環(huán)程序為，首先在94℃C變性3-5分鐘，然后在94℃變性30-45秒，50-60℃退火0．5-1．5分鐘，72℃延伸1-2分鐘，運行25-40個循環(huán)，最后在72℃延伸5-8分鐘；c．PCR產(chǎn)物的檢測為，在1％-1．4％的瓊脂糖凝膠上點樣，在50-100伏直流電壓下電泳4-6小時，進行溴化乙啶染色，置于紫外光下讀取各樣品的PCR帶型，確定各樣品的分子標記基因型。所述運用AFLP篩選遺傳背景的方法包括如下步驟a．在37℃對各待測單株的DNA進行限制性內(nèi)切酶MseⅠ和EcoRⅠ雙酶消化3小時后，再加入T4DNA連接酶，繼續(xù)溫育3小時；b．加入EcoRⅠ+1引物和MseⅠ+1引物以及TaqDNA聚合酶在60℃的退火溫度下進行選擇性預(yù)擴增；c．在另一管中加入EeoRⅠ+3引物、T4激酶和γ-32P[ATP]，在37℃溫育0．5小時，對EcoRⅠ+3引物進行末端標記；d．加入預(yù)擴增產(chǎn)物、EcoRⅠ+3引物、MseⅠ+3引物以及TaqDNA聚合酶，在65℃的退火溫度下進行選擇性擴增；e．PCR產(chǎn)物在6-8％的聚丙烯酰胺凝膠上點樣，在70瓦功率下電泳2．5-3．5小時后，揭下凝膠，放射自顯影3-24小時；f．在放射自顯影的X光膠片上讀取各樣品的AFLP帶型，計算各樣品恢復(fù)輪回親本基因型的比率。所述改良型恢復(fù)系的抗性鑒定方法是在水稻生長的分蘗盛期實施白葉枯病菌液剪葉接種鑒定。接種菌液濃度為108-109／mL。每株接種5-8片健康葉片。2-3周后測量病斑長度。病斑長度小于3cm者為抗病(R)，3-6cm者為中抗(MR)，6-9cm者為中感(MS)，9em以上者為感病(S)。所述改良型恢復(fù)系的繁殖方法是將改良型恢復(fù)系種植于人工隔離或天然屏障隔離良好的條件下，株行距為16×26cm。種子成熟后收獲繁殖的改良型恢復(fù)系種子。所述改良型恢復(fù)系的雜種生產(chǎn)方法是將改良型恢復(fù)系與不育系種植于人工隔離或天然屏障隔離良好的條件下，改良型恢復(fù)系與不育系的行比為1∶8，株行距為16×26cm。種子成熟后于不育系上收獲種子，即為改良型恢復(fù)系的雜種。實例1雜交稻恢復(fù)系明恢63的白葉枯病抗性改良a．以含有廣譜高抗白葉枯病基因Xa21的品系IRBB21為供體親本，以我國應(yīng)用最廣的雜交稻恢復(fù)系明恢63為輪回親本，二者雜交，所得F1再與輪回親本回交，得到BC1F1；b．對BC1F1單株進行PCR分析，選出含Xa21基因者進行AFLP分析，選出輪回親本遺傳背景最多的單株再與輪回親本回交，得到BC2F1；c．對BC2F1單株進行PCR分析，選出含Xa21基因且在該基因一側(cè)與分子標記AB9發(fā)生交換者進行AFLP分析，選出輪回親本遺傳背景最多的單株再與輪回親本回交，得到BC3F1；d．對BC3F1單株進行PCR分析，選出含Xa21基因且在該基因另一側(cè)與分子標記C189發(fā)生交換的單株，套袋自交，得到BC3F2；e．對BC3F2單株進行PCR分析，選出Xa21基因純合者進行AFLP分析，選出除Xa21基因區(qū)段外的遺傳背景全為輪回親本的單株，即為改良型明恢63。實例2改良型汕優(yōu)63的雜種生產(chǎn)方法將改良型明恢63與不育系珍汕97A種植于天然屏障隔離良好的條件下(四周100米的范圍內(nèi)無花期相遇的其他水稻材料)，改良型明恢63與珍汕97A的行比為1∶8，株行距為16×26cm。種子成熟后于珍汕97A上收獲種子，即為改良型汕優(yōu)63。實例3明恢63及其改良型、汕優(yōu)63及其改良型的多菌系接種鑒定結(jié)果1998年夏，采用來自我國各主要稻區(qū)和菲律賓、日本等國的14個對明恢63致病的白葉枯病菌株在武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)病圃對明恢63及其改良型、汕優(yōu)63及其改良型進行了多菌系接種鑒定(詳見表1)。結(jié)果表明，改良型明恢63．及其配組而得的改良型汕優(yōu)63對所有供試菌株均表現(xiàn)抗病，與原抗性親本IRBB21達到同一抗性水平，而與原明恢63和汕優(yōu)63相比，抗性顯著增強，完全達到了預(yù)期的目標。表1．明恢63及其改良型、汕優(yōu)63及其改良型的多菌系接種鑒定結(jié)果(1998年夏，武漢)<tablesid="table1"num="001"><table>菌系來源菌群明恢63汕優(yōu)63IRBB21明恢63(改良型)汕優(yōu)63(改良型)珍珠矮72-67湖南SSMRMRMRSHB17河北2MRMSRRRSJS49-6湖南7MRMSRRRSKS6-6江蘇2MSSRRRSLN42遼寧MRMRRRRSLN44遼寧1MSSRRRSZJ173浙江4SSRRRSPxo61菲律賓1MSSRRRSPxo79菲律賓3MRMSRRRSPxo71菲律賓4MRMSRRRSPxo112菲律賓5MSSRRRSPxo99菲律賓6SSRRRST7174日本1MSSRRRST7133日本3MSSRRRS</table></tables>實例4明恢63及其改良型、汕優(yōu)63及其改良型在不同條件下的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)1999年春，在海南省陵水縣華中農(nóng)業(yè)大學(xué)育種基地對明恢63及其改良型、汕優(yōu)63及其改良型在不同條件下進行了農(nóng)藝性狀考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，明恢63及其改良型、汕優(yōu)63及其改良型在正常條件下的各種農(nóng)藝性狀均無顯著差異(詳見表2)，表明通過分子標記輔助選擇之后，輪回親本基因型得到了很好的恢復(fù)。在人工接種ZJ173、LN44和Pxo99等三個白葉枯病菌株的條件下，明恢63及其改良型、汕優(yōu)63及其改良型在株高、穗長等形態(tài)性狀和生育期等方面無顯著差異但在產(chǎn)量性狀方面存在顯著差異(詳見表3)，主要表現(xiàn)為原明恢63在千粒重和結(jié)實率上較改良型明恢63分別降低了6．61％和11．39％，原汕優(yōu)63在穗粒數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量等方面較改良型汕優(yōu)63分別降低18．11％、6．63％和29．79％。綜合表2和表3的結(jié)果，可以看出，由于導(dǎo)入了廣譜高抗白葉枯病基因Xa21，改良型明恢63和改良型汕優(yōu)63的抗性顯著增強，其在病害條件下和在正常條件下的表現(xiàn)相同，可以確保高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)而原明恢63和原汕優(yōu)63在病害條件下則表現(xiàn)較差，造成減產(chǎn)減收。表2．明恢63及其改良型、汕優(yōu)63及其改良型和IRBB21在未接種條件下的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)(1999年春，海南)LSD0．05和LSD0．01分別表示在0．05和0．01概率水平上達到差異顯著的最小差數(shù)。表3．明恢63及其改良型、汕優(yōu)63及其改良型和IRBB21在人工接種條件下的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)(1999年春，海南)本發(fā)明的優(yōu)點在于1．通過對與目標基因共分離和緊密連鎖的分子標記基因型的PCR分析和選擇，有效地解決了常規(guī)回交育種中長期存在的連鎖累贅問題，即由于不利基因與目標基因緊密連鎖致使所得改良體與預(yù)期的目標不盡一致的現(xiàn)象；2．通過運用AFLP技術(shù)對各回交后代個體基因組的背景選擇，有效地解決了常規(guī)回交育種中輪回親本基因型恢復(fù)的偏離問題，使得在改良目標性狀的同時，原恢復(fù)系所特有的高配合力、強適應(yīng)性等優(yōu)良性狀得以保持，因而改良體可以替代原恢復(fù)系直接用于雜種生產(chǎn)。3．分子標記技術(shù)的運用，使得回交育種的周期縮短，育種進程加快，適應(yīng)了抗病育種的需要。權(quán)利要求1．一種改良雜交稻恢復(fù)系抗性的方法，包括雜交，回交，抗性鑒定和分子標記檢測方法，其特征在于，采用一次雜交，三次回交和一次自交的育種程序，將目標基因?qū)氲酱牧嫉碾s交稻恢復(fù)系中，采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測并選擇與目標基因共分離和／或緊密連鎖的分子標記基因型，使含有目標基因的導(dǎo)入片段盡可能小，應(yīng)用擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)標記對遺傳背景實施選擇，使除開目標基因區(qū)段之外，改良型恢復(fù)系基因組與原恢復(fù)系相同，并對改良型恢復(fù)系進行抗性鑒定，繁殖和雜種生產(chǎn)。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述改良雜交稻恢復(fù)系抗性的方法采用如下步驟a．以含有目標抗性基因的品系為供體親本，以待改良的雜交稻恢復(fù)系為輪回親本，二者雜交，所得雜種一代(F1)再與輪回親本回交，得到回交一代(BC1F1)；b．對BC1F1單株進行PCR檢測，選出含目標基因者進行AFLP篩選，選出輪回親本遺傳背景最多的單株再與輪回親本回交，得到回交二代(BC2F1)；c．對BC2F1單株進行PCR檢測，選出含目標基因且在該基因一側(cè)與緊密連鎖的分子標記發(fā)生交換者進行AFLP篩選，選出輪回親本遺傳背景最多的單株再與輪回親本回交，得到回交三代(BC3F1)；d．對BC3F1單株進行PCR檢測，選出含目標基因且在該基因另一側(cè)與另一緊密連鎖的分子標記發(fā)生交換的單株，套袋自交，得到BC3F2；e．對BC3F2單株進行PCR檢測，選出目標基因純合者進行AFLP篩選，選出除目標基因區(qū)段外的遺傳背景全為輪回親本的單株，即為改良型恢復(fù)系。3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述PCR檢測方法包括a．PCR反應(yīng)體系為，各待檢測單株的DNA各10-50ng，依據(jù)與目標基因共分離或緊密連鎖的分子標記設(shè)計的特異正向引物和反向引物各0．25uM，TaqDNA聚合酶各0．5-1．5U，四種脫氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dGTP和dCTP各0．1mM，Tris-HCl(pH8．3)和KCl各10mM，以及MgCl2各2mM，PCR反應(yīng)體積為15-25uL；b．PCR循環(huán)程序為，首先在94℃變性3-5分鐘，然后在94℃變性30-45秒，50-60℃退火0．5-1．5分鐘，72℃延伸1-2分鐘，運行25-40個循環(huán)，最后在72℃延伸5-8分鐘；c．PCR產(chǎn)物的檢測為，在1％-1．4％的瓊脂糖凝膠上點樣，在50-100伏直流電壓下電泳4-6小時，進行溴化乙啶染色，置于紫外光下讀取各樣品的PCR帶型，確定各樣品的分子標記基因型。4．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述AFLP篩選遺傳背景的方法包括如下步驟a．在37℃對各待測單株的DNA進行限制性內(nèi)切酶MseⅠ和EcoRⅠ雙酶消化3小時后，再加入T4DNA連接酶，繼續(xù)溫育3小時；b．加入EcoRⅠ+1引物和MseⅠ+1引物以及TaqDNA聚合酶在60℃的退火溫度下進行選擇性預(yù)擴增；c．在另一管中加入EcoRⅠ+3引物、T4激酶和γ-32P[ATP]，在37℃溫育0．5小時，對EcoRⅠ+3引物進行末端標記；d．加入預(yù)擴增產(chǎn)物、EcoRⅠ+3引物、MseⅠ+3引物以及TaqDNA聚合酶，在65℃的退火溫度下進行選擇性擴增；e．PCR產(chǎn)物在6-8％的聚丙烯酰胺凝膠上點樣，在70瓦功率下電泳2．5-3．5小時后，揭下凝膠，放射自顯影3-24小時；f．在放射自顯影的X光膠片上讀取各樣品的AFLP帶型，計算各樣品恢復(fù)輪回親本基因型的比率。5．根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述改良型恢復(fù)系的抗性鑒定方法是在水稻生長的分蘗盛期實施白葉枯病菌液剪葉接種鑒定，接種菌液濃度為108-109／mL，每株接種5-8片健康葉片，2-3周后測量病斑長度。6．根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述改良型恢復(fù)系的繁殖方法是將改良型恢復(fù)系種植于人工隔離或天然屏障隔離良好的條件下，株行距為16×26cm。種子成熟后收獲繁殖的改良型恢復(fù)系種子。7．根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述改良型恢復(fù)系的雜種生產(chǎn)方法是將改良型恢復(fù)系與不育系種植于人工隔離或天然屏障隔離良好的條件下，改良型恢復(fù)系與不育系的行比為1∶8，株行距為16×26cm。種子成熟后于不育系上收獲種子，即為改良型恢復(fù)系的雜種。全文摘要一種改良雜交稻恢復(fù)系抗性的方法,屬于植物新品種選育
技術(shù)領(lǐng)域：
。其特征在于,通過一次雜交,三次回交和一次自交的育種程序,將目標基因?qū)氲酱牧嫉碾s交稻恢復(fù)系中,采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測并選擇與目標基因共分離和/或緊密連鎖的分子標記基因型,使含有目標基因的轉(zhuǎn)移片段盡可能小,應(yīng)用擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)標記對遺傳背景實施選擇,使除開目標基因區(qū)段之外,改良型恢復(fù)系基因組與原恢復(fù)系相同。文檔編號A01H1/00GK1279884SQ99116539公開日2001年1月17日申請日期1999年7月9日優(yōu)先權(quán)日1999年7月9日發(fā)明者陳升,徐才國,林興華,張啟發(fā)申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)