專利名稱：：生產(chǎn)穩(wěn)定的葉綠素缺陷型植物的方法及用該方法獲得的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物，更具體地講，涉及葉綠素缺陷型植物和植物細(xì)胞系。葉綠素缺陷型植物和植物細(xì)胞系可用于若干工業(yè)領(lǐng)域。例如，高等植物和植物細(xì)胞的葉綠素缺陷型突變體，被普遍作為容易檢測的遺傳標(biāo)記，用于植物基因組可突變性和細(xì)胞質(zhì)遺傳學(xué)的實(shí)驗(yàn)中。另外，在植物育種中，葉綠素缺陷型是一種標(biāo)記，在對來自一種細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和來自另一種細(xì)胞的核材料進(jìn)行組合時(shí)可以使用該標(biāo)記。花斑植物(該植物的白色部位是葉綠素缺陷型)同樣是非常流行的觀賞植物，而且，在園藝行業(yè)中需要培育這種植物。常規(guī)葉綠素缺陷型植物和植物細(xì)胞系是通過突變育成的，所述突變可以是以低的頻率自發(fā)發(fā)生的或者是通過誘變劑誘導(dǎo)的。與所述突變方法相關(guān)的一個(gè)缺陷是，無法控制對植物基因型的誘變改變。在大多數(shù)情況下，通過誘變誘導(dǎo)葉綠素缺陷型植物，會(huì)伴隨著在不同基因座上的高比例的隨機(jī)基因組突變，這會(huì)改變植物群體的遺傳組成。誘變方法還需要很長時(shí)間，并通常使用會(huì)對操作者造成危害的試劑。另外，葉綠素缺陷型植物和植物細(xì)胞可以使用遺傳工程技術(shù)通過定向突變產(chǎn)生。不過，這種技術(shù)花費(fèi)極其昂貴，并需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、材料和專業(yè)工人。葉綠素缺陷型還可以用非誘變劑誘導(dǎo)。不過，用已知非誘變劑技術(shù)育成的植物和植物細(xì)胞系，在取消誘變劑之后會(huì)恢復(fù)足夠的葉綠素(“綠色”)表型和/或細(xì)胞不能進(jìn)行細(xì)胞分裂，而保持葉綠素缺陷表型。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)穩(wěn)定的葉綠素缺陷型植物和植物細(xì)胞系以及花斑植物的方法。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種生產(chǎn)穩(wěn)定的(如本文所定義的)葉綠素缺陷型植物和植物細(xì)胞系的方法，包括對植物材料進(jìn)行處理，抑制質(zhì)體蛋白合成，并在不進(jìn)行所述處理的條件下由處理的植物材料生長植物和植物細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種植物，其中，質(zhì)體蛋白合成受到抑制，因此，該植物是葉綠素缺陷型的，并且是穩(wěn)定的(如本文所定義的)。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種植物，其中，質(zhì)體蛋白合成受到抑制，因此，該植物是花斑的，并且是穩(wěn)定的(如本文所定義的)。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種植物細(xì)胞系，其中，質(zhì)體蛋白合成受到抑制，因此，該植物是細(xì)胞系是葉綠素缺陷型的，并且是穩(wěn)定的(如本文所定義的)。我們所說的“穩(wěn)定”一詞的含義是，在經(jīng)過下列過程之后所述植物或植物細(xì)胞系能維持葉綠素缺陷表型(ⅰ)細(xì)胞分裂(即由質(zhì)體蛋白合成受到抑制的細(xì)胞通過有絲分裂和/或減數(shù)分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞保持葉綠素缺陷型)；和(ⅱ)消除對質(zhì)體蛋白合成的抑制。我們所說的“質(zhì)體”一詞，是指以葉綠體為代表的通常有顏色的一類植物細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器。我們所說的“葉綠素缺陷型”，是指與正常綠色植物相比，具有至少部分減弱的葉綠素含量的植物或植物細(xì)胞系。該術(shù)語還包括花斑植物，該植物包括一些具有降低的葉綠素含量的細(xì)胞和具有正常葉綠素含量的其他細(xì)胞。我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)，可將質(zhì)體蛋白合成抑制劑用于產(chǎn)生穩(wěn)定的葉綠素缺陷型和/或花斑植物和穩(wěn)定的葉綠素缺陷型植物細(xì)胞系，而無需對植物進(jìn)行遺傳學(xué)操作。應(yīng)當(dāng)對質(zhì)體蛋白合成進(jìn)行抑制，以便生成葉綠體的能力受到不可逆轉(zhuǎn)的抑制。由于本發(fā)明的方法不需要誘變，它在生產(chǎn)速度、安全性和消除能將不希望的性狀導(dǎo)入植物的基因上的不希望的突變方面具有很大優(yōu)點(diǎn)。另外，該方法不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備或分子生物學(xué)的專業(yè)知識(shí)。在質(zhì)體核糖體RNA積累和植物細(xì)胞葉綠素含量之間存在已知的相關(guān)性。還了解到，抑制質(zhì)體蛋白合成的物理和化學(xué)制劑能導(dǎo)致植物細(xì)胞積累葉綠素的能力的喪失。用所述制劑處理過的植物會(huì)變白(即從綠色變成白色)，此后，所述植物或植物細(xì)胞相繼死亡。不過，我們所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)業(yè)已意外地證實(shí)，抑制質(zhì)體蛋白合成的制劑可以產(chǎn)生遺傳學(xué)上不能操縱的和穩(wěn)定的葉綠素缺陷型和/或花斑植物和遺傳學(xué)上不可操縱的和穩(wěn)定的葉綠素缺陷型植物細(xì)胞系，該表型在合適的生長培養(yǎng)基中在體外(或在體內(nèi)，如果合適的話)得到保持。另外，所述植物和細(xì)胞不會(huì)恢復(fù)綠色表型(即使取消了用于抑制質(zhì)體蛋白合成的制劑)。光學(xué)和電子顯微鏡研究證實(shí)，用本發(fā)明方法處理的植物和植物細(xì)胞系含有較少質(zhì)體樣結(jié)構(gòu)(與成熟葉綠體相比)的比例高于正常存在于綠色植物中的比例。對穩(wěn)定的葉綠素缺陷型植物所做的分子分析表明，該植物在質(zhì)體核糖體RNA和質(zhì)體蛋白方面是缺陷型的。盡管我們不希望受任何假說的限制，但我們相信所述葉綠素缺陷型和花斑是由于完整質(zhì)體表達(dá)裝置的缺乏所致，這會(huì)妨礙植物材料重新變綠，因?yàn)闆]有該裝置，質(zhì)體基因組就不能表達(dá)。本發(fā)明的一個(gè)重要特征是，我們業(yè)已生產(chǎn)了遺傳學(xué)上無法操作的、具有穩(wěn)定表型的葉綠素缺陷型植物和細(xì)胞系。所述植物和細(xì)胞能夠繁殖而又不恢復(fù)足夠的葉綠素(“綠色”)表型，即使在取消了對質(zhì)體蛋白合成的抑制之后也是如此。所述抑制可以是化學(xué)或物理抑制，不過該抑制不應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致植物基因組(細(xì)胞核、線粒體或質(zhì)體)突變。抑制質(zhì)體蛋白合成的一種合適方法是用質(zhì)體基因表達(dá)或質(zhì)體蛋白合成的抑制劑處理所述植物或細(xì)胞系。優(yōu)選的抑制劑是能抑制質(zhì)體核糖體功能的抑制劑。最優(yōu)選的抑制劑是諸如壯觀霉素和鏈霉素的抗生素以及極端溫度。本發(fā)明的方法適于生產(chǎn)本發(fā)明第二和第三方面的多種植物，和本發(fā)明第四方面的植物細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法非常適于誘導(dǎo)高頻率(高達(dá)100％)的葉綠素缺陷型，并且，它還是相對現(xiàn)有誘變方法而言最簡單和快速的方法。另外，該方法特別適用于提供穩(wěn)定的葉綠素缺陷型和花斑擬表型的豐富的、和容易產(chǎn)生的資源。本發(fā)明可以處理很多不同類型的植物材料。所述材料可以是生長中的植物、植物細(xì)胞系、種子或能夠生長的植物材料的所有其他合適來源。如果必要，可將植物組織從處理過的植物材料中取出進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)。該組織可以是生長中的苗端、芽或來自植物的根端。所述組織可以在土壤中培養(yǎng)或體外生長。體外生長的組織，可以在合適的條件下生長，以便產(chǎn)生植株或讓所述組織生長形成植物細(xì)胞系?？梢杂帽景l(fā)明方法處理的植物類型的例子(可對所述植物進(jìn)行操作，以便產(chǎn)生本發(fā)明第二和第三方面的植物)包括十字花科(例如，歐洲油菜(Brassicanapus)、蕪菁(Brassicarapa)、甘藍(lán)(Brassicaoleracea)、Brassicanigra和擬南芥(Arabidopsisthaliana))，禾本科(例如，玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)和小麥(Triticumaestivum))，茄科(例如，番茄(Lycopersiconesculentum)和馬鈴薯(Solanumtuberosum))和菊科(例如，向日葵(Heliantusannus))。本發(fā)明第四方面的細(xì)胞系可以由所述植物產(chǎn)生。應(yīng)當(dāng)在合適的生長培養(yǎng)基中維持或繁殖所述植物材料、葉綠素缺陷型植物和葉綠素缺陷型植物細(xì)胞系。當(dāng)植物生長在土地上時(shí)，環(huán)境可以代表一種合適的培養(yǎng)基，不過可能需要補(bǔ)充植物激素、維生素和/或糖類等(因?yàn)槿狈夂献饔?。在體外繁殖的植物材料、植物和植物細(xì)胞系需要合適的生長培養(yǎng)基來維持所述細(xì)胞?？梢允褂醚a(bǔ)充了植物激素的含有MES的常規(guī)植物生長培養(yǎng)基。誘導(dǎo)葉綠素缺陷和/或花斑所需的處理方案取決于多種因素，包括(a)抑制是如何實(shí)施的；(b)在穩(wěn)定的葉綠素缺陷植物或植物細(xì)胞產(chǎn)生之前必須進(jìn)行多長時(shí)間的質(zhì)體蛋白合成；(c)所使用的任何質(zhì)體蛋白合成抑制劑的效力；(d)所使用的植物或植物細(xì)胞的類型；和(e)希望的結(jié)果(例如，花斑或全部葉綠素缺陷)?？梢酝ㄟ^改變本發(fā)明的處理方案控制葉綠素缺陷和/或花斑的程度。一般來說，產(chǎn)生花斑比誘導(dǎo)全面葉綠素缺陷需要較低的抑制劑濃度和較短的處理時(shí)間。純屬舉例性質(zhì)的，在十字花科中誘導(dǎo)葉綠素缺陷型的有效處理是將種子放在壯觀霉素中浸泡大約6-18小時(shí)(例如，浸泡1夜)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)這種處理時(shí)間足于產(chǎn)生葉綠素缺陷型幼苗，隨后可將其保存在沒有質(zhì)體蛋白合成抑制作用的生長培養(yǎng)基中，十字花科不同成員所需要的壯觀霉素的濃度不同。就此而言，對于歐洲油菜來說，2-5毫克/毫升的壯觀霉素是理想的，而對于蕪菁和甘藍(lán)來說，5-10毫克/毫升的壯觀霉素是理想的。在經(jīng)過上述處理之后，可以讓所述種子在諸如RMOP(Svab等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，8526頁)(相應(yīng)地進(jìn)行補(bǔ)充)的培養(yǎng)基中繁殖，以便產(chǎn)生具有穩(wěn)定的葉綠素缺陷型表型和未改變的遺傳學(xué)組成的植物細(xì)胞(可讓該細(xì)胞生長成植株或培育成細(xì)胞系)。進(jìn)一步舉例來說，需要對禾本科(禾谷類)進(jìn)行較長時(shí)間的質(zhì)體蛋白合成抑制，以便產(chǎn)生穩(wěn)定的葉綠素缺陷型植物和細(xì)胞。產(chǎn)生穩(wěn)定的禾本科植物和細(xì)胞的一種優(yōu)選方法是將種子放在鏈霉素中浸泡大約6-18小時(shí)(例如，浸泡1夜)，然后同樣在含有抑制濃度的鏈霉素的培養(yǎng)基中繁殖所述種子至少2天，優(yōu)選1-8周，最優(yōu)選3-5周。然后可以分離白化幼苗，并保持在不含抗生素的培養(yǎng)基中，并進(jìn)行穩(wěn)定繁殖。另一種方法是，在黑暗中在濕的濾紙上使種子發(fā)芽，然后讓其在極端溫度下在體外繁殖。該溫度沖擊進(jìn)行2-4周，能產(chǎn)生可以在體外繁殖的穩(wěn)定的白化植株。根據(jù)本發(fā)明第二、第三和第四方面的葉綠素缺陷型植物和細(xì)胞系，可以來自用本發(fā)明第一方面的方法處理過的葉綠素缺陷型植物和植物細(xì)胞系。葉綠素缺陷型細(xì)胞系還可以直接從用蛋白合成抑制劑處理過的任何植物材料獲得。這樣，我們業(yè)已生產(chǎn)了擬南芥屬的葉綠素缺陷型細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明第四方面的植物細(xì)胞系可以用標(biāo)準(zhǔn)的植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)用來自本發(fā)明第二或第三方面的植物組織培育而成。根據(jù)本發(fā)明第二、第三和第四方面的植物和植物細(xì)胞系，可用于若干方面。例如，根據(jù)本發(fā)明第三方面的花斑植物對園藝行業(yè)來說有價(jià)值，因?yàn)樗鼈兪强梢凿N售的誘人的植物。植物上的花斑通常是通過天然或人工突變產(chǎn)生的。天然突變的產(chǎn)生難于控制，而人工突變又涉及誘變方法，該方法是有害的、費(fèi)用昂貴的、并且花費(fèi)時(shí)間的。本發(fā)明第一方面的方法快捷而又不使用已知誘變劑。EP0257845披露了用不是誘變劑的葉綠素抑制劑產(chǎn)生花斑植物。不過，披露于EP0257845中的葉綠素缺陷型植物部分需要連續(xù)接觸葉綠素抑制劑，以便保持白色，因此，所述植物和植物細(xì)胞系是不穩(wěn)定的。本發(fā)明第一方面的方法需要抑制質(zhì)體蛋白合成，它使得在取消對質(zhì)體蛋白合成的抑制作用之后，葉綠素缺陷型植物和植物細(xì)胞仍然能夠穩(wěn)定繁殖。這意味著沒有必要永久的或重復(fù)的使用質(zhì)體蛋白合成抑制劑?？蓪⒏鶕?jù)本發(fā)明第四方面的新的細(xì)胞系培育成具有改變的代謝。這種細(xì)胞系特別適用于開發(fā)新的藥物。在葉綠素缺陷型植物和細(xì)胞系中，植物代謝物以改變了的含量積累。所述代謝物包括具有治療價(jià)值的生物學(xué)活性化合物。因此，本發(fā)明第一方面的方法可以快速生產(chǎn)穩(wěn)定的葉綠素缺陷型植物和細(xì)胞系，可將該植物和細(xì)胞系用于生產(chǎn)可作為治療用化合物的植物代謝物。例如，在歐洲油菜葉片中誘導(dǎo)葉綠素缺陷，會(huì)導(dǎo)致花青苷產(chǎn)量的提高。作為進(jìn)一步的例子，在藥用植物菊蒿(Tanacetumparthenium)中誘導(dǎo)葉綠素缺陷型，會(huì)導(dǎo)致該植物以高含量產(chǎn)生抗-migraineparthenolides。根據(jù)本發(fā)明第四方面的細(xì)胞系是建立體外培養(yǎng)細(xì)胞的有用來源，用于生產(chǎn)改變形式的二級代謝物，可將該代謝物直接或作為前體用作藥理學(xué)重要的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明第二、第三和第四方面的植物和細(xì)胞系還可用于植物代謝的基礎(chǔ)研究(例如，分析光合作用和脂肪酸的代謝)。根據(jù)本發(fā)明第四方面的細(xì)胞系的一個(gè)重要用途是生產(chǎn)質(zhì)體遺傳標(biāo)記，該標(biāo)記可用于體細(xì)胞雜交(細(xì)胞融合)，特別適用于雜種的一步制備，該雜種具有來自一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)性狀(由質(zhì)體和線粒體基因產(chǎn)生)和來自不同細(xì)胞的核基因。因此，體細(xì)胞雜交是一種理想方法，通過該方法，可將由細(xì)胞質(zhì)編碼的性狀，如細(xì)胞質(zhì)雄性不育性(CMS)，除草劑抗性和病毒抗性或甚至是遺傳工程的細(xì)胞器基因組(它可以包括編碼任何需要的蛋白的基因)導(dǎo)入具有特定細(xì)胞核基因組的細(xì)胞中。例如，可以讓產(chǎn)生除草劑抗性的細(xì)胞質(zhì)與來自禾谷類的具有其他有利遺傳特性的核基因(所謂良種種質(zhì))組合。還可以用上述方法通過體細(xì)胞雜交從頭產(chǎn)生諸如CMS的新的性狀。遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞器基因組僅能夠在體外具有高的再生能力的植物中產(chǎn)生。體細(xì)胞雜交使得所述工程基因組能導(dǎo)入其細(xì)胞器基因組不能進(jìn)行原位操作的作物。植物細(xì)胞的體細(xì)胞雜交的一個(gè)關(guān)鍵步驟是選擇真實(shí)的細(xì)胞質(zhì)雜種(胞質(zhì)雜種)。為了提高真實(shí)胞質(zhì)雜種的產(chǎn)量，業(yè)已提出了不同的選擇系統(tǒng)，其中，最可靠的系統(tǒng)是基于細(xì)胞質(zhì)遺傳標(biāo)記的利用。一種有利的篩選方法是使用葉綠素缺陷突變型(其中，突變是由細(xì)胞質(zhì)基因控制的)的親本種(細(xì)胞質(zhì)受體)。另一個(gè)親本(細(xì)胞質(zhì)供體)可以是來自正常綠色植物的原生質(zhì)體。在來自葉綠素缺陷突變型和細(xì)胞分裂失活的綠色親本的原生質(zhì)體融合之后，所有綠色克隆都是真實(shí)的細(xì)胞質(zhì)雜種，因?yàn)槠渚哂芯G色。為了篩選出含有受體的細(xì)胞核和來自供體的細(xì)胞質(zhì)的真實(shí)的胞質(zhì)雜種，需要對克隆進(jìn)一步的形態(tài)和染色體/倍性分析。該選擇方法的一個(gè)問題是，難于提供合適的葉綠素缺陷型受體，因?yàn)檎T導(dǎo)葉綠素缺陷型的常規(guī)方法花費(fèi)時(shí)間并且通常是不合適的。例如，不希望在具有理想的遺傳組成的細(xì)胞中導(dǎo)致突變(其目的是產(chǎn)生對體細(xì)胞雜交的選擇性)，因?yàn)檎T變劑有可能破壞有利的細(xì)胞核基因。利用本發(fā)明第四方面的葉綠素缺陷型細(xì)胞系進(jìn)行的細(xì)胞雜交，提供了一種具有理想特性的融合產(chǎn)物的改進(jìn)方法。該方法體現(xiàn)了本發(fā)明的一個(gè)重要特征，并且根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了一種生產(chǎn)融合細(xì)胞的方法，該融合細(xì)胞包括來自供體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與來自本發(fā)明第四方面的細(xì)胞或源于本發(fā)明第二或第三方面的植物的細(xì)胞的核基因組的組合。對來自供體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行選擇，以便它含有一種可遺傳的特性(如雄性不育性或除草劑抗性)，該特性能夠遺傳并能夠在融合細(xì)胞產(chǎn)物中檢測。來自供體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)最好是綠色的(即葉綠素充分)并優(yōu)選包含在葉綠體中。所述原生質(zhì)體源于所述供體細(xì)胞，并通過化學(xué)或輻射失活，以防止細(xì)胞分裂。所述原生質(zhì)體是用于與本發(fā)明第四方面的細(xì)胞融合的細(xì)胞質(zhì)的優(yōu)選來源，因?yàn)橛锌赡苓M(jìn)行一步選擇(只有綠色分裂細(xì)胞的克隆是真實(shí)的胞質(zhì)雜種)。將結(jié)合附圖以舉例形式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其中圖1是源于例1的歐洲油菜種子的植物的照片；圖2是表示在例1的歐洲油菜的黃-綠色和白化植物中改變了的質(zhì)體超微結(jié)構(gòu)的照片(線條=0.25微米)；圖3是例1中歐洲油菜和擬南芥的綠色和葉綠素缺陷型植物中蛋白的SDS-PAGE凝膠(A)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)(B)的照片；圖4是表示例1的植物細(xì)胞中質(zhì)體核糖體RNA含量的瓊脂糖凝膠的照片；圖5是表示例1的植物細(xì)胞中花青苷和葉綠素含量的吸收光譜；和圖6是例5中用壯觀霉素處理的植物的照片；和圖7是用鏈霉素處理的(A)穩(wěn)定的和(B，C)花斑禾本科植物(大麥)的照片。例1進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，其中，用壯觀霉素作為質(zhì)體蛋白合成的抑制劑，在十字花科中誘導(dǎo)葉綠素缺陷型。1．1方法1.1.1種子消毒。將種子浸泡在10％(W/V)次氯酸鈉中，并在室溫下，在罐中輕輕搖動(dòng)20分鐘。然后在無菌蒸餾水中洗滌種子5次。每次洗滌持續(xù)10分鐘。1.1.2制備生長培養(yǎng)基用不含壯觀霉素的RMOP培養(yǎng)基(Svab等，1990同上)體外生長十字花科植物，進(jìn)行某些改進(jìn)(1)添加2-[N-嗎啉代]-乙磺酸(MES)所用最終培養(yǎng)基的配方為大量-MS鹽(mg/l)微量-MS鹽(mg/l)NH4NO31650H3BO36.2KNO31900MnSO4X4H2O22.3CaCl2X2H2O440ZnSO4X4H2O8.6MgSO4X7H2O370KI0.83KH2PO4170Na2MoO4X2H2O0.25Na2-EDTA37.3CuSO4X5H2O0.025FeSO4X7H2O27.8CoCl2X6H2O0.025有機(jī)成分(mg/l)植物激素(mg/l)蔗糖30000N6-芐基腺嘌呤1肌醇1001-萘乙酸0.1胺硫素12-[N-嗎啉代]-500乙磺酸(MES)*用KOH將pH值調(diào)整到5.7，然后加入0.6％的細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(Difco)，并在120℃下對該培養(yǎng)基高壓滅菌20分鐘。1.1.3種子處理和繁殖在室溫下將消毒的歐洲油菜、蕪菁、甘藍(lán)、B.nigra和擬南芥的種子浸泡在壯觀霉素溶液(0，1，2，5和10mg/ml)中過夜，并鋪放到(不洗滌)RMOP培養(yǎng)基(見1.2.1)上。每隔3周，白色幼苗現(xiàn)出，并解剖平放在新鮮培養(yǎng)基(固化的或液體的)上。該方法可以在3-6周內(nèi)獲得葉綠素缺陷型和花斑擬表型。1．2結(jié)果1.2.1用壯觀霉素處理之后的表型改變僅用載體(0mg/ml壯觀霉素)處理的對照細(xì)胞保持綠色。誘導(dǎo)葉綠素缺陷型的最有效的壯觀霉素濃度對歐洲油菜來說為2-5mg/ml，而對蕪菁和甘藍(lán)來說為5-10mg/ml。在3-6周內(nèi)，所述植物分離成3種不同表型綠色、黃-綠色和白色(白化型)，隨后以穩(wěn)定表型繁殖。圖1表示源于歐洲油菜種子的植物的照片，其中(A)表示未處理的綠色植物，(B)用壯觀霉素處理的黃-綠色植物，和(C)用壯觀霉素處理的白化(白色)植物。表1表示在由處理過的種子體外生長的植株中，葉綠素缺陷型的程度與處理方案之間的相關(guān)性。表1<tablesid="table2"num="002"><table>甘藍(lán)1mg/ml壯觀霉素2mg/ml壯觀霉素花斑(白色和黃色部分)植株(15-20％)所有植株均為綠色花斑(白色部分)植株(5％)；5mg/ml壯觀霉素綠色植株(大約95％)花斑(白色部分)植株(10％)綠色植株(大約90％)10mg/ml壯觀霉素明顯抑制生長。白色植株(大約5％)花斑(白色部分)植株(20％)</table></tables>1.2.2壯觀霉素處理過的植物的特征(ⅰ)質(zhì)體和線粒體的超微結(jié)構(gòu)透射電子顯微術(shù)揭示(葉綠素缺陷型)植物中的質(zhì)體比綠色植物中的較小和分化程度較低(圖2)。圖2是表示黃-綠色和白化植物中質(zhì)體的改變了的超微結(jié)構(gòu)的照片(A)表示來自對照綠色植物(未處理過的)的葉綠體的正常形態(tài)(上)和超微結(jié)構(gòu)(中和下)；基粒(g)發(fā)育良好，質(zhì)體核糖體(pr)清晰可見。(B)在黃-綠色植物的質(zhì)體中觀察到電子不透明材料(eom)的聚集，而不是基粒；質(zhì)體外面的胞質(zhì)核糖體(cr)清晰可見，而在質(zhì)體基質(zhì)(m)中質(zhì)體核糖體不是清晰可見的；和(C)來自白化植物的成形不良的、未完全分化的質(zhì)體樣細(xì)胞器所具有的外部包被是無法分辨的。(ⅱ)質(zhì)體蛋白分子分析發(fā)現(xiàn)了一種質(zhì)體翻譯產(chǎn)物的缺陷型。通過SDS-PAGE分析和免疫印跡分析分析由歐洲油菜和擬南芥的綠色和葉綠素缺陷型植物表達(dá)的蛋白(見圖3)。在圖3(A)中，通過SDS-PAGE在10％(W/V)凝膠上分離考馬斯蘭染色的總的可溶性蛋白。從300毫克冷凍的組織中制備提取物，該冷凍組織在600微升緩沖液(80mMTris-HCl，pH7.5，10％(V/V)甘油，10％(W/V)SDS，0.5％(V/V)β-巰基乙醇)中勻漿，煮沸3分鐘并離心。將15微升提取物加樣到每一個(gè)泳道中(GR=綠色，AL=白化)。圖3中的箭頭表示含量最大的質(zhì)體特異蛋白的位置(核酮糖二磷酸羧化酶-氧化酶的大亞基)。在壯觀霉素處理的細(xì)胞(AL)中缺少該蛋白，這表明葉綠素缺陷型細(xì)胞中的質(zhì)體蛋白合成受到抑制。圖3(B)表示免疫印跡分析。將SDS-PAGE分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(Hybond-ECL，Amersham)上，與抗D1(由ps6A基因編碼的光合系統(tǒng)2的質(zhì)體特異蛋白)的抗體一起溫育，并通過化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)合的抗體(AmershamECLWestern印跡檢測試劑盒)。只有GR植物表達(dá)D1，而沒有抗體與AL蛋白提取物結(jié)合。這表明蛋白合成在質(zhì)體中受到特異性抑制。(ⅲ)質(zhì)體核糖體RNA通過對總RNA(3微克RNA，在2％(W/V)瓊脂糖凝膠上，在1×TBE緩沖液中分離，并通過溴化乙錠(EtBr)熒光觀察)進(jìn)行Northern印跡分析測定歐洲油菜葉綠素缺陷型植物(AL)和未處理的綠色植物(GR)中的質(zhì)體核糖體RNA(rRNA)。圖4的上半部分是表示植物細(xì)胞中質(zhì)體核糖體RNA含量的瓊脂糖凝膠的照片。該照片表明白化細(xì)胞中的總RNA只有很小的定性降低。不過，當(dāng)對RNA進(jìn)行吸印，并用pHvcP8(對葉綠體(cp)rRNA專一)檢測，該探針只能結(jié)合于來自綠色細(xì)胞的RNA上(圖4的下半部分)。這表明在壯觀霉素處理的白化細(xì)胞中缺少rRNA，因?yàn)橘|(zhì)體不能夠分化，并且質(zhì)體蛋白合成受到抑制。這表明，抑制質(zhì)體核糖體形成會(huì)導(dǎo)致質(zhì)體中所有轉(zhuǎn)錄rRNA的破壞。(ⅳ)色素含量用光譜方法或顯微技術(shù)檢測到白化歐洲油菜中的葉綠素含量低于綠色歐洲油菜植物中的含量。發(fā)現(xiàn)所述白化植物合成的花青苷明顯高于綠色植物的(圖5)。例2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中，用鏈霉素作為質(zhì)體蛋白合成的抑制劑，在禾本科植物中誘導(dǎo)葉綠素缺陷型。2．1方法按上述方法對種子進(jìn)行消毒(1.1.1)并使用生長培養(yǎng)基(1.1.2)。2.1.3種子處理和繁殖將消毒的玉米、大麥和小麥種子在室溫下在鏈霉素溶液(2和5mg/ml)中浸泡過夜，并鋪放到補(bǔ)充了500毫克/升鏈霉素的(不洗滌)RMOP培養(yǎng)基(見1.1.2)上。3-6周后將白化植物放置到不含鏈霉素的RMOP培養(yǎng)基上。在隨后的3-5周內(nèi)收集完全的葉綠素缺陷型和花斑植物。2．2結(jié)果在頭6周時(shí)間內(nèi)，大麥和小麥(用2和5mg/ml鏈霉素處理)只能以10-15％的頻率產(chǎn)生花斑植物。不過在接下來的培養(yǎng)階段(隨后的3-5周)產(chǎn)生了完全白色的植物，并從花斑植物中分離出來。可以按照2.1.3的方法用2和5mg/ml鏈霉素對玉米進(jìn)行處理。獲得了完全白化的(葉綠素缺陷型)植物。所得到的所有植物細(xì)胞在體外穩(wěn)定繁殖。例3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中，在茄科植物中誘導(dǎo)葉綠素缺陷型。用壯觀霉素處理番茄和馬鈴薯產(chǎn)生的葉綠素缺陷型植物材料可以在體外繁殖。例4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中，在菊科植物中誘導(dǎo)葉綠素缺陷型。用壯觀霉素處理向日葵產(chǎn)生的葉綠素缺陷型植物材料可以在體外繁殖。例5將壯觀霉素溶液(5-20mg/ml)涂在油菜籽油菜、椴樹、常春藤和冬青樹的頂芽上，體內(nèi)誘導(dǎo)葉綠素缺陷型。由處理的芽進(jìn)行的新的生長產(chǎn)生葉綠素缺陷型和花斑葉片。所述葉綠素缺陷型(白化表型)從處理過的植物傳遞到由該植物產(chǎn)生的幼苗上。圖6表示用壯觀霉素體內(nèi)誘導(dǎo)的穩(wěn)定的葉綠素缺陷型。用20-50微升壯觀霉素溶液(20mg/ml)滴在4周齡生長于土壤中的植物的頂芽上，使歐洲油菜成為葉綠素缺陷型。5天以后重復(fù)該過程。在1周之后在新的生長中出現(xiàn)白化，并在2周時(shí)加強(qiáng)(圖6A)。在開花期間去掉花藥，并用來自未處理過的植物的花粉對花進(jìn)行授粉。授粉的花產(chǎn)生花斑莢果(圖6B)，這種莢果能產(chǎn)生種子。種子在RMOP培養(yǎng)基上發(fā)芽，產(chǎn)生某些花斑幼苗，這些幼苗分離成黃色和白色苗(圖6C、D)。例6讓發(fā)芽的大麥種子接觸高溫或低溫能產(chǎn)生白化植株。體外繁殖白化植株產(chǎn)生穩(wěn)定的白化植物。例7用鏈霉素產(chǎn)生的大麥花斑植物在土壤中成功地生長(圖7)。結(jié)論我們所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用壯觀霉素、鏈霉素和極端溫度處理植物的任何部分都會(huì)導(dǎo)致植物組織在體外或體內(nèi)白化。這一結(jié)果與已知的文獻(xiàn)資料一致。不過，我們證實(shí)，接下來消除抗生素(通過將漂白的組織轉(zhuǎn)移到?jīng)]有抗生素的培養(yǎng)基上)會(huì)意外地導(dǎo)致生長的恢復(fù)并產(chǎn)生穩(wěn)定的(葉綠素缺陷型)根據(jù)本發(fā)明第二和第三方面的植物(完全為白色或花斑)，很容易由該植物獲得根據(jù)本發(fā)明第四方面的細(xì)胞系。上述實(shí)驗(yàn)表明，我們發(fā)現(xiàn)在對初步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大的改進(jìn)之后，可以作為生產(chǎn)葉綠素缺陷型和/或花斑植物和植物細(xì)胞系的有效方法。我們的結(jié)果表明，白色植物的頻率和花斑程度取決于抗生素的濃度和處理時(shí)間。對于十字花科植物來說，最佳結(jié)果是通過用高濃度的抗生素水溶液以較短的處理時(shí)間處理消過毒的種子，然后在不含抗生素的培養(yǎng)基上發(fā)芽并培養(yǎng)種子而獲得的。對于禾本科植物來說，最有效的方法是將在鏈霉素溶液中浸泡種子和讓處理過的種子在含有抑制濃度的鏈霉素的培養(yǎng)基上生長進(jìn)行組合。然后將白化幼苗轉(zhuǎn)移到不含抗生素的培養(yǎng)基上，并進(jìn)行穩(wěn)定的繁殖。對發(fā)芽的種子進(jìn)行熱或冷沖擊處理也能產(chǎn)生白化植物，該植物能在體外繁殖。權(quán)利要求1．一種生產(chǎn)穩(wěn)定的(如本文所定義的)葉綠素缺陷型植物和植物細(xì)胞系的方法，包括對植物材料進(jìn)行處理，抑制質(zhì)體蛋白合成，并在不進(jìn)行所述處理的條件下由處理的植物材料生長植物和/或植物細(xì)胞系。2．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述植物和/或植物細(xì)胞系生長在含有植物激素的培養(yǎng)基中。3．一種生產(chǎn)穩(wěn)定的(如本文所定義的)葉綠素缺陷型植物和植物細(xì)胞系的方法，包括對植物材料進(jìn)行處理，抑制質(zhì)體蛋白合成，并在含有植物激素的生長培養(yǎng)基中由處理過的植物材料生長植物和/或植物細(xì)胞系。4．如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中，所述對質(zhì)體蛋白合成的抑制使形成葉綠體的能力受到不可逆轉(zhuǎn)的阻斷。5．如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中，所述對質(zhì)體蛋白合成的抑制是通過質(zhì)體基因組表達(dá)或質(zhì)體蛋白合成的抑制劑實(shí)現(xiàn)的。6．如權(quán)利要求5中的方法，其中，所述抑制劑能破壞質(zhì)體核糖體的功能。7．如權(quán)利要求6中的方法，其中，所述抑制劑是壯觀霉素或鏈霉素或極端溫度。8．如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述植物材料是十字花科植物。9．如權(quán)利要求8的方法，其中，所述植物是歐洲油菜、蕪菁、甘藍(lán)、Brassicanigra或擬南芥中的一種。10．如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中，所述植物材料是禾本科植物。11．如權(quán)利要求10的方法，其中，所述植物是玉米、大麥或小麥中的一種。12．如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中，所述植物材料是茄科植物。13．如權(quán)利要求12的方法，其中，所述植物是番茄或馬鈴薯。14．如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中，所述植物材料是菊科植物。15．如權(quán)利要求14的方法，其中，所述植物是向日葵。16．一種植物，其中，質(zhì)體蛋白合成業(yè)已受到抑制，因此該植物是葉綠素缺陷型的而且是穩(wěn)定的(如本文所定義的)。17．一種植物，其中，質(zhì)體蛋白合成業(yè)已受到抑制，因此該植物是花斑的而且是穩(wěn)定的(如本文所定義的)。18．一種植物細(xì)胞系，其中，質(zhì)體蛋白合成業(yè)已受到抑制，因此該植物細(xì)胞系是葉綠素缺陷型的而且是穩(wěn)定的(如本文所定義的)。19．一種生產(chǎn)融合細(xì)胞的方法，包括將來自供體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與來自如權(quán)利要求18所述細(xì)胞的或源于如權(quán)利要求16和17所述植物的細(xì)胞的核基因組組合。全文摘要本發(fā)明提供一種生產(chǎn)穩(wěn)定的葉綠素缺陷型植物和植物細(xì)胞系的方法,包括對植物材料進(jìn)行處理,抑制質(zhì)體蛋白合成,并在不進(jìn)行所述處理的條件下由處理的植物材料生長植物和/或植物細(xì)胞系。文檔編號(hào)A01H3/00GK1279580SQ98811288公開日2001年1月10日申請日期1998年9月18日優(yōu)先權(quán)日1997年9月19日發(fā)明者A·戴,M·K·祖布科申請人:曼徹斯特維多利亞大學(xué)