專利名稱：高活性植酸酶?；锏闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植酸酶的制備和制品以及它們在制備用于動物飼料中飼料酶的?；锓矫娴膽?yīng)用。
各種酶(例如植酸酶)在動物(例如牲畜)飼料中的應(yīng)用正日益更常見。包括這些酶以便改善動物從飼料對營養(yǎng)物和礦物質(zhì)的攝取，而且還可能幫助提高消化率。它們通常是通過在由工業(yè)酶生產(chǎn)者操作的大規(guī)模發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)微生物而生產(chǎn)的。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，生成的“發(fā)酵液”通常經(jīng)歷一系列過濾步驟從而分離生物質(zhì)(微生物)與所需的酶(在溶液中)。然后該酶溶液或者以液體形式(常常在添加了各種穩(wěn)定劑之后)出售或者被加工成干制品。
酶液體和干制品在商業(yè)規(guī)模上被用于動物飼料工業(yè)。液體制劑可在飼料壓丸后被添加到飼料中以便避免壓丸過程中會發(fā)生的酶的熱滅活。
干制品通常涉及蒸汽壓丸，其中飼料在壓丸前經(jīng)受蒸汽噴射。在后續(xù)的壓丸步驟中，飼料受壓通過模型或模子，形成的條形物被切割成各種長度的合適的丸粒。在該操作中，溫度會升高到60～95℃。
植酸酶是這樣的酶(至少部分地)水解肌醇六磷酸鹽成為肌醇和無機(jī)磷酸鹽。這些酶見于麥麩、植物籽、動物腸內(nèi)，而且可通過微生物生產(chǎn)。植酸酶被摻入動物飼料，是由于它們能降解植酸酶，植酸酶能增大動物對磷和其它營養(yǎng)成分的利用率。植酸酶還可增大對鈣的消化率。
磷是有機(jī)體生長的必需元素。就牲畜來說，飼料常常增補(bǔ)了無機(jī)磷以便使單胃動物良好生長。但是反芻動物的飼料中常常不需這樣，因?yàn)榉雌c動物的瘤胃中存在的微生物產(chǎn)生能催化植酸酶向肌醇和無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化的酶。肌醇六磷酸鹽的降解經(jīng)常是需要的，因?yàn)橹菜釙遣焕跔I養(yǎng)的，由于它螯合有用的礦物質(zhì)(例如鈣、鋅、鎂和鐵)，并且還能不利地與蛋白質(zhì)反應(yīng)，于是降低動物對它們的生物利用率。植酸酶的添加還可減少需要添加的無機(jī)飼料的量，從而減少糞肥中排泄的磷，這更有益于環(huán)境。
各種植酸酶的基因已被克隆和表達(dá)了。EP-A-0,420,358(Gist-Brocades)描述了微生物植酸酶的表達(dá)。
在近期的申請EP-A-0,684,313(Hoffmann-La Roche)中，描述了編碼具有植酸酶活性的各種多苷酸的DNA序列。
EP-A-0,758,018(Gist-Brocades)涉及改善酶(尤其用作動物飼料的酶)穩(wěn)定性的方法，并且涉及植酸酶。
WO-A-94/03612(Alko)描述了用木霉菌屬(Trichoderma)生產(chǎn)植酸酶降解酶，WO-A-97/16076(Novo Nordisk)則描述了用于制備動物飼料的含酶制劑，該飼料包括各種疏水性物質(zhì)。
動物飼料體現(xiàn)了飼養(yǎng)牲畜和其它動物的最大費(fèi)用之一。此外，例如酶(諸如植酸酶)的添加劑可大為增加動物飼料的成本。本發(fā)明的一個(gè)目的是能提供生產(chǎn)成本更低的植酸酶組合物。這可通過能生產(chǎn)高活性的或高度濃縮的植酸酶組合物來實(shí)現(xiàn)。有數(shù)個(gè)因素使得本申請人能制備這些高活性組合物，下文將討論這些因素。
本申請人已注意到的能制備高活性植酸酶組合物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，這些組合物能表現(xiàn)出穩(wěn)定性的顯著增大(尤其是在制備動物飼料(丸粒)的壓丸過程中)，所以更可能比現(xiàn)有技術(shù)的組合物保持更高的隨時(shí)間的植酸酶活性。
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種制備包括植酸酶的水成液的方法，該方法包括(a)在允許重組表達(dá)植酸酶的條件下在含水培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有異源植酸酶基因的曲霉屬或木霉菌屬微生物，所述異源植酸酶基因處于葡糖淀粉酶(對于曲霉屬(Aspergillus))啟動子或纖維二糖水解酶(對于木霉菌屬)啟動子控制之下，所述培養(yǎng)基包括作為所述微生物的食物的可同化碳源和可同化氮源；(b)過濾所述含水培養(yǎng)基以除去微生物而得含水濾液；以及(c)將得自(b)的濾液進(jìn)行超濾處理而得植酸酶濃度至少為14,000FTU/g的水成液。
已發(fā)現(xiàn)該方法在生成的含水組合物中提供特別高濃度的植酸酶。這已能制備也是高活性水平的其它植酸酶組合物。它表明，不但該方法成本更低(每單位酶活性)，而且發(fā)現(xiàn)了更濃的含植酸酶組合物比它們的濃度更小的對應(yīng)物穩(wěn)定得多。
所述微生物優(yōu)選是這些菌種，即黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或Trichoderma reesei。就曲霉屬生物體來說，植酸酶基因合適地處于葡糖淀粉酶(或淀粉葡糖苷酶，AG)啟動子的控制之下。就木霉菌屬生物體來說，優(yōu)選應(yīng)用纖維二糖水解酶啟動子。
可同化的碳源可以包括葡萄糖和/或麥芽糖糊精，和/或可同化的氮源可以包括銨離子。葡萄糖和銨離子可以是所述含水培養(yǎng)基中僅有的可同化的碳源或氮源。也就是說，預(yù)期未應(yīng)用復(fù)合的碳源或氮源。銨離子可以以氨或銨鹽形式提供。優(yōu)選的銨鹽包括硝酸銨、硫酸銨和磷酸銨。
優(yōu)選地，所述碳源和/或氮源是在發(fā)酵過程中被供給培養(yǎng)基的。任一種營養(yǎng)源的供料速度可以與微生物消化它的速度大致相同。所以碳源和/或氮源可以按持續(xù)或連續(xù)方式提供。碳源和氮源可以獨(dú)立地提供，或者從同一來源提供。
形成的水成液可能具有至少16,000FTU/g的植酸酶濃度，也可能甚至有18,000FTU/g或更高。
通過在這些條件下應(yīng)用這些特定的生物體，所述濾液將會是較濃的。這就使它能經(jīng)歷超濾作用。在一些現(xiàn)有技術(shù)方法中，形成的濾液含太多的殘?jiān)推渌镔|(zhì)而使它不能經(jīng)歷超濾作用(濾器阻塞)。然而，在本發(fā)明的方法中，濾液較為“清亮”，它使濾液能經(jīng)歷超濾作用而不需任何進(jìn)一步的處理，并且通過超濾作用，可因此得到特別高濃度的含水組合物。
現(xiàn)有技術(shù)方法討論了所述濾液或含水組合物經(jīng)歷結(jié)晶步驟和/或脫色步驟(例如活性炭過濾)的可能性。但是，這些另外的步驟(它們會增大生產(chǎn)植酸酶的費(fèi)用)都可在本發(fā)明中省去。
優(yōu)選地，所述微生物不具有或者至少不表達(dá)葡糖淀粉酶基因。這就表明，所述微生物能為植酸酶的生產(chǎn)貢獻(xiàn)更多的能量。
所述微生物可能具有多拷貝的植酸酶基因。已發(fā)現(xiàn)這可增大植酸酶的產(chǎn)量，因?yàn)橛懈嗟闹菜崦富虮槐磉_(dá)。
該含水組合物可能基本上不含高淀粉酶。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的是(基本上)全部碳源和/或氮源在進(jìn)行(b)中的過濾之前已被微生物消耗了。這可通過在最后一次供應(yīng)碳源和/或氮源后繼續(xù)發(fā)酵一段時(shí)間來實(shí)現(xiàn)。也可在添加了全部碳源和/或氮源后繼續(xù)發(fā)酵。我們會明白，這樣做的好處在于，該含水組合物就可能(基本上)不含碳源和/或氮源(例如葡萄糖和/或銨離子)。又一次地，這樣可以促成更清亮的水成液，它可能含更少的副產(chǎn)物。通過減少副產(chǎn)物的量，我們就可以將能應(yīng)用該水成液或者能獲得所需的高植酸酶活性所要求的加工步驟數(shù)減至最少。
最優(yōu)選的生物體是黑曲霉。還優(yōu)選的是，所述植酸酶是在具有葡糖淀粉酶信號序列的微生物中被表達(dá)的。
于是，形成的含植酸酶的水成液就可被用于各種用途，不過它在動物飼料中的應(yīng)用在這里是特別期望的。本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及該水成液(例如可通過第一個(gè)方面的方法制備)，它包括濃度至少是14,000FTU/g的植酸酶。
在本說明書中，“植酸酶”不僅指天然植酸酶，還指具有植酸酶活性[例如能催化涉及從肌醇磷酸鹽脫除或釋放無機(jī)亞磷(磷酸鹽)的反應(yīng)]的任意酶。優(yōu)選地，該植酸酶應(yīng)屬于EC3.1.3.8類。該植酸酶本身優(yōu)選是真菌植酸酶，例如得自曲霉屬或木霉菌屬菌種的植酸酶。
本發(fā)明還能提供制備呈粒化物形式的植酸酶制劑(它應(yīng)用食用碳水化合物聚合物作載體)的方法。所述載體可以呈粒化物或粉末形式。所述含植酸酶的水成液(例如溶液或漿狀物)能與固體載體混合并能被吸附在載體上。在混合過程中或混合后，所述含植酸酶的液體和載體被加工成?；?，該粒化物接著就可被干燥。碳水化合物載體的應(yīng)用使得能吸附大量的組合物(因而吸附大量的植酸酶)。所述混合物可被用于形成能被容易地加工成粒子(例如它可被擠壓)的彈性膏或非彈性糊狀體。合適的載體是非纖維物質(zhì)，它使得更容易造粒纖維物質(zhì)能阻止通過擠出造粒。
一些現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)涉及含各種酶的丸粒，但這些丸粒通常在洗滌組合物中被用作洗滌劑。反之，本申請是用于動物飼料，為此，本發(fā)明的?；锸?動物)可食用的并且優(yōu)選還是可消化的。因此，毫不意外，本發(fā)明的?；?、粒子和組合物不含皂、去污劑和漂白劑或漂白化合物、沸石、粘結(jié)劑、填料(TiO2、高嶺土、硅酸鹽、滑石粉等)，僅舉幾種為例。
應(yīng)選擇食用碳水化合物聚合物，這樣它可被動物食用(就它來說，飼料是所期望的)并且優(yōu)選還是可消化的。該聚合物優(yōu)選包括葡萄糖(例如含葡萄糖的聚合物)，或(C6H10O5)n單元。優(yōu)選地，所述碳水化合物聚合物包括α-D-吡喃葡萄糖單元、直鏈淀粉(線型(1→4)α-D-葡聚糖聚合物)和/或支鏈淀粉(具有α-D-(1→4)鍵和α-D-(→6)鍵的支化D-葡聚糖)。淀粉是優(yōu)選的碳水化合物聚合物?？捎脕泶娴矸刍蛘叱矸壑獾钠渌线m的含葡萄糖聚合物包括α-葡聚糖、β-葡聚糖、果膠(例如原果膠)和糖原。這些碳水化合物聚合物的衍生物(例如它們的醚和/或酯)也是預(yù)期的，不過糊化淀粉常避免應(yīng)用。合適的碳水化合物聚合物是水不溶性的。
在本文描述的實(shí)施例中，應(yīng)用了玉米淀粉、馬鈴薯淀粉和大米淀粉。不過，同樣可應(yīng)用得自其它(例如植物，諸如蔬菜或作物)來源的淀粉，其它來源例如木薯、小麥、玉米、西米、黑麥、燕麥、大麥、甘薯、高粱或竹芋。類似地，在本發(fā)明中可應(yīng)用天然淀粉或改性淀粉(例如糊精)。優(yōu)選地，所述碳水化合物(例如淀粉)含少量或者不含蛋白質(zhì)，例如少于5％(w/w)，諸如少于2％(w/w)，優(yōu)選少于1％(w/w)。
所述固體載體的至少15％(w/w)可能包括碳水化合物聚合物(例如淀粉)。不過，優(yōu)選地，所述固體載體的至少30％(w/w)包括碳水化合物，最宜至少40％(w/w)。有利的是，所述固體載體的主要組分是碳水化合物(例如淀粉)，例如多于50％(w/w)，優(yōu)選至少60％(w/w)，合適地至少70％(w/w)，并且最宜至少80％(w/w)。這些重量百分?jǐn)?shù)都基于最終的干?；镏蟹敲附M分的總重量。
可被吸附在載體上的含植酸酶液體的量通常受可被吸附的水量限制。就天然粒狀淀粉來說，該量可在25～30％(w/w)之間變動，未應(yīng)用高溫(否則會引起淀粉溶脹)。在實(shí)施時(shí)，添加到碳水化合物中的酶液體百分?jǐn)?shù)通常比該范圍大得多，因?yàn)楹敢后w通常含有較大量的固體。植酸酶溶液可能含有約25％(w/w)的固體，正因?yàn)槿绱耍妓衔?例如淀粉)和植酸酶溶液可以在碳水化合物植酸酶溶液＝0.5∶1～2∶1(例如1.2∶1～1.6∶1)的比率下混合，例如分別以約60％(w/w)∶40％(w/w)的比率。優(yōu)選地，添加到固體載體中的液體量應(yīng)使所述(含水)液體中的(基本上)全部水被固體載體中存在的碳水化合物吸附。
在高溫下，淀粉和其它碳水化合物聚合物在溶脹時(shí)能吸附大得多的量的水。為此，希望碳水化合物聚合物能吸附水(或含酶的水成液)。例如，玉米淀粉在60℃下能吸附其重量的三倍的水，在70℃下達(dá)十倍。所以，本發(fā)明期望應(yīng)用更高的溫度以便吸附更大量的含酶液體，尤其當(dāng)涉及熱穩(wěn)定的植酸酶時(shí)確實(shí)是優(yōu)選的。因此對這些酶來說，固體載體和液體的混合可在高溫(例如高于室溫)下進(jìn)行，例如高于30℃，優(yōu)選地高于40℃，最宜高于50℃。備選地，或者另外，所述液體可在該溫度下提供。
但是，一般說來，優(yōu)選在更低溫度(例如室溫)下的非溶脹條件，從而將由于在更高溫度下(熱敏感性的)植酸酶的不穩(wěn)定性所引起的活性損失減至最小。在所述酶與所述液體的混合過程中合適的溫度是20～25℃。
用于本發(fā)明中將含植酸酶的液體和固體載體的混合物制成粒子(換句話說是造粒)的機(jī)械加工可采用食品、飼料和酶制劑加工中常用的已知技術(shù)。這可包括膨脹、擠出、球化處理、壓丸、高剪切?；?、轉(zhuǎn)鼓粒化、流化床團(tuán)聚或其組合。這些方法通常的特征在于機(jī)械能的輸入，例如螺桿的驅(qū)動，混合機(jī)構(gòu)的轉(zhuǎn)動，壓丸裝置滾動機(jī)構(gòu)的壓力，通過流化床團(tuán)聚機(jī)的轉(zhuǎn)動底板使粒子的運(yùn)動或者通過氣流使粒子的運(yùn)動，或者其組合。這些方法能使固體載體(例如呈粉末形式)與含植酸酶的液體(水溶液或漿狀物)混合，隨后就被粒化。
然而在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，?；?例如團(tuán)聚物)是通過將含植酸酶的液體噴到或涂到載體上(例如在流化床團(tuán)聚機(jī)中)而形成的。這里，形成的粒子可能包括團(tuán)聚物(例如可在流化床團(tuán)聚機(jī)中生產(chǎn))。
優(yōu)選地，含植酸酶液體和固體載體的混合另外還包括混合物的捏和。這可改善混合物的塑性從而便于?；?例如擠出)。
如果粒化物是通過擠出形成的，則擠出優(yōu)選在低壓下進(jìn)行。這樣做的優(yōu)點(diǎn)在于，被擠出時(shí)混合物的溫度將不會升高或者只是稍微升高。低壓擠出包括例如在Fuji Paudal籃式擠出機(jī)或拱頂形擠出機(jī)中的擠出。優(yōu)選地，擠出不導(dǎo)致被擠出物料的溫度升高到高于40℃。擠出可以自然地產(chǎn)生粒子(該粒子可能在通過模子后脫落)或者可采用切割機(jī)。
合適地，粒子將具有30～40％(例如33～37％)的水含量。酶含量適當(dāng)?shù)厥?～10％，例如5～9％。
得到的粒子可經(jīng)歷修整(例如球化處理)，例如在球化機(jī)(如MARUMERISENTM機(jī))中和/或壓實(shí)。粒子可在干燥前被球化處理，因?yàn)檫@樣可減少最終粒化物中粉塵的形成和/或可以便于?；锏娜魏瓮糠蟆?br> 然后就可以干燥(例如在流化床干燥機(jī)中)該粒子，或者在流化床團(tuán)聚的情況下，可被直接干燥(在團(tuán)聚機(jī)中)而獲得(干固體)粒化物。技術(shù)人員可應(yīng)用食品、飼料或酶工業(yè)中干燥粒子的其它已知方法。合適地，該?；锸强闪鲃拥?。
干燥優(yōu)選在25～60℃(例如30～50℃)的溫度下進(jìn)行。這里的干燥可能持續(xù)10分鐘至數(shù)小時(shí)(例如15～30分鐘)。所需時(shí)間的長度當(dāng)然將取決于待干燥的粒子量，但總體原則是每kg粒子1～2秒。
當(dāng)粒子干燥后，形成粒化物優(yōu)選具有3～10％(例如5～9％)的水含量。
可以給該粒化物涂上一層涂層而給出另外的(例如有利的)特性或性能，例如低粉塵含量、顏色、保護(hù)酶以防受周圍環(huán)境的影響、一種粒化物中不同的酶活性或其組合。該粒子可被涂上脂肪、蠟、聚合物、鹽、軟膏和/或油膏或者含(第二種)酶的涂層(例如液體)或其組合。應(yīng)明白，如果需要的話，可以涂布數(shù)層(不同的)涂層。要在?；锿可贤繉?，可利用一些已知的方法，包括流化床、高剪切制粒機(jī)、混合制粒機(jī)或諾塔混合器的應(yīng)用。
在其它實(shí)施方案中，可將另外的組分摻入該粒化物(例如作為加工助劑)，為的是進(jìn)一步改善粒化物的壓丸穩(wěn)定性和/或貯存穩(wěn)定性。下面討論一些這類優(yōu)選的添加劑。
鹽可被包括于該?；镏?，(例如含于所述固體載體或液體中)。優(yōu)選地可添加無機(jī)鹽(如EP-A-0,758,018中建議的那樣)，無機(jī)鹽可以改善干植酸酶制劑的加工性和貯存穩(wěn)定性。優(yōu)選的無機(jī)鹽包括二價(jià)陽離子，例如鋅、鎂和鈣。硫酸根是最優(yōu)選的陰離子。
優(yōu)選地可添加無機(jī)鹽(如EP-A-0,758,018中建議的那樣)，無機(jī)鹽可以改善干酶制劑的加工性和貯存穩(wěn)定性。優(yōu)選的無機(jī)鹽是水溶性的。它們可以包括二價(jià)陽離子，例如鋅(尤其優(yōu)選)、鎂和鈣。硫酸根是最優(yōu)選的陰離子，不過導(dǎo)致水溶性的其它陰離子也可應(yīng)用。該鹽可以呈固體形式添加(例如添加到混合物中)。不過，該鹽可以在與固體載體混合之前被溶于水或含酶的液體中。合適地，該鹽被提供的量至少是15％(w/w，基于酶)，例如至少是30％。但是，它可能高達(dá)至少60％或者甚至70％(也是w/w，基于酶)。這些量可應(yīng)用于所述粒子或?；?。因而，所述?；锟赡馨ㄉ儆?2％(w/w)的鹽，例如2.5～7.5％，諸如4～6％。
如果該鹽在水中提供，那么它的量可能是5～30％(w/w)，例如，15～25％。
壓丸穩(wěn)定性的進(jìn)一步改善可通過摻入疏水性的膠凝化合物或緩慢溶解(例如在水中)化合物而達(dá)到。這些化合物可被提供的量為1～10wt％，例如2～8wt％，優(yōu)選是4～6wt％(基于水和固體載體組分的重量)。合適的物質(zhì)包括衍生化纖維素，例如HPMC(羥丙基甲基纖維素)、CMC(羧甲基纖維素)、HEC(羥乙基纖維素)；聚乙烯醇(PVA)；和/或食用油。食用油(例如豆油或低芥酸菜子油)可作為加工助劑被添加(例如添加到待粒化的混合物中)，不過，一般說來，疏水性物質(zhì)(例如棕櫚油)優(yōu)選不存在。
優(yōu)選地，該粒子具有較窄的尺寸分布(例如它們是單分散性的)。這可促進(jìn)植酸酶在粒子中和/或酶粒化物在動物飼料中的均勻分布。本發(fā)明的方法傾向于生產(chǎn)窄尺寸分布的粒化物。但是，如果必要的話，在該方法中可包括一個(gè)另外的步驟而進(jìn)一步使所述粒子的尺寸分布變窄，例如篩分。所述?；锏某叽绶植己线m地在100μm～2000μm之間，優(yōu)選在200μm～1800μm之間，最宜在300μm～1600μm之間。所述粒子可以具有不規(guī)則的(但優(yōu)選是規(guī)則的)形狀，例如接近球形。
在動物飼料(它包括寵物食物)中可以包括其它合適的酶。這些酶的功能通常是改善飼料轉(zhuǎn)化率，例如通過減小某些飼料化合物的粘度或者通過減小其抗?fàn)I養(yǎng)效果。還可以將飼料酶例如用于減少糞肥中有害于環(huán)境的化合物的量。為了這些目的優(yōu)選的酶是糖酶，例如淀粉分解酶和植物細(xì)胞壁降解酶，它們包括纖維素酶，例如β-葡聚糖酶，半纖維素，例如木聚糖酶，或半乳聚糖酶；肽酶，半乳糖苷酶，果膠酶，酯酶；蛋白酶，優(yōu)選具有中性和/或酸性最適pH；以及脂肪酶，優(yōu)選是磷脂酶，例如哺乳動物胰磷脂酶A2。優(yōu)選地，該酶不包括淀粉降解酶(例如淀粉酶)。在一些實(shí)施方案中可能排除蛋白酶，因?yàn)槿绻脑掃@些酶可能引起不良影響。如果該酶是植物細(xì)胞壁降解酶，(例如纖維素酶)，并且尤其是半纖維素(例如木聚糖酶)，那么最終的?；锟赡芫哂械拿富钚苑秶?,000～10,000EXU/g，優(yōu)選是5,000～80,000EXU/g，最宜是8,000～70,000EXU/g。如果該酶是纖維素酶，例如β-葡聚糖酶，那么最終的?；锟赡芫哂械拿富钚允?00～15,000BGU/g，優(yōu)選是1,000～10,000BGU/g，最宜是1,500～7,000BGU/g。
所述粒子可能包括5～20％(例如7～15％)的酶。該酶可以是天然酶或重組體。
因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括a.將含植酸酶的水成液和包括至少15％(w/w)食用碳水化合物聚合物的固體載體混合，例如將該固體載體與含酶的水成液混合；b.任選捏和形成的混合物；c.?；?例如通過機(jī)械加工)該混合物以便獲得含酶粒子，例如通過應(yīng)用制粒機(jī)或者通過擠出；d.任選將該粒子團(tuán)成球狀；e.干燥形成的粒子而得含酶粒化物。
在全過程中，應(yīng)注意將酶接觸的最高溫度保持在80℃以下。
本發(fā)明的?；镞m用于制備動物飼料。在其最寬范圍，本發(fā)明的該方面覆蓋的?；锇ㄖ菜崦负褪秤锰妓衔锞酆衔?，該?；锏幕钚灾辽偈?,000FTU/g。在這些方法中，將粒化物與飼料物質(zhì)混合，或者就這樣混合，或者作為預(yù)混合物的部分。本發(fā)明?；锏奶卣魇顾鼈儽挥米骰旌衔锏慕M分，該混合物很適合作為動物飼料，尤其是如果該混合物被蒸汽處理后接著被壓丸。在這樣的丸粒中可見到或者可辨認(rèn)出所述干粒子。
于是，本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及制備動物飼料、或者動物飼料的預(yù)混合物或前體的方法，該方法包括將第二個(gè)方面的組合物與一種或多種動物飼料物質(zhì)(例如顆粒)或組分混合。然后就可以對該混合物滅菌(例如進(jìn)行熱處理)。再將形成的組合物適當(dāng)?shù)丶庸こ赏枇！?br> 本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及包括第二個(gè)方面的?；锏慕M合物，它優(yōu)選是食用飼料組合物(例如動物飼料)。該組合物優(yōu)選呈丸粒的形式(可以是每顆丸有1～5顆(例如2～4顆)干粒子)。
適當(dāng)?shù)兀摻M合物包括0.05～2.0FTU/g，例如0.3～1.0FTU/g，最宜0.4～0.6FTU/g的植酸酶。可能存在0.5～50(例如1～40)EXU/g的木聚糖酶。備選地，或者另外還可能存在09.1～1.0(例如0.2～0.4)BGU/g的纖維素酶。
該組合物可能具有10～20％(例如12～15％)的水含量。酶的量合適地是0.0005～0.0012％，例如至少5ppm。
本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及促進(jìn)動物生長的方法，該方法包括用包括第二個(gè)方面的組合物或第四個(gè)方面的組合物的食物喂養(yǎng)動物。這里，動物食物可能包括所述?；锉旧恚虼嬖谟陲暳现械牧；铩?br> 本發(fā)明的第六個(gè)方面涉及組合物在動物飼料中的應(yīng)用或作為動物飼料的組分的應(yīng)用，或者在動物食物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第七個(gè)方面還涉及一種組合物的應(yīng)用，該組合物包括至少15％(w/w)作為植酸酶的載體從而改善植酸酶的壓丸穩(wěn)定性的食用碳水化合物聚合物。
合適的動物包括農(nóng)畜(豬、家禽、牲畜)、非反芻動物或單胃動物(豬、野禽、家禽、海洋動物(例如魚))，反芻動物(?；蜓颍缒膛?、綿羊、山羊、鹿、牛犢、羔羊)。家禽包括雛雞、母雞和火雞。
本發(fā)明一個(gè)方面的優(yōu)選的特征和特性同樣適合已作必要修正的另一方面。
給出如下實(shí)施例僅僅是為了闡述本發(fā)明，不打算作為或者不能被認(rèn)為是限制性的。
實(shí)施例實(shí)施例1黑曲霉CBS513.88的發(fā)酵黑曲霉真菌孢子制劑是按標(biāo)準(zhǔn)方法制備的。
將孢子和隨后的細(xì)胞通過一系列在錐形瓶中的分批發(fā)酵轉(zhuǎn)到一個(gè)10升的發(fā)酵罐中。在分批培養(yǎng)中生長后，將該發(fā)酵罐中的內(nèi)含物用作最終的500升分批發(fā)酵的接種物。
應(yīng)用的培養(yǎng)基含有91g/l玉米淀粉(BDH Chemicals)，銨38g/l一水合葡萄糖；0.6g/l MgSO4·7H2O；0.6g/l KCl；0.2g/l FeSO4·7H2O和12g/l KNO3。通過用4N NaOH或4N H2SO4自動滴定將pH保持在4.6±0.3。
在28℃下在自動控制的溶解氧濃度為25％的空氣飽和下使細(xì)胞生長。發(fā)酵10天后，植酸酶產(chǎn)量達(dá)到5～10U/ml的最大值。
應(yīng)用硫酸銨代替玉米淀粉(給出相當(dāng)?shù)目赏?重復(fù)發(fā)酵。實(shí)施例2植酸酶的純化和表征植酸酶活性分析將100μl發(fā)酵濾液(如果必要的話就稀釋)或上清液或者100μl軟化水(demiwater，作為參比)加到具有如下成分的培養(yǎng)混合物中-0.25M乙酸鈉緩沖液(pH5.5)，或-甘氨酸HCl緩沖液，pH2.5；-1mM植酸，鈉鹽-軟化水補(bǔ)加到900μl將形成的混合物在37℃下培養(yǎng)30分鐘。通過添加1ml 10％TCA(三氯乙酸)停止反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)終止后，添加2ml試劑[3.66g FeSO4·7H2O于50ml鉬酸銨溶液(2.5g(NH4)6Mo7O24·4H2O和8ml H2SO4，用軟化水稀釋到250ml)中]。
用分光光度法在750nm處測定藍(lán)色光強(qiáng)度。測量結(jié)果指示(相對于0～1mMol/l的范圍內(nèi)磷酸鹽校正曲線)釋放的磷酸鹽量。實(shí)施例3A.植酸酶在用表達(dá)載體(含有被融合入黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AG)基因的啟動子和/或信號序列的無花果曲霉(A.Ficuum)植酸酶基因)轉(zhuǎn)化了的黑曲霉CBS 513.86中的表達(dá)為了達(dá)到在黑曲霉中超量表達(dá)植酸酶，衍生了一種表達(dá)盒，其中無花果曲霉植酸酶基因處于黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AG)啟動子與信號序列的聯(lián)合控制之下。為了更長的前導(dǎo)序列，將所述AG啟動子序列融合入包括植酸酶前導(dǎo)序列(該植酸酶前導(dǎo)序列被融合入編碼成熟蛋白的植酸酶基因片段)的植酸酶編碼序列(見EP-A-0,420,358的參考實(shí)施例10)。B.植酸酶基因在黑曲霉中在AG啟動子控制下的表達(dá)通過已知方法(例如見EP-A-0,420,358的實(shí)施例9)用10μg DNA片段轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株CBS 513.88(在1988年10月10日保藏的)。分離得自每個(gè)表達(dá)盒的單一黑曲霉轉(zhuǎn)化體，在選擇性乙酰胺-瓊脂板上劃線培養(yǎng)孢子。從在37℃下于0.4％馬鈴薯-葡萄糖(Oxoid，England)瓊脂板上生長了3天的細(xì)胞收集每個(gè)轉(zhuǎn)化體的孢子。于搖瓶內(nèi)在下列條件下測定植酸酶產(chǎn)量將大約1×108個(gè)孢子接種入100ml含下列物質(zhì)(每升)的預(yù)培養(yǎng)基1g KH2PO4；30g麥芽糖；5g酵母提取物；10g酪蛋白水解物；0.5gMgSO4·7H2O和3g Tween 80。將pH調(diào)節(jié)到5.5。
在34℃的旋轉(zhuǎn)式搖床中生長一夜后，將1ml生長培養(yǎng)物接種入100ml含下列物質(zhì)(每升)的主培養(yǎng)基2g KH2PO4；70g麥芽糊精(maldex MDO3Amylum)；12.5酵母提取物；25g酪蛋白水解物；2g K2SO4；5gMgSO4·7H2O；0.03g ZnCl2；0.02g CaCl2；0.05 MnSO4·4H2O和FeSO4。將pH調(diào)節(jié)到5.6。
菌絲體生長至少140小時(shí)。植酸酶產(chǎn)量是按實(shí)施例2中描述的方法測定的。應(yīng)用等量的葡萄糖和硫酸銨作為碳源和氮源重復(fù)發(fā)酵。將發(fā)酵液過濾而給出濾液，將它與生物質(zhì)分離。應(yīng)用表達(dá)盒PFYT3(AG-啟動子/植酸酶前導(dǎo)序列)得280U/ml的最大植酸酶活性。實(shí)施例4從濾液純化植酸酶按下列方法純化而獲得高度純化的植酸酶1.在pH4.9時(shí)陽離子交換層析2.在pH3.8時(shí)陽離子交換層析3.在pH6.3時(shí)陰離子交換層析4.超濾1.用水將所述植酸酶濾液稀釋20倍并將pH調(diào)節(jié)到4.9。讓該物料通過用20mM檸檬酸/NaOH(pH4.9)緩沖液平衡的S Sepharose快速流動柱。收集含植酸酶的未結(jié)合的物料并用于下一步。2.將pH4.9的物料調(diào)節(jié)到pH3.8，植酸酶被結(jié)合在用2mM檸檬酸/NaOH(pH3.8)緩沖液平衡的S Sepharose快速流動柱上。用20mMNaPO4、50mM NaCl(pH7.6)緩沖液從柱上洗脫植酸酶。3.將從第二個(gè)陽離子交換步驟匯集的植酸酶級分pH調(diào)節(jié)到6.3，使植酸酶結(jié)合在用10mM KPO4(pH6.3)緩沖液平衡的Q Sepharose快速流動柱上。應(yīng)用在相同的緩沖液中至1M NaCl的梯度洗脫植酸酶。
應(yīng)用具有Kalle E35膜的Amicon Stirred Cell(2L組件)通過在3巴下超濾將最后(陰離子交換的)含10mg蛋白質(zhì)/ml的產(chǎn)物濃縮十倍。
純化后的植酸酶的最終濃度達(dá)280～300g/l(28～30％)。比活性為100FTU/mg蛋白質(zhì)，這導(dǎo)致植酸酶活性為28,000～30,000FTU/g。實(shí)施例5高活性植酸酶穩(wěn)定性試驗(yàn)為了闡明更高的酶濃度(在應(yīng)用高活性植酸酶液體制備的粒子中)給出更高的壓丸穩(wěn)定性，制備了具有高酶濃度的?；锊y試了這些樣品的壓丸穩(wěn)定性。
對比樣品A通過混合、捏和、擠出、球化處理和干燥制備基于玉米淀粉的低活性酶?；?。
通過將73％(w/w)玉米淀粉和低濃度4％(w/w)植酸酶超濾液和23％(w/w)水混合和捏和制備了一種混合物。應(yīng)用Nica E-220籃式擠出機(jī)擠出該混合物而得濕擠出物，將它在Fuji Paudal MarumeriseTM中球化處理2分鐘得到平均直徑為600μm的圓粒子。隨后將這些粒子在Glatt GPCG 1.1流化床干燥機(jī)中干燥。該?；锏淖罱K活性是610FTU/g。對比樣品B通過混合、捏和、擠出、球化處理和干燥制備基于玉米淀粉的中等活性酶?；?。
通過將70％(w/w)玉米淀粉和17％(w/w)植酸酶超濾液和13％(w/w)水混合和捏和制備了一種混合物。應(yīng)用Nica E-220籃式擠出機(jī)擠出該混合物而得濕擠出物，將它在Fuji Paudal Marumeriser中球化處理2分鐘得到平均直徑為600μm的圓粒子。隨后將這些粒子在GlattGPCG 1.1流化床干燥機(jī)中干燥。該?；锏淖罱K活性是4170FTU/g。樣品C通過混合、捏和、擠出、球化處理和干燥制備基于玉米淀粉的高活性酶?；?。
通過將67％(w/w)玉米淀粉和30％(w/w)實(shí)施例4中制備的植酸酶超濾液(但被稀釋到18,400FTU/g)和3％(w/w)水混合和捏和制備了一種混合物。應(yīng)用Nica E-220籃式擠出機(jī)擠出該混合物而得濕擠出物，將它在Fuji Paudal Marumeriser中球化處理2分鐘得平均直徑為600μm的圓粒子。隨后將這些粒子在Glatt GPCG 1.1流化床干燥機(jī)中干燥。該?；锏淖罱K活性是6830FTU/g。壓丸穩(wěn)定性的比較然后將所述不同的酶?；镏糜趬和柙囼?yàn)中比較它們的壓丸穩(wěn)定性。壓丸試驗(yàn)包括將所述酶?；锱c飼料預(yù)混合物分別在1500、320和200ppm下混合。通過蒸汽噴射預(yù)處理這些混合物使溫度升到75℃，接著在壓丸機(jī)中將這些混合物壓丸得到溫度為82℃的飼料丸粒，隨后將它們干燥。這種方法是飼料工業(yè)獲得飼料丸粒的常用方法。
表1歸納了壓丸試驗(yàn)的結(jié)果。顯然，具有最高酶濃度的兩種粒子具有高得多的壓丸穩(wěn)定性。
表1壓丸試驗(yàn)的結(jié)果
實(shí)施例6通?；旌?、捏和、壓丸和干燥制備含豆油和MgSO4添加劑的基于馬鈴薯淀粉的酶粒化物在一個(gè)混合器/捏和機(jī)中添加30kg馬鈴薯淀粉并混入2.5kg豆油。接著添加含MgSO4·7H2O(3.5kg MgSO4·7H2O溶于14kg超濾液)的得自曲霉屬的植酸酶超濾液(16,840 FTU/g)。在捏和機(jī)中充分混合該產(chǎn)物，然后如實(shí)施例1中那樣擠出并在流化床干燥機(jī)中干燥。這產(chǎn)生5870FTU/g的產(chǎn)物。實(shí)施例7通過混合、捏和、擠出、球化處理和干燥制備基于大米淀粉的酶?；锿ㄟ^將62％(w/w)大米淀粉和38％(w/w)實(shí)施例6中應(yīng)用的相同植酸酶超濾液混合和捏和制備了一種混合物。應(yīng)用Fuji Paudal籃式擠出機(jī)擠出該混合物而得濕擠出物，再將它在MARUMERISERTM中球化處理一分鐘得平均直徑為785μm的圓粒子。隨后如實(shí)施例1中那樣在流化床干燥機(jī)中干燥這些粒子。該粒化物的最終活性是7280FTU/g。實(shí)施例8通過混合、捏合、擠出、球化處理和干燥制備基于玉米淀粉的含HPMC添加劑的酶粒化物通過將54％(w/w)玉米淀粉、5％HPMC(羥丙基甲基纖維素)和41％(w/w)實(shí)施例6中應(yīng)用的植酸酶超濾液的混合物捏和獲得了一種酶制品。應(yīng)用Fuji Paudal籃式擠出機(jī)擠出該混合物而得濕擠出物，將它在MARUMERISERTM中球化處理一分鐘得平均直徑為780μm的圓粒子。隨后在流化床干燥機(jī)中于40℃床溫和75℃入口溫度下將這些粒子干燥20分鐘。這樣獲得的干酶?；锘钚詾?470FTU/g。實(shí)施例9通過混合、捏和、擠出、球化處理和干燥制備含HEC添加劑、基于玉米淀粉的酶?；锿ㄟ^將54％(w/w)玉米淀粉、5％(w/w)HEC(羥乙基纖維素)與41％(w/w)實(shí)施例6中應(yīng)用的相同的植酸酶超濾液混合和捏和獲得了一種酶制品。應(yīng)用Fuji Paudal籃式擠出機(jī)擠出該混合物而得濕擠出物，將它在MARUMERISERTM中球化處理一分鐘得平均直徑為780μm的圓粒子。隨后在流化床干燥機(jī)中于40℃床溫和75℃入口溫度下將這些粒子干燥20分鐘。這樣獲得的干酶粒化物活性為8410FTU/g。實(shí)施例10應(yīng)用了得自實(shí)施例4的超濾液的18,000FTU/g的超濾液，并稀釋了。樣品配制的三個(gè)樣品的活性是610FTU/g(A，對比樣)；4170FTU/g(B，對比樣)和6830(C)FTU/g。這給出了活性分別為1.153、1.685和1.745FTU/g飼料的三種飼料。
將第一個(gè)樣品(150g)與20kg飼料按下述那樣混合。此后將該預(yù)混合物與80kg飼料混合并分成兩份，成為兩個(gè)不同溫度下兩個(gè)試驗(yàn)的飼料。第二個(gè)樣品是153.6g于20kg飼料中。將該20,153.6樣品分成10.076kg的等量的兩份。然后將每份與230kg飼料混合而得試驗(yàn)用的飼料粉。
至于第三個(gè)試驗(yàn)，將96g?；锱c20kg飼料混合再分成10.048g的兩份。然后將每份與230kg飼料混合而得試驗(yàn)用的飼料粉。壓丸速度是600kg/h。所述飼料混合物包括玉米20.00％小麥30.00％大豆(加熱了)10.00％大豆(粗粉46.7/3.7) 18.20％木薯(65％淀粉) 6.97％骨粉飼料(56.5/10.9) 4.00％魚粉(70.6％re) 1.00％羽毛粉，含水1.00％豆油/玉米油 1.30％動物脂肪4.00％維生素/礦物質(zhì)預(yù)混合物(玉米) 1.00％碳酸鈣 0.85％磷酸一鈣1.05％鹽 0.26％L-賴氨酸HCl 0.16％DL-蛋氨酸 0.21％然后將這三種混合物壓丸。將飼料進(jìn)料入勻濕器，其中將蒸汽直接加到飼料粉上。溫度升高到75℃。隨后從造粒機(jī)排出飼料粉，飼料粉在造粒機(jī)中被推動通過具有5mm孔、65mm厚的模板。此時(shí)飼料的溫度又升高4℃達(dá)到79℃。
這三種飼料的活性是10.11(A)；10.04(B)和9.81(C)。
該試驗(yàn)的殘余活性結(jié)果是63％(A)；66％(B)和72％(C)，分別相應(yīng)于原來的610FTU/g樣品；4170 FTU/g樣品和6830 FTU/g樣品。這表明，即使有相似活性(B和C)，最高活性的配方(C；6830 FTU/g，本發(fā)明的配方)給出高得多的壓丸穩(wěn)定性。這比(對比的)樣品B高6％，該值相當(dāng)顯著，因?yàn)閺幕钚栽黾雍艽?610至4170 FTU/g)的樣品(從A到B)只觀測到3％的增大。
權(quán)利要求
1.一種制備含植酸酶的水成液的方法，該方法包括(a)在允許重組表達(dá)植酸酶的條件下在含水培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有異源植酸酶基因的曲霉屬或木霉菌屬微生物，所述異源植酸酶基因處于葡糖淀粉酶(對于曲霉屬)啟動子或纖維二糖水解酶(對于木霉菌屬)啟動子控制之下，所述培養(yǎng)基包括作為所述微生物的食物的可同化碳源和可同化氮源；(b)過濾所述含水培養(yǎng)基以除去微生物而得含水濾液；以及(c)將得自(b)的濾液進(jìn)行超濾處理而得植酸酶濃度至少為14,000FTU/g的水成液。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是黑曲霉、米曲霉或Trichoderma reesei。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述微生物不具有或者不表達(dá)葡糖淀粉酶(AG)基因。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物具有多個(gè)拷貝的植酸酶基因。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述水成液基本上不含高淀粉酶。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)基中的幾乎全部碳源和氮源在(b)的過濾前已被微生物消耗。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述水成液不含碳源和/或氮源。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中的植酸酶是在具有葡糖淀粉酶信號序列的微生物中表達(dá)的。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述含水濾液或水成液都未經(jīng)歷結(jié)晶和/或脫色步驟。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中形成的水成液植酸酶活性是18,000FTU/g或更高。
11.一種可通過前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法制備的水成液，它包括濃度至少為14,000FTU/g的植酸酶。
12.權(quán)利要求11的水成液，它得自一種植酸酶在其中被表達(dá)了的培養(yǎng)基。
13.一種制備適用于動物飼料的含植酸酶?；锏姆椒?，該方法包括加工一種固體載體和一種權(quán)利要求11或12的水成液從而獲得含植酸酶的粒子，該固體載體包括至少15％(w/w)的一種食用碳水化合物聚合物。
14.權(quán)利要求13的方法，將所述水成液與載體混合，再捏和形成的混合物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述粒子接著被干燥。
16.權(quán)利要求13或14的方法，其中該方法包括a)將含有植酸酶的水成液與固體載體混合；b)機(jī)械加工a)中得到的混合物而得含酶粒子；以及c)干燥b)中獲得的含酶粒子。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述加工包括擠出、壓丸、高剪切?；?、膨脹、流化床團(tuán)聚或其組合。
18.可通過權(quán)利要求13～17任一項(xiàng)的方法制備的含植酸酶的粒化物。
19.一種?；铮ㄓ芍菜崦负凸腆w載體形成的干粒子，其中所述固體載體包括至少15％(w/w)食用碳水化合物聚合物。
20.權(quán)利要求19的?；?，其中所述粒子包括至少一種二價(jià)陽離子。
21.權(quán)利要求19或20的?；?，其中所述粒子包括一種或多種疏水性膠凝化合物或水不溶性化合物。
22.權(quán)利要求21的?；铮渲兴鍪杷阅z凝化合物或水不溶性化合物包括衍生化纖維素、聚乙烯醇(PVA)或食用油。
23.權(quán)利要求22的粒化物，其中所述衍生化纖維素是羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素或羥乙基纖維素和/或所述食用油是豆油或低芥酸菜子油。
24.權(quán)利要求19～23任一項(xiàng)的?；?，它另外還包括內(nèi)切木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。
25.權(quán)利要求19～24任一項(xiàng)的?；铮渲兴鲚d體包括淀粉。
26.權(quán)利要求19～25任一項(xiàng)的粒化物，其中所述植酸酶不是一種耐熱的(熱穩(wěn)定的)植酸酶。
27.權(quán)利要求19～26任一項(xiàng)的?；?，其中所述植酸酶是真菌植酸酶。
28.權(quán)利要求19～27任一項(xiàng)的組合物，其中所述真菌植酸酶得自曲霉屬或木霉菌屬菌種。
29.一種制備動物飼料、動物飼料的預(yù)混合物或前體的方法，該方法包括將權(quán)利要求19～28任一項(xiàng)定義的含植酸酶?；锱c一種或多種動物飼料物質(zhì)或組分混合。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述飼料物質(zhì)和組合物或粒化物的混合物被用蒸汽處理，被壓丸并且任選被干燥。
31.一種組合物，它包括權(quán)利要求19～28任一項(xiàng)的?；锖?或活性至少為6,000FTU/g的含植酸酶?；?。
32.權(quán)利要求31的組合物，它是一種食用飼料組合物。
33.權(quán)利要求32的組合物，它是一種動物飼料。
34.權(quán)利要求32或33的組合物，它包括與權(quán)利要求19～27任一項(xiàng)的?；锘旌系囊环N或多種飼料物質(zhì)或組分的丸粒。
35.權(quán)利要求31～34任一項(xiàng)的組合物，它是一種動物飼料、動物飼料的預(yù)混合物或前體，可通過權(quán)利要求29或30的方法制備。
36.一種促進(jìn)動物生長的方法，該方法包括給動物喂食一種食物，該食物包括權(quán)利要求19～27任一項(xiàng)定義的?；锘驒?quán)利要求31～35任一項(xiàng)定義的組合物。
37.權(quán)利要求19～27任一項(xiàng)定義的?；镌趧游镲暳现械膽?yīng)用或作為動物飼料的組分的應(yīng)用，或者用于動物食物中。
38.一種組合物的應(yīng)用，所述組合物包括15％(w/w)食用碳水化合物聚合物，該聚合物作為植酸酶的載體以改善植酸酶的壓丸穩(wěn)定性。
全文摘要
公開了一種制備含植酸酶的水成液的方法,該方法包括:在含可同化碳源和氮源(例如葡萄糖和銨離子)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)曲霉屬或木霉菌屬微生物,過濾所述培養(yǎng)基,再將形成的濾液進(jìn)行超濾處理而給出具有至少14,000FTU/g的含水組合物。該水成液可被用來制備可摻入動物飼料的?；?。
文檔編號A23K1/18GK1268029SQ98807104
公開日2000年9月27日 申請日期1998年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月4日
發(fā)明者R·C·M·巴蘭德斯, G·M·H·密斯特司, C·S·M·安戴拉 申請人:Dsm公司