專利名稱：殺昆蟲劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自細菌，更特別地來自致病桿菌屬(Xenorhabdus)種類的有殺昆蟲活性的物質(zhì)、制劑和組合物。本發(fā)明也涉及應(yīng)用這些化合物和組合物的生物和方法。
目前需要具有殺昆蟲活性的物質(zhì)、制劑、組合物和生物以用于例如農(nóng)作物保護或昆蟲介導的病害控制。需要新的物質(zhì)以克服對現(xiàn)有殺蟲劑的抗性問題。這樣的物質(zhì)理想地是生產(chǎn)便宜、有高度活性的(無論是單獨使用或聯(lián)合使用)并且在目的害蟲經(jīng)口攝入時有效。因而，任何提供使這些特性增強的物質(zhì)、制劑、組合物或生物的發(fā)明都代表現(xiàn)有技術(shù)的進步。
在自然界，致病桿菌屬種類往往與線蟲寄主共生，已知這種共生可用于控制害蟲活動。例如，已知某種致病桿菌屬種類單獨注射入宿主血管體腔時能殺死寄主昆蟲。
另外，一種胞外殺昆蟲毒素已從光桿狀菌(Photorhabdusluminescens)分離出來(這個種最近已從致病桿菌屬分出，但與該屬種類親緣關(guān)系很近)。這種毒素攝入時是無效的，但注射入某種昆蟲幼蟲時是高毒性的(見昆蟲寄生蟲和病原體，第二卷，Beckage,N.E.等編，學術(shù)出版社，1993)。
也已知來自光桿狀菌(P.luminescens)和嗜線蟲致病桿菌(X.nematophilus)的某些低分子量雜環(huán)化合物靜脈注射或局部施用時具有抗生特性(見Rhodes,S.H.等，PCT WO84/01775)遺憾的是，這些現(xiàn)有技術(shù)物質(zhì)都沒有上述理想的殺蟲特性，特別是經(jīng)口施用時沒有毒性。
本發(fā)明提供來自致病桿菌屬種類的殺昆蟲制劑和組合物、產(chǎn)生這樣的化合物和組合物的生物以及使用這些制劑、組合物和生物的方法，所有這些減少了現(xiàn)行技術(shù)的某些問題。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，公開了殺滅或控制昆蟲蟲害的一種方法，包括經(jīng)口部向害蟲施用來自致病桿菌的細胞或者從其衍生或得到的殺昆蟲物質(zhì)。
公開為WO95/00647的CSIRO的PCT申請公開了來自嗜線蟲致病桿菌的表觀毒性蛋白；但是沒有給出蛋白毒性的細節(jié)，并且的確沒有公開其作為口入殺昆蟲劑的用途。
因此，本發(fā)明提供一種適于經(jīng)口施用給昆蟲的殺昆蟲組合物，此組合物包含可從致病桿菌屬種類獲得的殺昆蟲物質(zhì)或其殺昆蟲片段或二者中任一的殺昆蟲變體或衍生物。
事實上，這種組合物可以包含致病桿菌屬種類細胞或選擇性地取自致病桿菌細胞培養(yǎng)物的上清液。然而，組合物優(yōu)選地含有如下文所述從致病桿菌分離的毒素。毒素已經(jīng)與圖2的核苷酸序列編碼的物質(zhì)聯(lián)系起來。因此，組合物相應(yīng)地含有圖2所有或部分核苷酸序列編碼的殺昆蟲物質(zhì)。也可以使用這樣的毒素的殺蟲片段及變體或衍生物。
圖2的序列是40Kb長度的順序。相信這個序列可編碼一種以上的蛋白，每種蛋白單獨或一起時可以調(diào)節(jié)或有殺昆蟲性。常規(guī)要測定哪部分對于殺昆蟲活性是必需或充分的。
此處所用的術(shù)語“變體”是指改變了氨基酸序列但還具有相似活性的毒素。某些氨基酸被各種氨基酸替換但不顯著改變活性。替換可以是“保守替換”的方式，即氨基酸被具廣義相似特性的氨基酸替換；或者可以是某些非保守替換。但是，一般而言，變體與天然毒素至少60％同源性；優(yōu)選地至少70％同源性；更優(yōu)選地至少90％同源性。
術(shù)語“衍生物”涉及已經(jīng)用例如化學或生物方法修飾的毒素。
這些毒素是新的，并且它們及編碼它們的核酸構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
優(yōu)選的致病桿菌屬種類是細菌嗜線蟲致病桿菌。本發(fā)明內(nèi)容中所用的嗜線蟲致病桿菌的特異菌株是ATTC 19061菌株，可從英國國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen,Scotland(NCIMB)得到。此外，適用的菌株包括1997年7月10日保藏于NCIMB并得到保藏登記號為NCIMB 40886和NCIMB 40887的兩個致病桿菌新菌株。后兩個菌株構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
所有菌株都有下表1所列的共同特性。表1菌株
*NBTA(含0.0025％溴麝香草酚藍和0.004％氯化四唑的氧化物營養(yǎng)瓊脂)優(yōu)選地目的害蟲是昆蟲，更優(yōu)選地是鱗翅目的昆蟲，特別是大菜粉蝶(Pieris brassicae)、小菜粉蝶(Pieris rapae)或菜蛾(Plutella xylostella)；或者膜翅目的昆蟲，特別是五帶淡色庫蚊(Culex quinquefaciatus)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，致病桿菌屬種類的細胞或由其得來的制劑與蘇云金芽孢桿菌結(jié)合使用作為口入殺昆蟲劑。
在進一步的實施方案中，不是蘇云金芽孢桿菌本身而是來自蘇云金芽孢桿菌的殺昆蟲物質(zhì)(例如δ內(nèi)毒素或其它分離物)與致病桿菌結(jié)合使用。
術(shù)語“可從……得到(Obtainable from)”一詞意味著不僅包含從該細菌直接分離的物質(zhì)，而且包含隨后克隆入其它生物并由其合成的物質(zhì)。
因此，出乎意料的發(fā)現(xiàn)致病桿菌屬細菌(及由其得來的物質(zhì))被攝入時有殺昆蟲活性以及這種細菌和物質(zhì)與蘇云金芽孢桿菌(以及來自該菌的毒素或物質(zhì))結(jié)合使用更有利，構(gòu)成了本發(fā)明第一方面的基礎(chǔ)。蘇云金芽孢桿菌分離物本身的殺昆蟲活性已有文獻廣泛證明。但是以前尚未證明這些分離物與致病桿菌屬細胞(或來自該菌的物質(zhì))的協(xié)同殺昆蟲活性。
本發(fā)明更進一步的實施方案中，使用取自致病桿菌，特別是嗜線蟲致病桿菌培養(yǎng)物的上清液代替上述來自致病桿菌屬種類的細胞。
所有這些方法尤其可以用于控制害蟲。
本發(fā)明還制備了含有來自致病桿菌屬種類，優(yōu)選地嗜線蟲致病桿菌的細胞并與蘇云金芽孢桿菌相結(jié)合的有效殺昆蟲組合物。與上述方法一樣，在本發(fā)明的組合物中可以使用來自蘇云金芽孢桿菌的殺昆蟲毒素(優(yōu)選是δ內(nèi)毒素)作為蘇云金芽孢桿菌的替代物。
同樣，取自致病桿菌，優(yōu)選地嗜線蟲致病桿菌培養(yǎng)物的上清液可以用于代替來自致病桿菌屬種類的細胞。
這樣的組合物尤其可以例如通過噴施農(nóng)作物用于農(nóng)作物保護或用于家畜保護。此外，本發(fā)明的組合物可以用于傳病媒介昆蟲的控制。
本發(fā)明進一步包括可從致病桿菌分離的新型殺昆蟲劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該懂得分離此種制劑的技術(shù)。
特別地，這種技術(shù)包括毒素蛋白在蛋白水平或DNA水平上的分離和鑒定。
申請人已從致病桿菌NCIMB 40887克隆了編碼殺昆蟲活性的DNA區(qū)域，并對其進行了部分測序，序列示于下文圖2(SEQ ID NO.1)。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中還提供SEQ ID No.1的DNA或其變體或片段編碼的毒素。
本發(fā)明還提供編碼此毒素的重組DNA。本發(fā)明的重組DNA可以包含圖2的序列或其變體或片段。由于遺傳密碼的兼并性，其它DNA序列可以編碼相似蛋白。所有這樣的序列都包括于本發(fā)明中。
此處提供的序列足以使可用于鑒定和隨后提取毒素基因DNA的探針得到制備。如本領(lǐng)域已知的，然后可以將此DNA克隆進載體和宿主細胞。
包含圖2序列或在嚴格條件下與圖2序列雜交的DNA構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
表達方式“與…雜交”是指在嚴格雜交條件下核苷酸序列將退火成圖2的全部或部分序列，例如《分子克隆操作手冊》中所述的，該書由Sambrook,Fritsch和Maniatis編輯，由冷泉港實驗室出版社出版于紐約冷泉港。
用于特定分析技術(shù)的序列長度將依賴于技術(shù)的性質(zhì)、序列互補程度、序列性質(zhì)、特別是探針或引物的GC含量以及所用的特定雜交條件。在高嚴格條件下，只有完全互補的序列結(jié)合，但在低嚴格條件下，與靶序列有60％，優(yōu)選的80％同源性的序列將結(jié)合。高和低的嚴格條件都包括在這里所用的術(shù)語“嚴格條件”之中。
圖2DNA的適當片段，即編碼殺昆蟲劑的那些片段，可以用標準技術(shù)鑒定。例如，可按例如H.S.Seifert等，美國國家科學院院報(1986),83,735-739所述使用轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)。可以使用各種轉(zhuǎn)座子誘變載體如粘粒cHRIM1，然后篩選失去殺昆蟲活性者。這樣編碼負責毒性的蛋白的DNA區(qū)域可以得到鑒定。
例如，可以將小轉(zhuǎn)座子mTn3(HIS3)導入毒性致病桿菌克隆，比如下文稱為“克隆1”的cHRIM1，將cHIM1 DNA電穿孔入大腸桿菌RDP146(PLB101)并將此菌株與大腸桿菌RDP146(POX38)融合(mating)，隨后與大腸桿菌NS2114 Sm融合。最后的菌株將含有帶有轉(zhuǎn)座子mTn3(HIS3)單個插入的cHRIM1 DNA。培養(yǎng)這些克隆落并按下文實施例8所述測試殺昆蟲活性。限制酶切作圖或DNA測序可用于鑒定mTn3(HIS3)的插入點并由此鑒定參與毒性的DNA區(qū)域。相似的方法中可以用其它轉(zhuǎn)座子如TN5和mTn5。
如《分子克隆操作手冊》，Maniatis,Fritsch和Sambrook,(1982)，冷泉港所述的，可以使用cHRIM1定點誘變位點測定毒性特異的DNA區(qū)段的重要性。
選擇性地，亞克隆技術(shù)可以用于鑒定編碼殺昆蟲活性的克隆DNA區(qū)域。在此方法中，對特定的DNA小片段進行亞克隆并鑒定其活性。為此，可以用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割粘粒DNA并連入質(zhì)粒載體如PUC19上的相容限制性位點。將連接混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并用質(zhì)粒載體上的選擇性標志物如編碼抗生素抗性的選擇性標志物來篩選轉(zhuǎn)化的克隆。這些技術(shù)的細節(jié)在例如上述Maniatis等的書(見390-391頁)以及L.G.Davies,M.D.Dibner和J.F.Battey編的《分子生物學方法》,Elsevier(見第222-224頁)中描述。
可以培養(yǎng)含有特定片段的單克隆并按下文實施例8中所述測定活性。帶有殺蟲活性的亞克隆可以用相同方法進一步截短以進一步鑒定編碼活性的DNA區(qū)域。
本發(fā)明還公開一種分離的殺昆蟲劑，其特征在于該制劑來自嗜線蟲致病桿菌或其變種的培養(yǎng)物，具有針對大菜粉蝶、小菜粉蝶和菜蛾的口入殺蟲活性，高達55℃時基本上熱穩(wěn)定性，是蛋白質(zhì)，與作為口入殺昆蟲劑的蘇云金芽孢桿菌細胞協(xié)同作用，基本上對胰蛋白酶和蛋白酶K的蛋白水解作用有抗性。
“高達55℃時基本上有熱穩(wěn)定性”是指將懸浮液中的制劑加熱至55℃ 10分鐘后測試時仍保留一些殺昆蟲活性，優(yōu)選地至少保留未處理活性的50％。
“基本上對蛋白水解作用有抗性”是指制劑在30℃與蛋白酶接觸2小時仍保留一些殺昆蟲活性，優(yōu)選地至少保留未處理活性的50％。
“協(xié)同作用”是指各成分結(jié)合使用的活性大于成分單獨使用的期望值。例如，與作為口入殺昆蟲劑的蘇云金芽孢桿菌結(jié)合使用時蘇云金芽孢桿菌細胞物質(zhì)單獨使用引起大菜粉蝶50％死亡率所需濃度在與以單獨使用時足以引起25％死亡率的濃度的制劑結(jié)合應(yīng)用時降低至少80％。
已發(fā)現(xiàn)用30KDa除去濾膜仍保留物質(zhì)的活性，而用100KDa除去濾膜僅保留部分活性。
優(yōu)選地，制劑進一步的特性在于，通過于25℃用十二烷基磺酸鈉(SDS-0.1％,60分鐘)和丙酮(50％,60分鐘)處理，殺昆蟲活性喪失。
顯然，可以利用上述分離制劑的特有特性從致病桿菌細胞和培養(yǎng)基上清液提純或濃縮制劑。從異源混合物提純蛋白的方法在本領(lǐng)域眾所周知(例如硫酸銨沉淀，蛋白水解，用已知分子量的除去濾膜超濾，分子交換層析、凝膠電泳等)?？谌霘⒗ハx活性提供了測試每階段后或每個洗脫樣本中制劑水平的簡便方法。這種方法學不需要本領(lǐng)域技術(shù)人員的創(chuàng)造性努力。
本發(fā)明進一步公開了包含如上所述的一種或多種制劑的口入殺蟲組合物。優(yōu)選地這樣的組合物進一步包含來自非致病桿菌屬種類的其它殺昆蟲物質(zhì)?？梢赃x擇例如與上述制劑有互補性或與之協(xié)同作用的其它物質(zhì)。
優(yōu)選地口入殺昆蟲組合物含有與蘇云金芽孢桿菌(或源自其中的毒素，優(yōu)選地內(nèi)毒素)結(jié)合的一種或多種上述殺昆蟲劑。
編碼所述蛋白的重組DNA也構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。如技術(shù)上已知的，可以將DNA摻入表達載體，并在適當調(diào)控元件如啟動子、增強子、信號序列等的影響下，這些表達載體構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。這些表達載體可以用于轉(zhuǎn)化宿主生物以保證該生物產(chǎn)生此毒素。
本發(fā)明可進一步得到包含編碼上述殺昆蟲劑的核苷酸序列的宿主生物。
克隆編碼特性蛋白的序列并導入宿主生物的方法在領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。例如，蛋白可以純化和測序，如果測序不需要活性，可以用SDS凝膠電泳接著凝膠印跡來純化蛋白。蛋白序列能用來制備核苷酸探針，探針本身可以用于從致病桿菌基因文庫中鑒別適當?shù)幕蚱巍Ｈ缓髮⑦@些片段經(jīng)適當載體插入能表達蛋白的宿主生物。這些一般技術(shù)的使用是常規(guī)的，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是非創(chuàng)造性的。此技術(shù)可以用于制備不同于圖2序列所編碼的那些致病桿菌毒素。
為了例如優(yōu)化其物理或毒理學特性，可能需要通過改變其基因序列(及因此改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu))來操作(例如變異)此制劑。
也可能需要對寄主加以設(shè)計和選擇使它還能表達其它蛋白性殺昆蟲物質(zhì)(例如來自蘇云金芽孢桿菌的δ內(nèi)毒素)。同樣可能需要制備能表達由本制劑的活性部分和其它毒性增強物質(zhì)組成的融合蛋白的宿主生物。
可以選擇產(chǎn)生大量殺蟲物質(zhì)以用于純化的宿主，例如使用用編碼殺蟲劑的基因轉(zhuǎn)化的蘇云金芽孢桿菌。然而優(yōu)選的寄主是植物，植物將由此得到改善的抗蟲性。適當?shù)闹参镙d體如來自根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti質(zhì)質(zhì)粒在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知?；蛘?，可以選擇例如對蟲直接致病的宿主，例如昆蟲桿狀病毒。
本發(fā)明的精神和范圍包括所有這些宿主生物和它們表達的制劑、變異制劑或制劑融合物質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供具有工業(yè)上可應(yīng)用的殺昆蟲活性并特別適合于改善農(nóng)作物保護或昆蟲介病毒害控制的方法、組合物、制劑和生物。
現(xiàn)在，本發(fā)明的方法、組合物和制劑將以舉例說明的方式通過下列非限制性實施例和附圖進行描述。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，將出現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的本發(fā)明范圍內(nèi)的其它實施方案。附圖


圖1表示如實施例3所述的嗜線蟲致病桿菌ATCC 19061的生長隨時間的變化以及細胞和上清液針對大菜粉蝶的活性。
圖2表示來自致病桿菌的克隆的毒素基因的大部分序列。
圖3表示來自兩個致病桿菌菌株的克隆的毒素基因的限制性圖譜比較。(上，克隆1；下，克隆3)實施例實施例1-嗜線蟲致病桿菌細胞作為口入殺蟲劑的應(yīng)用細胞生長將嗜線蟲致病桿菌(ATCC 19061，菌株9965，得自英國國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen，蘇格蘭)的傳代培養(yǎng)物接種于含50ml LB(Laria Broth)培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，其中每升LB含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl。培養(yǎng)物在三角瓶中旋轉(zhuǎn)搖床上于27℃生長40小時。
細胞懸浮液的制備培養(yǎng)物以5000xg離心10分鐘，棄去上清液，細胞團洗一次，再懸浮于等體積的磷酸鹽緩沖液(每升含8g NaCl,1.44gNa2HPO4和0.24g KH2PO4,pH7.4)中。
細胞懸浮液對昆蟲的毒性生物測試如下大菜粉蝶使幼蟲在摻入了細胞懸浮液的一系列稀釋液的人工瓊脂基食物上進食〔如David和Gardiner(1965)所述，倫敦自然雜志，207,882-883〕。生物測試驗用5個劑量的系列進行，每劑量至少25只幼蟲。測試了未處理和熱處理(55℃,10分鐘)的細胞。溫度保持在25℃，2天和4天后記錄死亡率。
埃及伊蚊(Aedes aegypti)幼蟲暴露于細胞懸浮液的5個去離子水中的不同稀釋度系列中。生物測試使用兩個劑量在9.5cm塑料杯中進行，每種稀釋度5為0ml細胞懸浮液。每劑量25只二齡期幼蟲。測定了未處理和熱處理(55℃或80℃,10分鐘)的細胞。溫度保持在25℃,2天后記錄死亡率。
五帶淡色庫蚊(Culex quinquefaciatus)幼蟲暴露于含4×107細胞/ml的單一濃度細胞懸浮液中。生物試驗使用2×50ml細胞懸浮液在9.5cm塑料杯中進行，每杯用25只二齡期幼蟲。測試了未處理和熱處理(55℃或80℃,10分鐘)的細胞。溫度保持在25℃,2天后記錄死亡率。
因此，這些結(jié)果清楚表明，嗜線蟲致病桿菌作為口入殺蟲劑對多種害蟲有效(并對大菜粉蝶特別有效)。殺蟲活性不依賴于細胞生存力(即加熱到55℃使細胞生存力降低了＞99.99％，但對活性無大影響)；但是加熱到80℃多數(shù)蛋白質(zhì)變性使活性大大降低。實施例2-嗜線蟲致病桿菌上清液作為口入殺蟲劑的應(yīng)用細胞生長培養(yǎng)物生長如實施例1。
上清液制備培養(yǎng)物在10000g下離心10分鐘兩次除去細胞團。
上清液對害蟲的活性生物試驗如下按照實施例1中對于大菜粉蝶的方法測試針對新生的大菜粉蝶以及2日齡的大菜粉蝶和菜蛾幼蟲的活性，但使用上清液的一系列未處理的稀釋液代替細胞懸液，只在4天后記錄死亡率
另外，還發(fā)現(xiàn)在含有嗜線蟲致病桿菌上清液的人工食物上進食的甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)幼蟲上測試針對此昆蟲的大小減小活性(7日內(nèi)減小62％)。(結(jié)果未列出)。
因此，這些結(jié)果清楚地表明來自嗜線蟲致病桿菌培養(yǎng)基的上清液作為口入殺蟲劑對許多昆蟲種類有效，對大菜粉蝶特別有效。
上清液加熱到55℃ 10分鐘引起活性部分喪失，而加熱到80℃引起活性完全喪失。用SDS(0.1％重量/體積，60分鐘)和丙酮(50％體積/體積，60分鐘)處理也使活性完全喪失，但用TritonX-100(0.1％,60分鐘)、非食物的P4O(0.1％,60分鐘)、NaCl(1M,60分鐘)處理或在4℃或-20℃下冷藏2周對活性無影響。所有這些性質(zhì)都與蛋白制劑一致。
嗜線蟲致病桿菌細胞和上清液的一般作用模式在高劑量下兩天之內(nèi)使幼蟲大小減小和死亡和其它性質(zhì)例如溫度抗性表現(xiàn)出相似的暗示即單一制劑或制劑類型可能對細胞和上清液的口入殺蟲活性負責。實施例3-出現(xiàn)可吸收的殺昆蟲活性的時間表細胞生長1ml嗜線蟲致病桿菌的過夜培養(yǎng)物用于接種入三角瓶，然后如實施例1培養(yǎng)細胞。通過在600nm測量光密度來評估生長。
細胞懸浮液和上清的制備如實施例1和2。
細胞和上清液對大菜粉蝶的活性細胞懸液生物測試按實施例1進行，但使用單一劑量細胞懸浮細胞，相當于50μl培養(yǎng)液/g食物，2天后測死亡率。細胞上清液生物測試如實施例2進行，但使用相當于50μl上清液/g食物的單一劑量(即兩倍LC50以上)，2天后測死亡率。
結(jié)果示于
圖1。這些結(jié)果清楚地表明來自嗜線蟲致病桿菌培養(yǎng)基的細胞作為口入殺蟲劑僅5小時后就對大菜粉蝶高度有效，而上清液在20小時后高度有效。雖然在生長早期觀察到輕微的細胞溶解作用，但是沒有觀察到顯著的細胞溶解作用，這一點證明，上清液活性可能是由于真正的胞外制劑(而不是細胞破裂后釋放的)。實施例4-嗜線蟲致病桿菌細胞和蘇云金芽孢桿菌粉末制劑之間的協(xié)同作用細胞培養(yǎng)和懸浮如實施例1培養(yǎng)和懸浮嗜線蟲致病桿菌細胞。蘇云金芽孢桿菌菌株HD1(來自芽孢桿菌基因儲存中心，俄亥俄州立大學，Columbus,ohio43210，美國)得到培養(yǎng)、收集并制成粉末如Dulmage等(1790)在《無脊椎動物病理學》15,15-20中所述。
嗜線蟲致病桿菌細胞和蘇云金芽孢桿菌粉末對大菜粉蝶的活性生物測試驗使用嗜線蟲致病桿菌和蘇云金芽孢桿菌(Bt)的組合或單用蘇云金芽孢桿菌粉末按實施例1進行，但用蘇云金芽孢桿菌粉末不同稀釋液代替嗜線蟲致病桿菌。在結(jié)合試驗中，將足以引起25％死亡率的嗜線蟲致病桿菌細胞懸浮液的恒定劑量加進食物。2天后記錄死亡率。
這些結(jié)果清楚地證明，嗜線蟲致病桿菌細胞和蘇云金芽孢桿菌粉末之間作為口入殺蟲劑抵抗大菜粉蝶時的協(xié)同作用。實施例5-嗜線蟲致病桿菌上清液和蘇云金芽孢桿菌粉末之間的協(xié)同作用細胞培養(yǎng)和上清液制如實施例2培養(yǎng)嗜線蟲致病桿菌細胞并制備上清液。如實施例4培養(yǎng)并處理蘇云金芽孢桿菌。
嗜線蟲致病桿菌上清液和蘇云金芽孢桿菌細胞粉末對大菜粉蝶的活性生物測試用嗜線蟲致病桿菌(Xn)上清液和蘇云金芽孢桿菌結(jié)合進行，或單獨用蘇云金芽孢桿菌粉末進行。按實施例2針對初生大菜粉蝶及2日齡小菜粉蝶和菜蛾進行生物測試，但用蘇云金芽孢桿菌的各種稀釋液代替嗜線蟲致病桿菌。在結(jié)合試驗中，將足以引起25％死亡率的嗜線蟲致病桿菌上清液加進食物。4天后記錄死亡率。
結(jié)果清楚證明，當作為針對幾種昆蟲的口入殺蟲劑時嗜線蟲致病桿菌上清液和蘇云金芽孢桿菌粉末之間的協(xié)同作用。嗜線蟲致病桿菌細胞和上清液都表現(xiàn)協(xié)同作用這一事實強烈表明單一制劑或制劑類型對已證明的活性負責。實施例5-用蛋白水解鑒定來自嗜線蟲致病桿菌的殺蟲劑細胞培養(yǎng)和上清液的制備按實施例2培養(yǎng)嗜線蟲致病桿菌細胞并制備上清液。
上清液的蛋白水解培養(yǎng)物上清液(50ml)逆著0.5M NaCl(3×1升)于4℃透析48小時。透析管中通過用聚乙烯乙二醇8000(Sigma試劑)覆蓋使上清液體積減少5倍。取出樣品并用胰蛋白酶(SigmaT8253=10,000單位/mg)或蛋白酶K(Sigma P0390=10單位/mg)以0.1m蛋白酶/ml樣品濃度，于30℃處理2小時。
蛋白酶處理的上清液對大菜粉蝶的活性通在4.5cm直徑塑料瓶中，用25μl每“處理”涂于實例1所用的人工瓊脂基食物上來進行針對大菜粉蝶初生幼蟲的生物測試。每處理使各含10只幼蟲的4個瓶子。1和2天后記錄死亡率。只用水、胰蛋白酶(0.1g/ml)和蛋白酶K(0.1mg/ml)的對照用相同方法處理。<
實施例6-其它致病桿菌的殺昆蟲活性用實施例1和2的方法測試4個不同致病桿菌菌株針對昆蟲蟲害的活性。所得結(jié)果如下Ⅰ)對大菜粉蝶的活性<
發(fā)現(xiàn)，所有4個菌株的細胞和上清液加熱到80℃ 10分鐘時殺昆蟲活性減少99％以上。
Ⅱ)對蚊子(Aedes aegypti)的活性細菌按10上7細胞/ml水的比率加入。
另外，所有菌株都明顯減弱煙芽夜蛾(Heliothis virescens)的生長。
實施例7-從致病桿菌菌株克隆毒素基因用Quiagen基因組純化DNA試劑盒從NCIMB 40887和ATCC19061分離細胞總DNA。細胞在LB培養(yǎng)液(每升含10g胰蛋白胨，5g酵母提取物和5g NaCl)中于28℃振蕩(150rpm)培養(yǎng)至光密度1.5(A600)。通過4000×g離心收集培養(yǎng)物并重新懸浮于3.5ml緩沖液B1(50mM Tris/HCl,0.05％ Tween 20,0.5％ Triton X-100,pH7.0)并于50℃溫育30分鐘。利用Quiagen 100/G吸管按照廠商說明書從細菌溶菌產(chǎn)物分離DNA。獲得的純化DNA在-20℃存于TE緩沖液(10mMTris,1mM EDTA,pH8.0)中。
用限制性酶Sau 3A部分消化的NCIMB 40887和ATTC 19061的總DNA制備代表性的DNA文庫。來自每個菌株的約20μg DNA在37℃與0.25單位酶一起溫育。在10,20,30,45和60分鐘的時間間隔取樣并加熱至65℃ 15分鐘。為了觀察DNA片段的大小，將樣品在0.5％重量/體積瓊脂糖凝膠上電泳。合并含有最高比率的30至50kb片段的DNA樣品，用4單位蝦堿性磷酸酶(Boeh ringer)于37℃處理15分鐘，然后65℃熱處理使磷酸酶失活。
將選擇大小的DNA片段插入粘粒載體SuperCosl(Stratagent)的BamH1位點中并用GigapackⅡ包裝試劑盒(Stratgene)按照廠商說明包裝入大腸桿菌XL Blue1菌株。
為了選擇具有殺蟲活性的粘粒克隆，在含有25μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂平板上選擇的單克隆在LB培養(yǎng)液(含25μg/ml氨芐青霉素)上于28℃生長過夜。如實施例5中所述，分別將培養(yǎng)物(50μl)涂布到裝在4.5cm直徑瓶中的昆蟲食物表面。每個容器中加入10只初生大菜粉蝶幼蟲。24,72和96小時之后檢查幼蟲，記錄死亡率和存活幼蟲大小。總共220個NCIMB 40887克隆得到測試，發(fā)現(xiàn)其中2個引起72小時內(nèi)幼蟲生長減弱和死亡。ATTC 19061的370個克隆中發(fā)現(xiàn)一個在72小時內(nèi)引起幼蟲死亡。實施例8-克隆的毒素基因?qū)Υ蟛朔鄣幕钚詠碜詫嵤├?的三個活性克隆在含25μg/ml氨芐青霉素的LB養(yǎng)液中150rpm旋轉(zhuǎn)搖床上于28℃生長24小時。如實施例1所述，通過將完全液體培養(yǎng)物摻入昆蟲食物進行毒素克隆對初生幼蟲的活性測試。
*大腸桿菌XL1Blue培養(yǎng)液當將大腸桿菌毒素克隆于80℃加熱10分鐘并以100μl/g比率加進食物時，未測到對幼蟲的活性。毒素的熱敏感性突出。實施例9-來自NCIMB 40887的毒素克隆的測序用Wizard Plus SV DNA系統(tǒng)(promega)按照廠商說明從NCIMB40887提純上述殺昆蟲克隆1的粘粒DNA。如圖3所示，使用一系列限制酶ECoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ和SacⅠ獲得克隆片段的部分圖譜。DNA測序從用一系列限制酶ECoRⅠ、BamHⅠ、Hind Ⅲ、ECoRⅤ和PvuⅡ制備的以PUC18和PUC19為基礎(chǔ)的粘粒亞克隆開始。序列空隙用在純化的粘粒DNA上的引物步移法補充。測序反應(yīng)用帶有Ampli TaqDNA多聚酶FS的ABI PRISMTM染料終止循環(huán)測序反應(yīng)備好試劑盒按照廠商說明進行。樣品在ABI自動測序儀上按廠商說明進行分析?？寺〉亩拘云蔚拇蟛糠諨NA序列示于圖2。實施例10-來自克隆3的毒克隆素的限制性圖譜按實施例9中所述純化上述殺昆蟲克隆3的粘粒DNA?？寺∑蔚南拗菩詧D譜使用限制性酶BamHⅠ、HndⅢ、SalⅠ和SacⅠ獲得并在圖3中表示。與克隆1的圖譜(圖3)比較，顯然覆蓋重疊區(qū)域的限制性圖譜是很相似的。兩個克隆之間唯一可檢測到的差別是克隆了中兩個HindⅢ片段的長度縮短，對應(yīng)于克隆1中11.4Kb和7.2Kb HindⅢ片段，分別為約2Kb和200bp。這些結(jié)果表明在兩個細菌菌株中的編碼毒性的DNA區(qū)域是完全相關(guān)的。
實施例11-Southern Blot雜交試驗來自克隆1的10.3Kb BamHⅠ-SalⅠDNA片段用作探針來與用HindⅢ消化的致病桿菌菌株ATCC 19061,NCIMB 40886和NCIMB40887的總DNA雜交。雜交用20ng/ml DIG(洋地黃毒苷)標記的DNA探針在65℃進行18小時。免疫測試之前，濾紙用2×SSC(0.3M NaCl,30mM檸檬酸鈉，pH7.0)/0.1％(重量/體積)十二烷基磺酸鈉在室溫下洗兩次，每次5分鐘；再用0.1×SSC(15mM NaCl,1.5mM檸檬酸鈉，pH7.0)加0.1％十二烷基磺酸鈉在65℃下洗兩次，每次15分鐘。使用非放射性DIGDNA標記和檢測試劑盒(Bochringer)按照廠商說明標記探針。探針與所有三個菌株中的約8Kb HindⅢ片段和NCIMB 40887中的11.4Kb片段以及NCIMB 40886和ATCC 19061中的約9Kb的片段雜交。結(jié)果表明，菌株NCIMB 40886和ACTT 19061含有與上述克隆1的毒素基因密切同源的DNA，進一步證明由三個菌株產(chǎn)生的毒素之間的相似性。
權(quán)利要求
1．一種適于從口施用于昆蟲的殺昆蟲組合物，包括可從致病桿菌屬種類獲得的殺昆蟲物質(zhì)或其殺昆蟲片段或它們的殺昆蟲變體或衍生物。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的殺昆蟲物質(zhì)包括由圖2的核苷酸序列或其變體或片段或與該序列雜交的序列編碼的物質(zhì)。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的組合物，包含致病桿菌細胞。
4．如上述權(quán)利要求中的任意一項所述的組合物，包含來自致病桿菌屬種類的細胞培養(yǎng)物的上清液。
5．根據(jù)上述權(quán)利要求中的任意一項所述的組合物，其中致病桿菌屬種類是嗜線蟲致病桿菌。
6．根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任意一項所述的組合物，其中致病桿菌菌株是ATCC 19061、NCIMB 40886或NCIMB 40887。
7．根據(jù)上述權(quán)利要求中的任意一項所述的組合物，包含不是從致病桿菌獲得的其它殺昆蟲物質(zhì)。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述的其它殺昆蟲物質(zhì)包括可從蘇云金芽孢桿菌獲得的物質(zhì)。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，進一步包括蘇云金芽孢桿菌細胞。
10．根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中可從蘇云金芽孢桿菌獲得的殺昆蟲物質(zhì)包括δ內(nèi)毒素。
11．根據(jù)上述權(quán)利要求中的任意一項所述的組合物，進一步包含農(nóng)業(yè)上可接受的載體。
12．根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中載體包括各種昆蟲食物。
13．一種殺滅或控制昆蟲蟲害的方法，此方法包括向害蟲或其環(huán)境施用根據(jù)上述權(quán)利要求中的任意一項所述的組合物。
14．如權(quán)利要求13所述的方法，其中害蟲是鱗翅目或雙翅目昆蟲。
15．一種微生物，包括致病桿菌菌株NCIMB 40886。
16．一種微生物，包括致病桿菌菌株NCIMB 40887。
17．一種含有毒素的殺昆蟲劑，其中毒素包括由DNA編碼的蛋白，所述DNA包括SEQ ID No.1或其變體或片段。
18．一種分離的殺昆蟲劑，其特征在于它可從嗜線蟲致病桿菌或其突變體的培養(yǎng)物得到，具有針對大菜粉蝶、小菜粉蝶和菜蛾的口入殺蟲活性，高達55℃基本上是熱穩(wěn)定的，是蛋白質(zhì)，與作為口入殺昆蟲劑的蘇云金芽孢桿菌協(xié)同作用，以及對胰蛋白酶和蛋白酶K的蛋白水解作用基本上有抗性。
19．如權(quán)利要求18中所述的分離殺昆蟲劑，其進一步特征在于用十二烷基磺酸鈉或丙酮處理或加熱至80℃時殺蟲活性基本上遭到破壞。
20．如權(quán)利要求18或19所述的分離殺昆蟲劑，其進一步特征在于該殺昆蟲劑是細胞外蛋白質(zhì)。
21．一種重組DNA，編碼根據(jù)權(quán)利要求17至20中的任意一項所述的殺昆蟲劑。
22．根據(jù)權(quán)利要求21所述的重組DNA，包含圖2的序列或其變體或片段。
23．一種重組DNA，編碼殺蟲物質(zhì)，含有所有或部分圖2序列，或在嚴格條件下與所有或部分圖2序列雜交。
24．一種表達載體，含有根據(jù)權(quán)利要求21至23中的任意一項所述重組DNA。
25．用根據(jù)權(quán)利要求24所述的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主生物。
26．如權(quán)利要求25所述的宿主生物，此宿主生物經(jīng)加工或選擇從而也表達其它殺昆蟲蛋白活性增強物質(zhì)。
27．一種包含融合蛋白的核苷酸序列的宿主生物，融合蛋白包含與其它蛋白毒性增強物質(zhì)結(jié)合的根據(jù)權(quán)利要求17至20中的任意一項所述的制劑的殺昆蟲活性部分。
28．權(quán)利要求27所述的宿主生物，其中殺蟲活性增強物質(zhì)包括來自蘇云金芽孢桿菌的δ內(nèi)毒素。
29．如權(quán)利要求25至289中的任意一項所述的宿主生物，其中宿主是植物。
30．如權(quán)利要求25至28中的任意一項所述的宿主生物，其中宿主是針對昆蟲的致病病毒。
31．由如權(quán)利要求27所述的宿主表達的融合蛋白。
32．一種殺昆蟲組合物，包括權(quán)利要求17至20中的任意一項中所述的一種或多種制劑。
全文摘要
一種殺滅害蟲(例如昆蟲)的方法,包括將來自致病桿菌屬(Xenorhabdus)種類(例如嗜線蟲致病桿菌X·nematophilus)的物質(zhì)如細胞或上清液單獨,或與蘇云金芽抱桿菌 (Bacillus thuringiensis)或從其衍生的殺昆蟲物質(zhì)相結(jié)合經(jīng)口施用于害蟲。還公開了一種分離的殺昆蟲劑(以及含有此殺昆蟲劑的組合物),其特性在于可從嗜線蟲致病桿菌或其突變體的培養(yǎng)物獲得,具有針對大菜粉蝶(Pieris brassicae)、小菜粉蝶(Pieris rapae)和菜蛾(Plutella Xylostlla)的口入殺蟲活性,而且高達55℃時基本上是熱穩(wěn)定的,并且是蛋白質(zhì),與作為口入殺昆蟲劑的蘇云金芽孢桿菌細胞協(xié)同作用,以及對胰蛋白酶和蛋白酶K的蛋白水解作用基本上有抗性。還公開了編碼殺昆蟲活性的DNA。
文檔編號A01N63/02GK1233938SQ9719891
公開日1999年11月3日 申請日期1997年8月27日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月29日
發(fā)明者P·扎里特, D·J·艾利斯, J·A·W·莫岡 申請人:英王陛下的大不列顛及北愛爾蘭聯(lián)合王國政府農(nóng)業(yè)漁業(yè)和食品部