專利名稱:新抗生素制黃肝菌素的制備方法和農(nóng)業(yè)園藝用殺菌劑的制作方法
本發(fā)明是關(guān)于新抗生素制黃肝菌素(Xanthostatin代號(hào)SR-44)和其制備方法，以及一種有效成份為制黃肝菌素的農(nóng)業(yè)園藝用殺菌劑。
以往，農(nóng)業(yè)園藝用殺菌劑一直是使用如銅、汞、砷之類重金屬化合物制劑和有機(jī)氯、有機(jī)磷藥劑。但是這些藥劑對(duì)動(dòng)物和人體都有害，對(duì)土壤有污染作用，并且殘留在自然界中的有害物質(zhì)又長(zhǎng)期地作用于動(dòng)、植物。這樣造成的環(huán)境污染已成了當(dāng)今重大的社會(huì)問題，從而導(dǎo)致了目前這種被禁止或限制使用的局面。此外，隨著選擇性藥劑的減少及抗藥菌的出現(xiàn)，各種植物病害-尤其是水稻的主要病害有明顯加重的趨勢(shì)。為此，人們迫切希望能開發(fā)出一些既有強(qiáng)選擇性效果，又有高度安全性的新型農(nóng)藥。
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)各種植物病害均有效的新抗生素及其制備方法。而且本發(fā)明的目的還在于提供一種以上述抗生素為有效成份的農(nóng)業(yè)園藝用殺菌劑。
本發(fā)明所述的抗生素制黃肝菌素為未見文獻(xiàn)報(bào)道的新抗生素，其具有后述的理化性質(zhì)。同時(shí)，在后述的噴撒試驗(yàn)中，對(duì)水稻的主要病害如水稻紋枯病、稻瘟病及其它如黃瓜灰霉病、黃瓜炭疽病、茄黑斑病、葡萄晚腐病等各種植物病害都顯示了出色的防治效果，并且既無任何藥害，又對(duì)施用人員毫無影響，是一種優(yōu)良的農(nóng)業(yè)園藝用殺菌劑。
以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
抗生素制黃肝菌素的制備使用的微生物用來生產(chǎn)本發(fā)明所述的抗生素制黃肝菌素的微生物是一種屬于鏈霉菌屬的菌種，其具有生產(chǎn)抗生素制黃肝菌素的能力。
鏈霉菌SP·SR-44(Streptomyces SP·SR-44)(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心的保藏號(hào)CGMCC-0092)(以下簡(jiǎn)稱為“SR-44菌株”)就是其中一例。該菌株在與本申請(qǐng)相應(yīng)的日本專利申請(qǐng)中被命名為“鏈霉菌SP·RS-44?！痹撐⑸锞哂猩鲜鎏匦?，適于生產(chǎn)本發(fā)明所述的抗生素制黃肝菌素，因而能有效地使用于本發(fā)明所述的制備方法中。
同時(shí)，上述SR-44菌株的自然及其人工變異菌株也均屬于鏈霉菌屬的菌種。凡具有生產(chǎn)后述抗生素制黃肝菌素能力的微生物均可應(yīng)用本發(fā)明所述的方法。
上述“SR-44菌株”是從中國(guó)江蘇省的土壤中分離而得，其具有下述性質(zhì)1.形態(tài)特征在用含有葡萄糖、酵母浸膏的菌體分析用培養(yǎng)基上培養(yǎng)本菌株“SR-44菌株”，然后進(jìn)行菌體分離干燥，再用6N鹽酸在110℃、加熱水解20小時(shí)。用紙層析法檢測(cè)細(xì)胞壁的氨基酸組分時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)L、L-二氨基庚二酸。
此外，在瓊脂平板上生長(zhǎng)的氣生菌絲呈現(xiàn)出螺旋狀，可以看出這種螺旋狀菌絲是由數(shù)十個(gè)孢子所組成。但是卻看不到孢子囊和運(yùn)動(dòng)性的孢子。
從上可以說明，本菌株屬于鏈霉菌屬。孢子的形態(tài)呈圓柱狀表面平滑。
2.在各種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)(于27℃培養(yǎng)三周，顏色按照“顏色名稱描述詞典”(Descriptive color names dictionary)記述。
(1)蔗糖硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng) 不生長(zhǎng)(2)葡萄糖一天冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng) 普通氣生菌絲 微量 b灰乳色(oyster white)基內(nèi) b灰乳色(oyster white)色素 無(3)甘油一天冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng) 普通氣生菌絲 微量 b灰乳色(oyster white)基內(nèi) b灰乳色(oyster white)色素 無(4)淀粉-無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng) 良好氣生菌絲 多量 2ge柏氏色(Bergey)基內(nèi) 2ie淡芥色(light mustard)色素 無(5)酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng) 良好氣生菌絲 多量 3dc自然色(natural)基內(nèi) 2le芥色(mustard)色素 2ea亮黃色(light maize)(6)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng) 良好氣生菌絲 無基內(nèi) 1 1/2 Ca乳色(cream)色素 無(7)酵母-麥芽瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng) 良好氣生菌絲 多量 5fe灰色(ash)基內(nèi) 2lg芥黃褐色(mustard tan)色素 無(8)麥片瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng) 不良?xì)馍z 無基內(nèi) 不明色素 無(9)胨-酵母-鐵瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng) 良好氣生菌絲 無基內(nèi) 1 1/2 ea淡黃色(light yellow)色素 無3.碳源的利用性(普戈瓊脂培養(yǎng)基)L-阿拉伯糖 -D-木糖 +D-葡萄糖 +D-果糖 -蔗糖 -肌醇 -
L-鼠李糖 -棉子糖 -D-甘露醇 -+……生長(zhǎng) -……不生長(zhǎng)4.其它生理性質(zhì)(1)合適溫度 25～30℃(2)明膠的液化 液化(葡萄糖-胨-明膠培養(yǎng)基)(3)淀粉水解 水解(淀粉-無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基)(4)脫脂乳的凝固 凝固(5)脫脂乳的液化 液化(6)黑色素的生成(酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基) 不生成(胨-酵母鐵瓊脂培養(yǎng)基) 不生成具有上述各性質(zhì)的鏈霉菌屬菌種按柏氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)第八版(Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology 8 th ed)分類法，本菌種應(yīng)屬于WISIC-ISM群，從色調(diào)、孢子形態(tài)來看，最近緣可可鏈霉菌。由此可以推斷本菌種屬可可鏈霉菌或其極近緣菌。
“SR-44菌株”的培養(yǎng)及制黃肝菌素的制取和提純用鏈霉菌屬的上述抗生素生產(chǎn)菌，通過常規(guī)的抗生素生產(chǎn)方法，可以培養(yǎng)“SR-44菌株”并制得本發(fā)明所述的抗生素制黃肝菌素。培養(yǎng)方式既可為液體培養(yǎng)也可為固體培養(yǎng)。但為了有利于工業(yè)性生產(chǎn)時(shí)的培養(yǎng)，宜將上述生產(chǎn)菌的孢子懸浮液或培養(yǎng)液接種到培養(yǎng)基上并進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)。
對(duì)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源并無特殊的規(guī)定，可含有常用于微生物培養(yǎng)的碳源，氮源及其它營(yíng)養(yǎng)源。其中碳源可為淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、肌醇、甘露醇等。氮源可為胨、大豆粉、肉膏、米糠、麥皮、尿素、玉米漿、銨鹽、硝酸鹽，以及其它有機(jī)或無機(jī)含氮化合物。對(duì)于其它營(yíng)養(yǎng)源來講，可適當(dāng)添加一些無機(jī)鹽類，例如食鹽、磷酸鹽類及鉀、鈣、鋅、錳、鐵之類的金屬鹽，必要時(shí)也可添加些動(dòng)、植、礦物油等作為消泡劑。
對(duì)培養(yǎng)時(shí)的溫度、時(shí)間等培養(yǎng)條件并無嚴(yán)格的限制，以適于使用菌的發(fā)育為準(zhǔn)，并以選擇制黃肝菌素產(chǎn)量最高的條件為好。例如，培養(yǎng)基的pH范圍可為4～9，以接近中性為好。培養(yǎng)溫度、攪拌條件等均應(yīng)根據(jù)所使用菌株的種類及外部條件等進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，以獲得最好的效果。
由上述所得的培養(yǎng)物出發(fā)，通過一些適當(dāng)?shù)姆椒ň湍苤频弥泣S肝菌素。這是些常用于提取代謝產(chǎn)物的常規(guī)方法。例如，可利用制黃肝菌素與不純物在溶解度、離子結(jié)合力、吸附親和力及分子量等方面的差別進(jìn)行提取。具體地講，制黃肝菌素大部分存在于培養(yǎng)濾液中。將培養(yǎng)液調(diào)整到偏酸性，譬如調(diào)整到PH4.0，再用醋酸乙酯之類的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。所得的濃縮油狀物通過吸附層析、硅膠層析、液相層析、離子交換層析、凝膠層析等組合精制后，即可得到含有制黃肝菌素及其它活性成分的組份。例如，將油狀物進(jìn)行硅膠層析后在氯仿-甲醇中展開得到活性組份。然后通過高速液相層析〔例如，充填劑選用Nucleosil5C18，展開劑為甲醇-水(8∶2)中加入1%的二乙胺-甲酸(pH7.5)〕取得粗粉。該粗粉經(jīng)過高速液相色譜(如High-Carbcn ODS)的精制，即可制得白色粉末狀的制黃肝菌素精制品。
如此所制取的新抗生素制黃肝菌素具有下述理化性質(zhì)及生物性質(zhì)。
抗生素制黃肝菌素的理化性質(zhì)及生物性質(zhì)分介點(diǎn)于160℃起徐徐分介元素分析碳63.36%、氫8.69%、氧26.72%比旋度〔α〕20D＝+3.4°(C＝1%、氯仿)紫外吸收光譜
210、250nm(Sh)(參照?qǐng)D1)紅外吸收光譜(KBr法)3400、2900、1755、1695、1620、1445、1375、1240、1155、1085、970、900、715cm-1(參照?qǐng)D2)溶介性易溶于甲醇、丙酮、醋酸乙酯、氯仿、苯;難溶于水;不溶于正己烷、戊烷分子量(按FD質(zhì)譜)766(分子式C41H66O13)顯色反應(yīng)與茴香醛-硫酸、2、4-二硝基苯肼呈陽性;與三氯化鐵、茚滿三酮、來登·史密斯試劑呈陰性反應(yīng)物質(zhì)顏色白色粉末薄層分析(美國(guó)Merck公司制薄層板0.25mm硅膠)溶劑為氯仿∶甲醇＝2∶1時(shí) Rf值0.42溶劑為醋酸乙酯∶苯＝4∶1時(shí) Rf值0.16抗菌譜采用通常的瓊脂平板稀釋法，以最低抑制濃度(MIC)來表示。細(xì)菌使用肉湯瓊脂培養(yǎng)基，霉菌使用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基。
MIC(mcg/ml)黃瓜灰霉病菌 125(Botrytis cinerea)黃瓜炭疽病 125(Colletotrichum lagenarium
水稻稻瘟病 125(pyricularia oryzae)抗絲核菌·茄鐮孢菌 125(Rhizoctonia solani)黑曲霉菌 125(Aspergillus niger)格鏈孢菌 500(Alternaria mali)葡萄晚腐病菌 500(Glomerella cingurata)水稻黃單胞菌 32(Xanthomonas oryzae)柑桔黃單胞菌 32(Xanthomonas citri)金色葡萄球菌 ＞500(Staphylococcus aureus)大腸埃希氏菌BE1186 ＞500(Escherichia coli BE1186)枯草桿菌 ＞500(Bacillus subtilis)紫外光譜中，在240nm(肩峰)處有吸收峰的抗生素能例舉出包扎霉素(Bandamycin)、查耳霉素(Chalcomycin)、中性霉素(Neutramycin)等。但它們的分子量分別為500、600、513，而且分子式也各不相同。因此可以判斷本發(fā)明所述的制黃肝菌素是一種與上述物質(zhì)有著明顯不同的新抗生素。
有效成份為制黃肝菌素的農(nóng)業(yè)園藝用殺菌劑本發(fā)明所述的有效成份用作農(nóng)業(yè)園藝用殺菌劑時(shí)，可同樣使用該技術(shù)領(lǐng)域：
中已知農(nóng)藥所通用的固相載體，液相載體及乳化分散劑等制劑，并能配制成顆粒劑、粉劑、乳化劑、可濕性粉劑、片劑、油劑、噴霧劑等任意的劑型。這些載體中固相載體可以是粘土、高嶺土、皂土、酸性白土、硅藻土、碳酸鈣、硝化纖維素、淀粉、阿拉伯膠等;液相載體可以是甲醇、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、乙二醇等。同時(shí)，在制劑中一般可適當(dāng)添加些輔助劑，如高級(jí)醇的硫酸酯、聚氧化乙烯、烷基烯丙基醚、烷基烯丙基聚乙二醇醚、烷基烯丙基無水山梨糖醇月桂酸酯、烷基烯丙基磺酸鹽、季胺鹽、聚烯化氧等。
一般而言，各制劑中有效成份的配比，在乳劑及可濕性粉劑中為10～90%;在粉劑及油劑中為0.1～10%。當(dāng)然，也可根據(jù)不同的使用目的而適當(dāng)增減。
本發(fā)明的制劑還可與其它殺菌劑、除草劑、殺蟲劑、肥料物質(zhì)、土壤改良劑等配合使用。
以下就本發(fā)明的制造、實(shí)施、試驗(yàn)事例作具體的說明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明有所限定。
其中〔%〕、〔比〕分別表示重量%、重量比。
制造例以葡萄糖2%、可溶性淀粉1%、肉汁浸膏0.1%、干酵母0.4%、大豆粉2.5%、食鹽0.2%、磷酸二氫鉀0.005%的配比制成培養(yǎng)基，將上述“SR-44菌株”接種于該培養(yǎng)基中，置于28℃振蕩培養(yǎng)96小時(shí)。取其培養(yǎng)濾液36升，于pH＝4的條件下用醋酸乙酯進(jìn)行抽提。提取液經(jīng)減壓濃縮后，即得4.8g油狀物。然后以氯仿-甲醇(2∶1)為溶劑，調(diào)制一根直徑為55mm、長(zhǎng)度為700mm的硅膠柱，并將試料溶于甲醇后在柱中展開。以每10ml為一計(jì)量，在NO101～140的區(qū)域里收集活性組份。
將上述活性組份的收集物減壓濃縮，得到1.0g濃縮物。此后，用高速液相色譜進(jìn)行分離制取制黃肝菌素的精制品。色譜柱可選用核苷5C18，直徑為20mm，長(zhǎng)度為30cm。溶劑采用甲醇-水(8∶2)，并添加1%的二乙胺·甲酸(pH＝7.5)。流速為8.0ml/分，壓力為170Kg/cm2，在展開時(shí)間為20分鐘時(shí)出現(xiàn)制黃肝菌素。收集制黃肝菌素的組分，用0.1N鹽酸調(diào)整到pH4，減壓濃縮直至除盡甲醇為止。用醋酸乙酯抽提、水洗、濃縮，最后得到100mg制黃肝菌素的粉末。
然后，再用高速液相色譜進(jìn)行精制。色譜柱為High-Carbon ODS直徑10mm，柱長(zhǎng)25cm，溶劑為甲醇-水-1%二乙胺。甲酸(pH7.0)(8∶1∶1)，流速1.4毫升/分，壓力150Kg/cm2，在展開時(shí)間為23分鐘時(shí)出現(xiàn)制黃肝菌素。收集制黃肝菌素的組分，用0.1N鹽酸調(diào)整到pH4，減壓濃縮直至除盡甲醇為止。用醋酸乙酯抽提，以0.1N鹽酸洗滌，再水洗、濃縮、冷凍干燥，可得40mg制黃肝菌素的白色粉末狀純品。
實(shí)施例1 可濕性粉劑將10份制黃肝菌素與5份十二烷基磺酸鈉，2份二苯甲烷-二磺酸鈉-甲醛聚合物及83份陶土混合，粉碎，即得100份制劑。
實(shí)施例2 乳劑將8份制黃肝菌素與10份乙二醇、20份二甲基甲酰胺、10份烷基、二甲基芐基氯化銨及52份甲醇混合溶解，即得到100份乳劑。
實(shí)施例3 粉劑將0.2份制黃肝菌素與0.5份硬脂酸鈣、50份滑石粉及49.3份陶土混合、粉碎，即得100份粉劑。
實(shí)施例4 顆粒劑將10份制黃肝菌素與15份淀粉、72份皂土粉及3份十二烷基硫酸鈉混合、粉碎，即得100份制劑。
試驗(yàn)例1對(duì)黃瓜灰霉病的防治試驗(yàn)將按實(shí)施例1所制成的可濕性粉劑稀釋至所定的濃度，然后噴灑到播種后生育15天的黃瓜(品種相橫半白)幼苗上，并進(jìn)行風(fēng)干。
將黃瓜灰霉病菌(Botorytis cinerea)置于土豆、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，用BLB光進(jìn)行照射使孢子誘發(fā)。將誘發(fā)后的孢子懸浮于10%葡萄糖和1%的酵母抽提溶液中。
藥液干燥后，將黃瓜移至接種箱，將上述懸浮液用噴霧器進(jìn)行噴霧接種，每10棵黃瓜幼苗約噴藥10cc。
接種后的黃瓜苗置于恒溫多濕的地方，4天后檢查發(fā)病的情況。
防治效果按下述方法進(jìn)行計(jì)算發(fā)病指數(shù) 發(fā)病程度0 不發(fā)病1 僅有病斑2 發(fā)病面積占10%以下3 發(fā)病面積占10%以上至20%以下4 發(fā)病面積占20%以上至30%以下5 發(fā)病面積占30%以上至40%以下6 發(fā)病面積占40%以上防治效果(%)＝(1- (處理區(qū)發(fā)病指數(shù)總和)/(對(duì)照區(qū)發(fā)病指數(shù)總和) )×100
其結(jié)果如表1所示表1試驗(yàn)化合物 噴灑濃度(ppm) 防治效果(%) 藥害制黃肝菌素 50 95 無25 91 無12.5 91 無6.25 91 無對(duì)照處理 - 0 -本發(fā)明的效果根據(jù)以上試驗(yàn)的結(jié)果可以證明，本發(fā)明所述的農(nóng)業(yè)園藝用殺菌劑，提供了一種新的殺菌劑。這種殺菌劑在低濃度下對(duì)植物病害也具有極高的防治效果，而且具有高度的安全性并無任何藥害。
附圖的說明圖1為本發(fā)明所述的抗生素制黃肝菌素的紫外吸收光譜圖。圖2為抗生素制黃肝菌素的紅外吸收光譜圖。
權(quán)利要求
1.一種新抗生素制黃肝菌素的制備方法，其特征在于培養(yǎng)屬于鏈霉菌(Streptomyces)屬的抗生素制黃肝菌素的生產(chǎn)菌，再?gòu)倪@些培養(yǎng)物中分離提取新抗生素制黃肝菌素。
2.按權(quán)利要求
1所述的制備方法，其特征在于所述的抗生素制黃肝菌素的生產(chǎn)菌為鏈霉菌SP·SR-44(Streptomyces SP·SR-44)。
3.一種農(nóng)業(yè)園藝用殺菌劑，其特征在于所含的有效成份為新抗生素制黃肝菌素。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種新抗生素制黃肝菌素及其制備方法，還提供了有效成分為制黃肝菌素的農(nóng)業(yè)園藝用殺菌劑。它既有強(qiáng)選擇性，又有高度安全性，對(duì)施用人員毫無影響，并且無任何藥害。本抗生素通過培養(yǎng)鏈霉菌SP·SR-44(Streptomyces SP·SR-44)而制得。
文檔編號(hào)A01N63/02GK86100575SQ86100575
公開日1987年11月18日 申請(qǐng)日期1986年5月10日
發(fā)明者成杏春, 磯野清, 梁風(fēng)群, 山口勇, 方仁萍, 黃耿堂, 周鈺, 木原剛, 沈寅初, 日下部寬男, 朱道荃, 見里朝正 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)藥研究所, 日本理化學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan