本發(fā)明涉及植物育種和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃精葉色突變體材料的創(chuàng)制方法。

背景技術(shù)：

黃精（polygonatumcyrtonemahua）系百合科黃精屬藥食兩用多年生植物。隨著人們對黃精藥理、藥化研究的逐步深入，黃精在臨床應(yīng)用、保健品、食品、化妝品及觀賞方面等方面的應(yīng)用越來越廣泛。《中國植物志》記載全世界約40種,我國有31種,2015年版《中國藥典》規(guī)定黃精、滇黃精、多花黃精的干燥根莖為黃精藥材原生藥。而其他的黃精屬植物雖不做藥材，但加以合理的開發(fā)和利用，可以作為觀賞花卉的新資源。黃精具有發(fā)達(dá)的貯存養(yǎng)分的根狀莖，易于林下和盆栽觀賞，將其作為地被植物種植于疏林草地、林下溪旁及建筑物陰面的綠地花壇、花境、花臺及草坪周圍來美化環(huán)境，無不適宜。

在植物的組織培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)細(xì)胞一直處于不斷的分生狀態(tài)，因此容易受到培養(yǎng)條件的影響而產(chǎn)生突變，但沒有特定的化學(xué)誘變劑誘變，突變率極低，且具有隨機(jī)性。迄今在植物育種技術(shù)領(lǐng)域上，尚無利用植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)，能穩(wěn)定得到突變體的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種黃精葉色突變體材料的創(chuàng)制方法，以解決上述問題。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種黃精葉色突變體材料的創(chuàng)制方法，包括以下步驟：

ⅰ.外植體的選取以及預(yù)處理：外植體選取為取黃精地下根莖為外植體。外植體預(yù)處理包括外植體分切、清洗以及消毒，外植體分切為將外植體分切成帶芽塊狀。

ⅱ.叢生芽誘導(dǎo)：將步驟ⅰ得到的外植體接入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)出叢生芽。

ⅲ.增殖壯苗培養(yǎng)：將步驟ⅱ得到的叢生芽接入增殖壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，直至叢生芽塊根膨大、芽體粗壯以及塊莖顏色變暗。

ⅳ.分化培養(yǎng)與突變體篩選：將步驟ⅲ得到的叢生芽接入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，直至分化苗長出葉片后，對比原始表型植株，通過葉片表型性狀篩選出葉片葉色突變?yōu)榻瘘S色或者葉片部分綠色缺失的突變體。

其中：上述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值為5.8。上述增殖壯苗培養(yǎng)基為：ms+多效唑15～30mg/l+白糖60g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值為5.8。上述分化培養(yǎng)基為：ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值為5.8。

進(jìn)一步地：

上述步驟ⅱ中的叢生芽誘導(dǎo)、上述步驟ⅲ中的增殖壯苗培養(yǎng)以及上述步驟ⅳ中的分化培養(yǎng)的處理時(shí)間均為40d。

上述步驟ⅱ中的叢生芽誘導(dǎo)、上述步驟ⅲ中的增殖壯苗培養(yǎng)以及上述步驟ⅳ中的分化培養(yǎng)的處理?xiàng)l件均為：溫度為25±2℃、光照為12h/d以及光照強(qiáng)度為2000lx。

更進(jìn)一步地：

一種黃精葉色突變體材料的創(chuàng)制方法，還包括以下步驟：

ⅴ.突變體材料擴(kuò)繁：將步驟ⅳ中篩選出的突變體轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，得到穩(wěn)定的突變體材料。

ⅵ.突變體材料生根培養(yǎng)：將步驟ⅴ中得到的突變體材料接種至生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。

ⅶ.煉苗移栽：將步驟ⅵ中得到的突變體植株洗掉培養(yǎng)基后，移栽到基質(zhì)上。

其中：上述增殖培養(yǎng)基為：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值為5.8。上述生根培養(yǎng)基為：ms+6-ba0.1mg/l+naa0.5mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值為5.8。上述基質(zhì)為泥炭及珍珠巖基質(zhì)。

上述步驟ⅴ中將突變體培養(yǎng)至4cm至5cm高度。

上述步驟ⅰ中的外植體預(yù)處理包括以下步驟：

ⅰ.將外植體分切成帶芽塊狀后用洗衣粉溶液擦洗外植體，而后用流水沖洗外植體直至將其表面的洗衣粉溶液去除。

ⅱ.將步驟ⅰ處理后的外植體置于1/700濃度的甲基托布津中浸泡30min后取出，置于常溫條件，將其晾干。

ⅲ.將步驟ⅱ處理后的外植體在超凈工作臺上用濃度為75%的乙醇處理30s后，用濃度為0.1%的升汞消毒8-10min。

ⅳ.將步驟ⅲ處理后的外植體用無菌水清洗后，用無菌濾紙將無菌水吸干。

上述步驟ⅰ中的上述外植體選取無病蟲害及健壯的黃精地下根莖為外植體，外植體選取時(shí)間為每年9月份或者10月份。

上述步驟ⅰ中的上述外植體分切為將外植體分切成0.5cm*0.5cm的帶芽塊狀。

由上述對本發(fā)明的描述可知，和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

第一，本發(fā)明的黃精葉色突變體材料的創(chuàng)制方法通過組織培養(yǎng)獲得大量一致的黃精無菌叢生芽，利用一定濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑配合處理，得到穩(wěn)定的葉片表型性狀突變的植物種質(zhì)資源，方法簡單易行，重復(fù)性好。

第二，本發(fā)明的黃精葉色突變體材料的創(chuàng)制方法所用到的植物生長調(diào)節(jié)劑為農(nóng)業(yè)常用的植物生長調(diào)節(jié)劑，其本身不具備使植株突變的作用，但通過本發(fā)明的方法步驟，卻可以得到穩(wěn)定的突變體材料，相比當(dāng)前常用的突變體創(chuàng)制化學(xué)誘變劑ems（甲基磺酸乙酯：一種嚴(yán)重的致癌物之一，使用中和廢液處理時(shí)都必須十分注意防范，防治誘導(dǎo)癌癥），具有無毒、使用安全、對環(huán)境無污染等優(yōu)點(diǎn)。

第三，本發(fā)明的黃精葉色突變體材料的創(chuàng)制方法在特定的階段，采取一定濃度的生長調(diào)節(jié)劑配合處理，得到穩(wěn)定的葉色突變體材料，突變率可達(dá)0.65%以上。并且本發(fā)明的黃精葉色突變體材料的創(chuàng)制方法得到的葉色突變體黃精種質(zhì)材料，為黃精育種提供新資源，為擴(kuò)展黃精的用途，特別是觀賞用途，促進(jìn)黃精育種和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，都具有十分重要的意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的黃精葉色突變體材料的創(chuàng)制方法創(chuàng)建的突變植株與正常植株對比。

圖2為本發(fā)明的黃精葉色突變體材料的創(chuàng)制方法中大棚栽培的葉色突變馴化苗與正常苗對比。

圖中，1為突變植株；2為正常植株；3為葉色突變?yōu)榻瘘S色的馴化苗；4為葉片部分綠色缺失的馴化苗；5為正常馴化苗。

具體實(shí)施方式

本具體實(shí)施方式適用的材料包括：

多效唑，上海伊卡生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，一種農(nóng)業(yè)常用的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有延緩植物生長，抑制莖稈伸長，縮短節(jié)間、促進(jìn)植物分蘗、增加植物抗逆性能，提高產(chǎn)量等效果。

6-ba（6-芐氨基嘌呤），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，一種組培常用的細(xì)胞分裂素，主要作用是促進(jìn)芽的形成,也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生,可抑制葉綠素的降解，提高氨基酸的含量，延緩葉片衰老等。

naa（萘乙酸），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑，主要作用是能促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)形成不定根等。

參考圖1、圖2，一種黃精葉色突變體材料的創(chuàng)制方法，包括以下步驟：

ⅰ.外植體的選取以及預(yù)處理：上述外植體選取為取無病蟲害及健壯的黃精地下根莖為外植體，選取時(shí)間為每年9月份或者10月份。

上述外植體預(yù)處理包括以下步驟：

ⅰ.將外植體分切后用洗衣粉溶液擦洗外植體，而后用流水沖洗外植體直至將其表面的洗衣粉溶液去除。上述外植體分切為將外植體分切成0.5cm*0.5cm的帶芽塊狀。

ⅱ.將步驟ⅰ處理后的外植體置于1/700濃度的甲基托布津中浸泡30min后取出，置于常溫條件，將其晾干。

ⅲ.將步驟ⅱ處理后的外植體在超凈工作臺上用濃度為75%的乙醇處理30s后，用濃度為0.1%的升汞消毒8-10min。

ⅳ.將步驟ⅲ處理后的外植體用無菌水清洗3-4遍后，用無菌濾紙將無菌水吸干。

ⅱ.叢生芽誘導(dǎo)：將步驟ⅰ得到的外植體接入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)時(shí)間為40d。上述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值為5.8。

ⅲ.增殖壯苗培養(yǎng)：將步驟ⅱ得到的叢生芽接入增殖壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，直至叢生芽塊根膨大、芽體粗壯以及塊莖顏色變暗，培養(yǎng)時(shí)間為40d。上述增殖壯苗培養(yǎng)基為：ms+多效唑+白糖60g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值為5.8。其中，多效唑濃度優(yōu)選為15～30mg/l。本具體實(shí)施方式中優(yōu)選通過4組多效唑濃度分別為0mg/l、15mg/l、30mg/l、50mg/l的該增殖壯苗培養(yǎng)基進(jìn)行處理，每個處理叢生芽塊數(shù)50個，重復(fù)3次取平均值。

ⅳ.分化培養(yǎng)與突變體篩選：將步驟ⅲ得到的叢生芽接入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，分化苗長出葉片后，對比原始表型植株，通過葉片表型性狀篩選出突變體，培養(yǎng)時(shí)間40d。該葉片表型性狀為葉片葉色突變?yōu)榻瘘S色或者葉片部分綠色缺失。上述分化培養(yǎng)基為：ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值為5.8。

其中，不同多效唑濃度對黃精叢生芽誘變的影響參見以下表1：

ⅴ.突變體材料擴(kuò)繁：將步驟ⅳ中篩選出的突變體轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，得到穩(wěn)定的突變體材料，并培養(yǎng)至4cm至5cm高度。上述增殖培養(yǎng)基為：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值為5.8。

ⅵ.突變體材料生根培養(yǎng)：將步驟ⅴ中得到的突變體材料接種至生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。上述生根培養(yǎng)基為：ms+6-ba0.1mg/l+naa0.5mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值為5.8。

ⅶ.煉苗移栽：將步驟ⅵ中得到的突變體植株洗掉培養(yǎng)基后，移栽到泥炭及珍珠巖基質(zhì)上，并置于溫室大棚中，蓋上薄膜和陰網(wǎng)，20～30d后掀開陰網(wǎng)和薄膜正常管理即可。

本具體實(shí)施方式采用的各組培階段的培養(yǎng)條件是：溫度25±2℃、光照12h/d以及光照強(qiáng)度2000lx。

本具體實(shí)施方式中，以多效唑濃度為15mg/l～50mg/l的上述增殖壯苗培養(yǎng)基處理黃精叢生芽,均能得到突變體材料。以多效唑濃度為30mg/l的增殖壯苗培養(yǎng)基處理黃精叢生芽，得到的突變率最高，為0.88%，突變體植株粗壯，生長正常。以多效唑濃度為50mg/l的增殖壯苗培養(yǎng)基處理黃精叢生芽，得到的突變率最低，為0.45%，且突變體植株出現(xiàn)矮化現(xiàn)象。以多效唑濃度為0mg/l的增殖壯苗培養(yǎng)基處理黃精叢生芽，未篩選到突變體。因此優(yōu)選以多效唑濃度為15mg/l～30mg/l的增殖壯苗培養(yǎng)基處理黃精叢生芽。

上述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的設(shè)計(jì)構(gòu)思并不局限于此，凡利用此構(gòu)思對本發(fā)明進(jìn)行非實(shí)質(zhì)性的改動，均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護(hù)范圍的行為。