本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的，本發(fā)明涉及一種建立肺泡球蚴病動(dòng)物模型方法的
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：包蟲病是一種多發(fā)于牧區(qū)的人獸共患寄生蟲病，主要由細(xì)粒棘球絳蟲(echinococcusgranulosus.eg)的幼體和多房棘球絳蟲(echinococcusmultilocularis.em)的幼體感染人體發(fā)生。其中多房棘球絳蟲幼體(泡球蚴)導(dǎo)致的泡型包蟲病由于其包囊具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，又稱泡球蚴病(alveolarechinococcosis，ae)，造成該病極難治愈，被稱為“蟲癌”。在包蟲病高流行地區(qū)，包蟲病已成為制約當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展、影響社會(huì)安定的公共衛(wèi)生問題。人類包蟲病中15％以上是肺包蟲病，而目前報(bào)道的包蟲病動(dòng)物模型，多是用各種動(dòng)物建立的腹腔動(dòng)物模型，未見理想的肺包蟲病動(dòng)物模型報(bào)道，因此，建立合適的肺包蟲病動(dòng)物模型，對(duì)肺包蟲病的發(fā)生、治療和預(yù)防具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，為人類建立動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種仍然較少，尚不能滿足現(xiàn)有已存在和不斷增加的疾病防治和科學(xué)研究的需要。而尋找體型小，模擬人類疾病動(dòng)物模型準(zhǔn)確、模型周期短、易于飼養(yǎng)繁殖的動(dòng)物種類成為豐富實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新品種的重要途徑。在這種方向的指引下，被逐步馴化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新品種的主要來(lái)源。國(guó)內(nèi)已馴養(yǎng)成功和正在馴化開發(fā)的有5-6種，已被國(guó)內(nèi)認(rèn)可的新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如黑線倉(cāng)鼠和長(zhǎng)爪沙鼠，已在生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，而且是多種疾病和病原的模型動(dòng)物。子午沙鼠(merionesmeridianus)屬嚙齒目(rodentia)、倉(cāng)鼠科(cricetidae)、沙鼠亞科(gerbillinae)、沙鼠屬(meriones)，是歐亞大陸中部荒漠、半荒漠的鼠種，具有體積小、性情溫和、繁殖力強(qiáng)、性成熟早、易馴眠和易飼養(yǎng)等特點(diǎn)。作為和長(zhǎng)瓜沙鼠同屬一個(gè)屬的子午沙鼠，在生物學(xué)方面兩者具有相似性，但體型只有長(zhǎng)瓜沙鼠的2/3，用小鼠盒就能飼養(yǎng)繁殖。長(zhǎng)瓜沙鼠體型大，需要用中鼠盒飼養(yǎng)繁殖，空間是小鼠盒的兩倍，飼料消耗比子午沙鼠多三分之一。與長(zhǎng)瓜沙鼠相比，子午沙鼠在飼養(yǎng)空間和飼料消耗方面具明顯的優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)有報(bào)道顯示，用細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴腹腔感染子午沙鼠，發(fā)現(xiàn)該鼠對(duì)兩種棘球蚴的感染效果都明顯優(yōu)于現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。動(dòng)物模型的制備，尤其是模擬自然感染途徑，是進(jìn)行包蟲病研究的基礎(chǔ)。目前泡球蚴感染小鼠模型有四種造模方式：開腹直視肝臟穿刺接種、經(jīng)皮肝穿刺接種、門靜脈系側(cè)枝血管(回盲部靜脈)穿刺接種和腹腔穿刺接種。這四種造模方式均是適用于制備肝包蟲病動(dòng)物模型，且這四種方法具有肝易損傷、腹腔易感染的缺點(diǎn)，不能很好的反映肝臟原發(fā)病灶的生長(zhǎng)情況，更不適用于肺包蟲病動(dòng)物模型的建立。例如中國(guó)專利cn106236318a，公開了一種泡球蚴經(jīng)肝門靜脈途徑感染肝臟的泡型包蟲病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，該專利主要是經(jīng)肝門靜脈途徑感染肝臟，從而建立肝包蟲病動(dòng)物模型。現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于肺包蟲病動(dòng)物模型報(bào)道極少，僅有一篇文獻(xiàn)是申請(qǐng)人在研究子午沙鼠習(xí)性時(shí)，向國(guó)家申請(qǐng)了自然科學(xué)基金《子午沙鼠清潔級(jí)種群及其肺包蟲病動(dòng)物模型的建立》項(xiàng)目，項(xiàng)目中記載的內(nèi)容僅僅是申請(qǐng)人初期對(duì)子午沙鼠的研究，這為如何建立肺包蟲病動(dòng)物模型奠定了基礎(chǔ)，但如何成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型，仍需要進(jìn)行進(jìn)一步研究，不能夠獲得解決子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型構(gòu)建技術(shù)的突破。因此，需要在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上建立一種更接近自然感染途徑、感染率高，以及病灶原發(fā)于肺的泡型包蟲病動(dòng)物模型，建立肺包蟲病動(dòng)物模型對(duì)研究人類肝包蟲病的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)防具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)利用子午沙鼠建立肺泡球蚴病動(dòng)物模型的報(bào)道較少，且現(xiàn)有建模方法存在感染率高、造模周期長(zhǎng)，不適用于子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在于提供一種子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，通過(guò)采用試驗(yàn)動(dòng)物的篩選、剖取沖洗包囊、制備原頭節(jié)懸液、鏡檢原頭節(jié)、麻醉子午沙鼠、建模等一系列的技術(shù)手段，創(chuàng)造性的提供了一種子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，成功構(gòu)建一種子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型，60d包囊組織幾乎長(zhǎng)滿整個(gè)胸腔并完全包裹肺臟，15d、45d、60d子午沙鼠包囊系數(shù)較balb/c小鼠包囊系數(shù)均有顯著差異，本發(fā)明提供的子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法具有成模率高、感染率低、造模周期短、成本低以及重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
具有廣泛地實(shí)用性。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案：本發(fā)明提供一種子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，具體構(gòu)建方法步驟如下：(1)試驗(yàn)動(dòng)物：選取清潔級(jí)封閉群子午沙鼠40只，8-12周齡，雌雄各半，清潔級(jí)balb/c小鼠40只，8-10周齡，雌雄各半。(2)子午沙鼠的飼養(yǎng)：采用常規(guī)飼養(yǎng)模式，飼料類型為鈷60輻照大小鼠維持飼料，自由采食，每周添加飼喂胡蘿卜10g/只、葵花籽5g/只，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理。(3)剖取包囊：二氧化碳麻醉處死多房棘球絳蟲傳代balb/c小鼠，采用無(wú)菌手術(shù)剖取多房棘球絳蟲包囊。(4)研磨沖洗包囊：剪碎包囊置于研缽內(nèi)研磨，充分研磨后過(guò)80目篩網(wǎng)，同時(shí)以雙抗溶液沖洗篩網(wǎng)，留取濾液。(5)制備原頭節(jié)懸液：采用50ml注射器吸入濾液，加雙抗溶液沉淀原頭節(jié)，排出上清液，反復(fù)三次，留取原頭節(jié)懸液。(6)鏡檢原頭節(jié)：混勻原頭節(jié)懸液，用0.5％伊紅染色后滴入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，同時(shí)鏡檢原頭節(jié)活力，原頭節(jié)活力在95％以上方可接種動(dòng)物，計(jì)數(shù)后調(diào)整原頭節(jié)懸液濃度至4000-5000個(gè)/ml。(7)麻醉子午沙鼠：對(duì)子午沙鼠麻醉處理，在頸部氣管處備皮，固定動(dòng)物于手術(shù)臺(tái)，碘伏酒精消毒手術(shù)區(qū)域。(8)建模：沿氣管方向切開頸部皮膚鈍性分離頜下腺及肌肉，暴露氣管，將混勻的原頭節(jié)懸液0.02-0.03ml注射入氣管內(nèi)，注射后針頭置于氣管內(nèi)停留8-10s，防止動(dòng)物嗆咳造成懸液外溢，退針后還納頜下腺，縫合皮膚，消毒手術(shù)創(chuàng)口，將動(dòng)物置于28-32℃恒溫環(huán)境至蘇醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型。采用子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建后，需要做好術(shù)后處理，術(shù)后每日以碘伏消毒手術(shù)創(chuàng)口，連續(xù)三日。本發(fā)明中，雙抗溶液由青霉素50萬(wàn)單位、鏈霉素50萬(wàn)單位溶于500ml0.9％無(wú)菌生理鹽水制備獲得。本發(fā)明中，對(duì)子午沙鼠麻醉處理時(shí)，取子午沙鼠以0.5ml/100g劑量腹腔注射1％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉處理。本發(fā)明中，鏡檢原頭節(jié)步驟中，計(jì)數(shù)后調(diào)整原頭節(jié)懸液濃度至5000個(gè)/ml。本發(fā)明中，建模步驟中，將混勻的原頭節(jié)懸液0.02ml注射入氣管內(nèi)，注射后針頭置于氣管內(nèi)停留10s。本發(fā)明中，恒溫環(huán)境的溫度為30℃。通過(guò)實(shí)施本發(fā)明具體的
發(fā)明內(nèi)容可以達(dá)到以下有益效果：(1)本發(fā)明提供的一種子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，通過(guò)采用試驗(yàn)動(dòng)物的篩選、剖取沖洗包囊、制備原頭節(jié)懸液、鏡檢原頭節(jié)、麻醉子午沙鼠、建模等一系列的技術(shù)手段，能夠成功構(gòu)建子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型，克服了沒有相關(guān)動(dòng)物模型對(duì)于包蟲病病證機(jī)制的研究的限制，具有成模率高、感染率低、造模周期短、成本低以及重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
具有廣泛地實(shí)用性。(2)采用本發(fā)明提供的一種子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，分別于造模后15d、30d、45d、60d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)模型建立情況，比較子午沙鼠與balb/c小鼠經(jīng)氣管感染多房棘球絳蟲包囊解剖結(jié)果，解剖后可見子午沙鼠接種多房棘球絳蟲原頭節(jié)15d肺組織表面出現(xiàn)較多不規(guī)則白色突起，30d形成明顯包囊，45d包囊組織迅速增長(zhǎng)，60d包囊組織幾乎長(zhǎng)滿整個(gè)胸腔并完全包裹肺臟。balb/c小鼠接種15d后肺臟表面未見明顯異常，30d肺臟表面形成不規(guī)則突起，45d可觀察到單發(fā)的包囊，60d包囊數(shù)量、體積較45d均有增加。感染動(dòng)物肺組織分離包囊后測(cè)算包囊系數(shù)，15d、45d、60d子午沙鼠包囊系數(shù)較balb/c小鼠包囊系數(shù)均有顯著差異(p＜0.05)。(3)采用本發(fā)明提供的一種子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法后，對(duì)所有感染動(dòng)物肺組織提取進(jìn)行cox1基因pcr檢測(cè)，15d時(shí)子午沙鼠有6只感染多房棘球蚴呈強(qiáng)陽(yáng)性，而balb/c小鼠只有2只；30d和45d子午沙鼠感染強(qiáng)陽(yáng)性均為7只，balb/c小鼠感染強(qiáng)陽(yáng)性分別為4只和3只；60d子午沙鼠感染8只均為強(qiáng)陽(yáng)性，balb/c小鼠為4只。(4)采用本發(fā)明提供的一種子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法后，對(duì)子午沙鼠和balb/c小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織切片進(jìn)行病理學(xué)診斷，第15d時(shí)可見肺泡間隔增厚，炎細(xì)胞浸潤(rùn)伴有出血，血管周圍炎形成，主要為嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。第30d，炎癥反應(yīng)加劇，并有纖維素囊形成趨勢(shì)，周圍大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。第45d，肺組織內(nèi)大量囊腔形成，棘球蚴包囊形成，角質(zhì)層和生發(fā)層可見，囊內(nèi)有脫落的包囊砂(棘球砂)。第60d，肺組織被大量囊腔取代，棘球蚴包囊形成，角質(zhì)層和生發(fā)層可見，腔內(nèi)散在大量原頭蚴，鈣顆粒形態(tài)尋常，部分能看到囊液。而balb/c小鼠第15d肺組織形態(tài)正常，無(wú)明顯病理性改變，第30d可見炎性肉芽腫形成，單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞為主，并可見巨嗜細(xì)胞，第45d肺泡間隔增厚，炎細(xì)胞浸潤(rùn)伴有出血，血管周圍炎初步形成，第60d炎癥反應(yīng)加劇，彌漫性炎細(xì)胞浸潤(rùn)伴有出血，血管周圍炎形成。附圖說(shuō)明圖1顯示為子午沙鼠經(jīng)氣管感染多房棘球絳蟲后的解剖觀察結(jié)果。圖2顯示為balb/c小鼠經(jīng)氣管感染多房棘球絳蟲后的解剖觀察結(jié)果。圖3顯示為子午沙鼠與balb/c小鼠經(jīng)氣管感染多房棘球絳蟲肺組織cox1基因pcr檢測(cè)結(jié)果。圖4顯示為子午沙鼠經(jīng)氣管感染多房棘球絳蟲肺組織病理切片。圖5顯示為balb/c小鼠經(jīng)氣管感染多房棘球絳蟲肺組織病理切片。具體實(shí)施方式下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明所使用的主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)封閉群子午沙鼠40只，8～12周齡，雌雄各半；清潔級(jí)balb/c小鼠40只，8～10周齡，雌雄各半，均有新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供(生產(chǎn)許可：scxk(新))。本發(fā)明所使用的主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料：鈷60輻照大小鼠維持飼料，胡蘿卜，葵花籽。本發(fā)明所使用的感染材料：多房棘球絳蟲原頭節(jié)，由新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心balb/c小鼠體內(nèi)保種傳代。本發(fā)明所使用的實(shí)驗(yàn)試劑和儀器屬于本領(lǐng)域常見，其選用的試劑濃度和單位屬于本領(lǐng)域熟知方式：0.5％伊紅、95％以上原頭節(jié)活力、雙抗溶液、青霉素50萬(wàn)單位、鏈霉素50萬(wàn)單位溶于500ml0.9％無(wú)菌生理鹽水；麻醉劑：1％戊巴比妥鈉(美國(guó)默克公司)0.9％無(wú)菌生理鹽水溶液。dp-304組織基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；多房棘球絳蟲cox1基因引物(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)；pcrmastermix、dnamarker、核酸染料均購(gòu)自德國(guó)凱杰(qiagen)公司；he染色相關(guān)試劑均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵照新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，樣本取材程序符合新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用麻醉劑，最大限度的減少小動(dòng)物的術(shù)后疼痛。實(shí)施例一：子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建的具體步驟如下：(1)試驗(yàn)動(dòng)物：選取清潔級(jí)封閉群子午沙鼠40只，8-12周齡，雌雄各半，清潔級(jí)balb/c小鼠40只，8-10周齡，雌雄各半。(2)子午沙鼠的飼養(yǎng)：采用常規(guī)飼養(yǎng)模式，飼料類型：鈷60輻照大小鼠維持飼料，自由采食，每周添加飼喂胡蘿卜10g/只、葵花籽5g/只，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理。(3)剖取包囊：二氧化碳麻醉處死多房棘球絳蟲傳代balb/c小鼠，采用無(wú)菌手術(shù)剖取多房棘球絳蟲包囊。(4)研磨沖洗包囊：剪碎包囊置于研缽內(nèi)研磨，充分研磨后過(guò)80目篩網(wǎng)，同時(shí)以雙抗溶液沖洗篩網(wǎng)，留取濾液。(5)制備原頭節(jié)懸液：采用50ml注射器吸入濾液，加雙抗溶液沉淀原頭節(jié)，排出上清液，反復(fù)三次，留取原頭節(jié)懸液。(6)鏡檢原頭節(jié)：混勻原頭節(jié)懸液，用0.5％伊紅染色后滴入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，同時(shí)鏡檢原頭節(jié)活力，原頭節(jié)活力在95％以上方可接種動(dòng)物，計(jì)數(shù)后調(diào)整原頭節(jié)懸液濃度至4000-5000個(gè)/ml。(7)麻醉子午沙鼠：對(duì)子午沙鼠麻醉處理，在頸部氣管處備皮，固定動(dòng)物于手術(shù)臺(tái)，碘伏酒精消毒手術(shù)區(qū)域。(8)建模：沿氣管方向切開頸部皮膚鈍性分離頜下腺及肌肉，暴露氣管，將混勻的原頭節(jié)懸液0.02-0.03ml注射入氣管內(nèi)，注射后針頭置于氣管內(nèi)停留8-10s，防止動(dòng)物嗆咳造成懸液外溢，退針后還納頜下腺，縫合皮膚，消毒手術(shù)創(chuàng)口，將動(dòng)物置于28-32℃恒溫環(huán)境至蘇醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型。經(jīng)過(guò)上述，采用子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法后，進(jìn)行必要的術(shù)后處理：術(shù)后每日以碘伏消毒手術(shù)創(chuàng)口，連續(xù)三日。本發(fā)明中，雙抗溶液由青霉素50萬(wàn)單位、鏈霉素50萬(wàn)單位溶于500ml0.9％無(wú)菌生理鹽水制備獲得。本發(fā)明中，對(duì)子午沙鼠麻醉處理時(shí)，取子午沙鼠以0.5ml/100g劑量腹腔注射1％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉處理。本發(fā)明中，鏡檢原頭節(jié)步驟中，計(jì)數(shù)后調(diào)整原頭節(jié)懸液濃度至5000個(gè)/ml。本發(fā)明中，建模步驟中，將混勻的原頭節(jié)懸液0.02ml注射入氣管內(nèi)，注射后針頭置于氣管內(nèi)停留10s。本發(fā)明中，恒溫環(huán)境的溫度為30℃。實(shí)施例二：選取清潔級(jí)封閉群子午沙鼠40只，8-12周齡，雌雄各半，清潔級(jí)balb/c小鼠40只，8-10周齡，雌雄各半，均采用常規(guī)飼養(yǎng)模式，自由采食鈷60輻照大小鼠維持飼料，每周添加飼喂胡蘿卜10g/只、葵花籽5g/只，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理。二氧化碳麻醉處死多房棘球絳蟲傳代balb/c小鼠，采用無(wú)菌手術(shù)剖取多房棘球絳蟲包囊，剪碎包囊置于研缽內(nèi)研磨，充分研磨后過(guò)80目篩網(wǎng)，同時(shí)采用以青霉素50萬(wàn)單位、鏈霉素50萬(wàn)單位溶于500ml0.9％無(wú)菌生理鹽水制備的雙抗溶液沖洗篩網(wǎng)，采用50ml注射器吸入濾液，加雙抗溶液沉淀原頭節(jié)，排出上清液，反復(fù)三次，混勻原頭節(jié)懸液，用0.5％伊紅染色后滴入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，同時(shí)鏡檢原頭節(jié)活力，原頭節(jié)活力在95％以上方可接種動(dòng)物，計(jì)數(shù)后調(diào)整原頭節(jié)懸液濃度至4000個(gè)/ml。取子午沙鼠以0.5ml/100g劑量腹腔注射1％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉處理，在頸部氣管處備皮，固定動(dòng)物于手術(shù)臺(tái)，碘伏酒精消毒手術(shù)區(qū)域。沿氣管方向切開頸部皮膚鈍性分離頜下腺及肌肉，暴露氣管，將混勻的原頭節(jié)懸液0.02ml注射入氣管內(nèi)，注射后針頭置于氣管內(nèi)停留8s，防止動(dòng)物嗆咳造成懸液外溢，退針后還納頜下腺，縫合皮膚，消毒手術(shù)創(chuàng)口，將動(dòng)物置于28℃恒溫環(huán)境至蘇醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型。術(shù)后每日以碘伏消毒手術(shù)創(chuàng)口，連續(xù)三日。實(shí)施例三：選取清潔級(jí)封閉群子午沙鼠40只，8-12周齡，雌雄各半，清潔級(jí)balb/c小鼠40只，8-10周齡，雌雄各半，均采用常規(guī)飼養(yǎng)模式，自由采食鈷60輻照大小鼠維持飼料，每周添加飼喂胡蘿卜10g/只、葵花籽5g/只，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理。二氧化碳麻醉處死多房棘球絳蟲傳代balb/c小鼠，采用無(wú)菌手術(shù)剖取多房棘球絳蟲包囊，剪碎包囊置于研缽內(nèi)研磨，充分研磨后過(guò)80目篩網(wǎng)，同時(shí)采用以青霉素50萬(wàn)單位、鏈霉素50萬(wàn)單位溶于500ml0.9％無(wú)菌生理鹽水制備的雙抗溶液沖洗篩網(wǎng)，采用50ml注射器吸入濾液，加雙抗溶液沉淀原頭節(jié)，排出上清液，反復(fù)三次，混勻原頭節(jié)懸液，用0.5％伊紅染色后滴入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，同時(shí)鏡檢原頭節(jié)活力，原頭節(jié)活力在95％以上方可接種動(dòng)物，計(jì)數(shù)后調(diào)整原頭節(jié)懸液濃度至5000個(gè)/ml。取子午沙鼠以0.5ml/100g劑量腹腔注射1％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉處理，在頸部氣管處備皮，固定動(dòng)物于手術(shù)臺(tái)，碘伏酒精消毒手術(shù)區(qū)域。沿氣管方向切開頸部皮膚鈍性分離頜下腺及肌肉，暴露氣管，將混勻的原頭節(jié)懸液0.03ml注射入氣管內(nèi)，注射后針頭置于氣管內(nèi)停留9s，防止動(dòng)物嗆咳造成懸液外溢，退針后還納頜下腺，縫合皮膚，消毒手術(shù)創(chuàng)口，將動(dòng)物置于29℃恒溫環(huán)境至蘇醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型。術(shù)后每日以碘伏消毒手術(shù)創(chuàng)口，連續(xù)三日。實(shí)施例四：選取清潔級(jí)封閉群子午沙鼠40只，8-12周齡，雌雄各半，清潔級(jí)balb/c小鼠40只，8-10周齡，雌雄各半，均采用常規(guī)飼養(yǎng)模式，自由采食鈷60輻照大小鼠維持飼料，每周添加飼喂胡蘿卜10g/只、葵花籽5g/只，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理。二氧化碳麻醉處死多房棘球絳蟲傳代balb/c小鼠，采用無(wú)菌手術(shù)剖取多房棘球絳蟲包囊，剪碎包囊置于研缽內(nèi)研磨，充分研磨后過(guò)80目篩網(wǎng)，同時(shí)采用以青霉素50萬(wàn)單位、鏈霉素50萬(wàn)單位溶于500ml0.9％無(wú)菌生理鹽水制備的雙抗溶液沖洗篩網(wǎng)，采用50ml注射器吸入濾液，加雙抗溶液沉淀原頭節(jié)，排出上清液，反復(fù)三次，混勻原頭節(jié)懸液，用0.5％伊紅染色后滴入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，同時(shí)鏡檢原頭節(jié)活力，原頭節(jié)活力在95％以上方可接種動(dòng)物，計(jì)數(shù)后調(diào)整原頭節(jié)懸液濃度至4000個(gè)/ml。取子午沙鼠以0.5ml/100g劑量腹腔注射1％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉處理，在頸部氣管處備皮，固定動(dòng)物于手術(shù)臺(tái)，碘伏酒精消毒手術(shù)區(qū)域。沿氣管方向切開頸部皮膚鈍性分離頜下腺及肌肉，暴露氣管，將混勻的原頭節(jié)懸液0.02ml注射入氣管內(nèi)，注射后針頭置于氣管內(nèi)停留10s，防止動(dòng)物嗆咳造成懸液外溢，退針后還納頜下腺，縫合皮膚，消毒手術(shù)創(chuàng)口，將動(dòng)物置于31℃恒溫環(huán)境至蘇醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型。術(shù)后每日以碘伏消毒手術(shù)創(chuàng)口，連續(xù)三日。實(shí)施例五：選取清潔級(jí)封閉群子午沙鼠40只，8-12周齡，雌雄各半，清潔級(jí)balb/c小鼠40只，8-10周齡，雌雄各半，均采用常規(guī)飼養(yǎng)模式，自由采食鈷60輻照大小鼠維持飼料，每周添加飼喂胡蘿卜10g/只、葵花籽5g/只，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理。二氧化碳麻醉處死多房棘球絳蟲傳代balb/c小鼠，采用無(wú)菌手術(shù)剖取多房棘球絳蟲包囊，剪碎包囊置于研缽內(nèi)研磨，充分研磨后過(guò)80目篩網(wǎng)，同時(shí)采用以青霉素50萬(wàn)單位、鏈霉素50萬(wàn)單位溶于500ml0.9％無(wú)菌生理鹽水制備的雙抗溶液沖洗篩網(wǎng)，采用50ml注射器吸入濾液，加雙抗溶液沉淀原頭節(jié)，排出上清液，反復(fù)三次，混勻原頭節(jié)懸液，用0.5％伊紅染色后滴入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，同時(shí)鏡檢原頭節(jié)活力，原頭節(jié)活力在95％以上方可接種動(dòng)物，計(jì)數(shù)后調(diào)整原頭節(jié)懸液濃度至4500個(gè)/ml。取子午沙鼠以0.5ml/100g劑量腹腔注射1％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉處理，在頸部氣管處備皮，固定動(dòng)物于手術(shù)臺(tái)，碘伏酒精消毒手術(shù)區(qū)域。沿氣管方向切開頸部皮膚鈍性分離頜下腺及肌肉，暴露氣管，將混勻的原頭節(jié)懸液0.02ml注射入氣管內(nèi)，注射后針頭置于氣管內(nèi)停留9s，防止動(dòng)物嗆咳造成懸液外溢，退針后還納頜下腺，縫合皮膚，消毒手術(shù)創(chuàng)口，將動(dòng)物置于30℃恒溫環(huán)境至蘇醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型。術(shù)后每日以碘伏消毒手術(shù)創(chuàng)口，連續(xù)三日。實(shí)施例六：選取清潔級(jí)封閉群子午沙鼠40只，8-12周齡，雌雄各半，清潔級(jí)balb/c小鼠40只，8-10周齡，雌雄各半，均采用常規(guī)飼養(yǎng)模式，自由采食鈷60輻照大小鼠維持飼料，每周添加飼喂胡蘿卜10g/只、葵花籽5g/只，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理。二氧化碳麻醉處死多房棘球絳蟲傳代balb/c小鼠，采用無(wú)菌手術(shù)剖取多房棘球絳蟲包囊，剪碎包囊置于研缽內(nèi)研磨，充分研磨后過(guò)80目篩網(wǎng)，同時(shí)采用以青霉素50萬(wàn)單位、鏈霉素50萬(wàn)單位溶于500ml0.9％無(wú)菌生理鹽水制備的雙抗溶液沖洗篩網(wǎng)，采用50ml注射器吸入濾液，加雙抗溶液沉淀原頭節(jié)，排出上清液，反復(fù)三次，混勻原頭節(jié)懸液，用0.5％伊紅染色后滴入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，同時(shí)鏡檢原頭節(jié)活力，原頭節(jié)活力在95％以上方可接種動(dòng)物，計(jì)數(shù)后調(diào)整原頭節(jié)懸液濃度至5000個(gè)/ml。取子午沙鼠以0.5ml/100g劑量腹腔注射1％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉處理，在頸部氣管處備皮，固定動(dòng)物于手術(shù)臺(tái)，碘伏酒精消毒手術(shù)區(qū)域。沿氣管方向切開頸部皮膚鈍性分離頜下腺及肌肉，暴露氣管，將混勻的原頭節(jié)懸液0.03ml注射入氣管內(nèi)，注射后針頭置于氣管內(nèi)停留10s，防止動(dòng)物嗆咳造成懸液外溢，退針后還納頜下腺，縫合皮膚，消毒手術(shù)創(chuàng)口，將動(dòng)物置于32℃恒溫環(huán)境至蘇醒，成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型。術(shù)后每日以碘伏消毒手術(shù)創(chuàng)口，連續(xù)三日。實(shí)施例七：子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的檢測(cè)評(píng)價(jià)采用上述實(shí)施例一至實(shí)施例六任意一種子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建，分別于造模后15d、30d、45d、60d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)采用上述實(shí)施例制備的子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)。(1)解剖學(xué)檢查檢查方法：分別于造模后15d、30d、45d、60d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)模型建立情況，每次處理子午沙鼠和balb/c小鼠各8只。稱重后異氟烷吸入麻醉處死，解剖胸腔觀察肺組織感染情況并記錄。對(duì)肉眼可見包囊的肺組織，仔細(xì)剝離包囊稱重，結(jié)合動(dòng)物體重，計(jì)算包囊系數(shù)(包囊系數(shù)＝包囊重/動(dòng)物體重×100％)。檢查結(jié)果：子午沙鼠解剖結(jié)果參見附圖1，子午沙鼠與balb/c小鼠經(jīng)氣管感染多房棘球絳蟲包囊系數(shù)比較結(jié)果見表1。解剖后可見子午沙鼠接種多房棘球絳蟲原頭節(jié)15d肺組織表面出現(xiàn)較多不規(guī)則白色突起，30d形成明顯包囊，45d包囊組織迅速增長(zhǎng)，60d包囊組織幾乎長(zhǎng)滿整個(gè)胸腔并完全包裹肺臟。balb/c小鼠解剖結(jié)果參見附圖2，balb/c小鼠接種15d后肺臟表面未見明顯異常，30d肺臟表面形成不規(guī)則突起，45d可觀察到單發(fā)的包囊，60d包囊數(shù)量、體積較45d均有增加。表1：子午沙鼠與balb/c小鼠經(jīng)氣管感染多房棘球絳蟲包囊系數(shù)比較15d30d45d60d子午沙鼠0.0282±0.0213*0.0243±0.01590.5567±0.6217*4.7545±2.8431*balb/c小鼠0.0027±0.00440.0111±0.01270.0254±0.02440.0345±0.0426注：與balb/c小鼠相比p＜0.05由表1可知，感染動(dòng)物肺組織分離包囊后測(cè)算包囊系數(shù)，15d、45d、60d子午沙鼠包囊系數(shù)較balb/c小鼠包囊系數(shù)均有顯著差異(p＜0.05)。(2)多房棘球絳蟲cox1基因pcr檢測(cè)檢測(cè)方法：所有感染動(dòng)物取30mg肺組織提取總dna。根據(jù)已報(bào)道多房棘球絳蟲cox1基因設(shè)計(jì)引物(cox1fw：gtggtgttgattttttgatgttt；cox1rv：ccaaacgtaaacaacactataaaaga)，擴(kuò)增體系：2×tapcrmastermix15μl，樣品dna3μl，上、下游引物各2μl，dd水8μl，共30μl。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃5min，變性95℃30s，退火56℃45s，延伸72℃40s，反復(fù)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸12min。擴(kuò)增產(chǎn)物以2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果：對(duì)所有感染動(dòng)物肺組織提取進(jìn)行cox1基因pcr檢測(cè)，結(jié)果參見附圖3，15d時(shí)子午沙鼠有6只感染多房棘球蚴呈強(qiáng)陽(yáng)性，而balb/c小鼠只有2只；30d和45d子午沙鼠感染強(qiáng)陽(yáng)性均為7只，balb/c小鼠感染強(qiáng)陽(yáng)性分別為4只和3只；60d子午沙鼠感染8只均為強(qiáng)陽(yáng)性，balb/c小鼠為4只。(3)組織病理學(xué)檢查檢查方法：對(duì)子午沙鼠和balb/c小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織切片進(jìn)行病理學(xué)診斷，診斷如下：子午沙鼠檢查結(jié)果參見附圖4，第15d時(shí)可見肺泡間隔增厚，炎細(xì)胞浸潤(rùn)伴有出血，血管周圍炎形成，主要為嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。第30d，炎癥反應(yīng)加劇，并有纖維素囊形成趨勢(shì)，周圍大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。第45d，肺組織內(nèi)大量囊腔形成，棘球蚴包囊形成，角質(zhì)層和生發(fā)層可見，囊內(nèi)有脫落的包囊砂(棘球砂)。第60d，肺組織被大量囊腔取代，棘球蚴包囊形成，角質(zhì)層和生發(fā)層可見，腔內(nèi)散在大量原頭蚴，鈣顆粒形態(tài)尋常，部分能看到囊液。balb/c小鼠檢查結(jié)果參見附圖5，第15d肺組織形態(tài)正常，無(wú)明顯病理性改變。第30d可見炎性肉芽腫形成，單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞為主，并可見巨嗜細(xì)胞。第45d肺泡間隔增厚，炎細(xì)胞浸潤(rùn)伴有出血，血管周圍炎初步形成。第60d炎癥反應(yīng)加劇，彌漫性炎細(xì)胞浸潤(rùn)伴有出血，血管周圍炎形成。綜上所述，通過(guò)采用試驗(yàn)動(dòng)物的篩選、剖取沖洗包囊、制備原頭節(jié)懸液、鏡檢原頭節(jié)、麻醉子午沙鼠、建模等一系列的技術(shù)手段，創(chuàng)造性的提供了一種子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，本發(fā)明提供的子午沙鼠肺泡球蚴病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法具有成模率高、造模周期短、成本低以及重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
具有廣泛地實(shí)用性。如上所述，即可較好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，上述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種改變和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明確定的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12