本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及硬葉兜在育苗過程中采用的菌根共生的育苗方法。
背景技術(shù)：
：20世紀(jì)80年代中期，原產(chǎn)于我國的兜蘭屬（paphiopedilum）寬瓣亞屬(subgen.brachypetalum）的硬葉兜蘭（paphiopedilummicranthum），其花奇色美，具有非常高的生物學(xué)研究和觀賞價值，便引起了全世界兜蘭專家的極大興趣。貴州特殊的地理環(huán)境，使其植被類型豐富多樣，為硬葉兜蘭的生長提供了有利條件，主要分布于貴州東北部至西南部。由于過度采集、走私出境猖獗以及生境破壞等原因，近十幾年來野生硬葉兜蘭的數(shù)量急劇減少，分布區(qū)逐漸萎縮，已經(jīng)到了滅絕的邊緣。其屬“野生動植物瀕危物種國際貿(mào)易公約”（cites)附錄ⅰ的保護對象，十分珍貴。因此，硬葉兜蘭野生資源的保護和人工繁育問題亟待引起社會各界的重視。組織培養(yǎng)技術(shù)已成為蘭科植物產(chǎn)業(yè)種苗生產(chǎn)的一種常規(guī)方法，但是該技術(shù)應(yīng)用于蘭科植物的栽培有許多問題亟待解決：幼苗生長緩慢、組培苗抗逆性差、易遭受病蟲害。綜上，蘭花組培苗快速健壯生長已成為蘭科植物生產(chǎn)者急切關(guān)注的問題。已有的研究結(jié)果表明，共生真菌有助于提高幼苗移栽后的成活率和生長速度，增加植株對逆境的抵抗能力，維持較低的發(fā)病率。所以，將蘭科菌根技術(shù)應(yīng)用于硬葉兜蘭植株生長將成為使其產(chǎn)業(yè)化的必然技術(shù)手段。申請人長期從事各種蘭花的菌根育苗技術(shù)研究。對照實驗直接照搬現(xiàn)有的蘭科菌根技術(shù)應(yīng)用于硬葉兜蘭時，盡管組培苗移栽成活率有所提高，植株生長速度有所增加，抗逆性也有所增加，但增加的不是很明顯，這說明將現(xiàn)有的蘭科菌根技術(shù)應(yīng)用于硬葉兜蘭時需要做出實質(zhì)性的創(chuàng)新。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)的：幼苗生長緩慢、組培苗移栽成活率低、組培苗抗逆性差、易遭受病蟲害等技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種硬葉兜在育苗過程中采用的菌苗共生的育苗方法。硬葉兜蘭菌根化育苗的方法，其過程包括以下步驟：a.硬葉兜蘭菌根真菌的分離、培養(yǎng)：提取硬葉兜蘭的2-3年生根，培養(yǎng)出菌絲團，將菌絲團轉(zhuǎn)接到pda培養(yǎng)基上，恒溫后鏡檢，找出萌發(fā)的菌絲團，切取萌發(fā)菌比pda培養(yǎng)基二次純化培養(yǎng)，最后試管保存菌種；所選取并培育應(yīng)用于硬葉兜蘭培育使用的兩種菌株均屬于瘤菌根菌屬；1號菌株的菌絲基本特征為：隔為桶孔隔膜，桶孔覆墊無穿孔，弧形，菌絲細(xì)胞為雙核。bdpda培養(yǎng)基上菌落淡褐色，平滑均勻較薄，無氣生菌絲，貼培養(yǎng)基生長，具同心環(huán)，邊緣整齊，具有香味，菌絲的生長速度0.10-0.12mm/h，菌絲直角或近直角分枝，直徑2.15-5.03μm，細(xì)胞長17.35-119.02μm，分枝第一隔與分枝點的距離為1.63-4.18μm，直角或近直角分枝，距分枝起源很近處有橫隔，念珠狀細(xì)胞球形，少數(shù)柱狀或橢圓形，大小16.95-37.82×36.89-52.93，念珠狀細(xì)胞鏈一般5個細(xì)胞；bdcma培養(yǎng)基上貼培養(yǎng)基生長，無氣生菌絲，生長速度0.24-0.25mm/h，菌絲呈直角或近直角分枝，有隔，直徑3.85-8.56μm，細(xì)胞長53.21-296.34μm，分枝第一隔與分枝點的距離為2.67-5.27μm；還利用了第2號菌株，屬于瘤菌根菌屬的菌株，基本特征：bdpda培養(yǎng)基上菌落乳白色，平滑，蠟質(zhì)，后期中央形成絨白色菌絲，散發(fā)式生長，邊緣不整齊，具有香味，菌絲的生長速度0.06-0.07mm/h，菌絲呈銳角分枝，有隔，直徑2.85-8.31μm，細(xì)胞長30.51-86.63μm，分枝第一隔與分枝點的距離為1.21-4.90μm；bdcma培養(yǎng)基上貼培養(yǎng)基生長，無氣生菌絲，生長速度0.19-0.24mm/h，菌絲呈銳角分枝，有隔，直徑3.67-5.98μm，細(xì)胞長26.34-106.95μm，分枝第一隔與分枝點的距離為2.06-4.93μm。b.菌苗共培養(yǎng)階段選取生長一致，長勢良好的硬葉兜蘭試管組培苗，且具有2-3片葉，2-3條根系作為試驗材料，將苗接種在ms附加6-芐基氨基嘌呤(6-ba)培養(yǎng)基上及吲哚乙酸（iba）培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2周后，選取無污染瓶苗；利用打孔器打取2號菌株的硬葉兜蘭內(nèi)生菌片2片，轉(zhuǎn)接至上述無污染瓶苗。c.種苗栽培基質(zhì)的配制菌液的制作：①號營養(yǎng)液含有kno3，nh4no3，kh2po4，mgso4·7h2o，cacl2·2h2o，ki，h3bo3，mnso4·4h2o，znso4·7h2o，na2moo4·2h2o，cuso4·5h2o，cocl2·6h2o、蔗糖，120℃高溫滅菌20分鐘，分裝于三角瓶，每瓶裝200ml，搖床震蕩培養(yǎng)90天；②號燕麥培養(yǎng)基：含有燕麥，蔗糖，瓊脂，120℃高溫滅菌20分鐘，分裝于三角瓶，每瓶裝200ml；接種菌株為1號，用直徑0.5cm的打孔器打取內(nèi)生菌片，每瓶接種1片，搖床震蕩培養(yǎng)60天；③號栽培基質(zhì)：含有樹皮、腐殖土、植金石、蛇木、苔蘚、松針，混合拌勻，拌勻備用；④號栽培基質(zhì)：按下述比例制備④號栽培基質(zhì)，取上述2l①號營養(yǎng)液和2l②號燕麥培養(yǎng)基倒入桶內(nèi)，將桶內(nèi)的①號和②號的菌絲充分研磨拌勻，拌入50l的③號栽培基質(zhì)，充分拌勻后裝入桶內(nèi)，薄膜密封發(fā)酵2周。d.種苗的移栽移栽前，將生根瓶苗打開瓶蓋，移至常溫下煉苗3d，然后，將瓶苗取出，洗去附著在根部的培養(yǎng)基，栽種于④號栽培基質(zhì)中放置在遮光度50%～60%、濕度達80%以上的溫室中，2個月后，成活率達95%以上。本發(fā)明的目的在于以硬葉兜蘭為研究材料，通過分離其根部內(nèi)生菌根真菌，配置培養(yǎng)基，制作菌液，應(yīng)用菌根技術(shù)來增強種苗抗性，縮短生長周期的方法。該方法簡單，操作性強，材料簡單易得，育苗效果顯著，可實現(xiàn)硬葉兜蘭種苗的產(chǎn)業(yè)化育苗、同時對成苗的處理，可使花期達到極高的一致性，從而栽培帶來較高的經(jīng)濟效益。附圖說明本發(fā)明的附圖說明如下：圖1：1號菌株基本特征形態(tài)圖片；圖2：2號菌株基本特征形態(tài)圖片；圖3：接種內(nèi)生菌的幼苗2、4、5月形態(tài)比較圖片；圖4：從瓶苗到移栽的圖片；圖5：當(dāng)年11月移栽的成苗及次年4月開花的圖片；圖6：硬葉兜蘭開花的近照圖片。具體實施方式下面對本發(fā)明作進一步的說明：硬葉兜蘭菌根化育苗的方法，其過程包括以下步驟：a.硬葉兜蘭菌根真菌的分離、培養(yǎng)：提取硬葉兜蘭的2-3年生根，培養(yǎng)出菌絲團，將菌絲團轉(zhuǎn)接到pda培養(yǎng)基上，恒溫后鏡檢，找出萌發(fā)的菌絲團，切取萌發(fā)菌比pda培養(yǎng)基二次純化培養(yǎng)，最后試管保存菌種；所選取并培育應(yīng)用于硬葉兜蘭培育使用的兩種菌株均屬于瘤菌根菌屬；第一種的菌絲基本特征為：隔為桶孔隔膜，桶孔覆墊無穿孔，弧形，菌絲細(xì)胞為雙核。bdpda培養(yǎng)基上菌落淡褐色，平滑均勻較薄，無氣生菌絲，貼培養(yǎng)基生長，具同心環(huán)，邊緣整齊，具有香味，菌絲的生長速度0.10-0.12mm/h，菌絲直角或近直角分枝，直徑2.15-5.03μm，細(xì)胞長17.35-119.02μm，分枝第一隔與分枝點的距離為1.63-4.18μm，直角或近直角分枝，距分枝起源很近處有橫隔，念珠狀細(xì)胞球形，少數(shù)柱狀或橢圓形，大小16.95-37.82×36.89-52.93，念珠狀細(xì)胞鏈一般5個細(xì)胞；bdcma培養(yǎng)基上貼培養(yǎng)基生長，無氣生菌絲，生長速度0.24-0.25mm/h，菌絲呈直角或近直角分枝，有隔，直徑3.85-8.56μm，細(xì)胞長53.21-296.34μm，分枝第一隔與分枝點的距離為2.67-5.27μm；還利用了第2號菌株，屬于瘤菌根菌屬的菌株，基本特征：bdpda培養(yǎng)基上菌落乳白色，平滑，蠟質(zhì)，后期中央形成絨白色菌絲，散發(fā)式生長，邊緣不整齊，具有香味，菌絲的生長速度0.06-0.07mm/h，菌絲呈銳角分枝，有隔，直徑2.85-8.31μm，細(xì)胞長30.51-86.63μm，分枝第一隔與分枝點的距離為1.21-4.90μm；bdcma培養(yǎng)基上貼培養(yǎng)基生長，無氣生菌絲，生長速度0.19-0.24mm/h，菌絲呈銳角分枝，有隔，直徑3.67-5.98μm，細(xì)胞長26.34-106.95μm，分枝第一隔與分枝點的距離為2.06-4.93μm。b.菌苗共培養(yǎng)階段選取生長一致，長勢良好的硬葉兜蘭試管組培苗，且具有2-3片葉，2-3條根系作為試驗材料，將苗接種在ms附加6-芐基氨基嘌呤(6-ba)培養(yǎng)基上及吲哚乙酸（iba）培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2周后，選取無污染瓶苗；利用打孔器打取2號菌株的硬葉兜蘭內(nèi)生菌片2片，轉(zhuǎn)接至上述無污染瓶苗；c.種苗栽培基質(zhì)的配制菌液的制作：①號營養(yǎng)液含有kno3，nh4no3，kh2po4，mgso4·7h2o，cacl2·2h2o，ki，h3bo3，mnso4·4h2o，znso4·7h2o，na2moo4·2h2o，cuso4·5h2o，cocl2·6h2o、蔗糖，120℃高溫滅菌20分鐘，分裝于三角瓶，每瓶裝200ml，搖床震蕩培養(yǎng)90天；②號燕麥培養(yǎng)基：含有燕麥，蔗糖，瓊脂，120℃高溫滅菌20分鐘，分裝于三角瓶，每瓶裝200ml；接種菌株為1號，用直徑0.5cm的打孔器打取內(nèi)生菌片，每瓶接種1片，搖床震蕩培養(yǎng)60天；③號栽培基質(zhì)：含有樹皮、腐殖土、植金石、蛇木、苔蘚、松針，混合拌勻，拌勻備用；④號栽培基質(zhì)：按下述比例制備④號栽培基質(zhì)，取上述2l①號營養(yǎng)液和2l②號燕麥培養(yǎng)基倒入桶內(nèi)，將桶內(nèi)的①號和②號的菌絲充分研磨拌勻，拌入50l的③號栽培基質(zhì)，充分拌勻后裝入桶內(nèi)，薄膜密封發(fā)酵2周。d.種苗的移栽移栽前，將生根瓶苗打開瓶蓋，移至常溫下煉苗3d，然后，將瓶苗取出，洗去附著在根部的培養(yǎng)基，栽種于④號栽培基質(zhì)中放置在遮光度50%～60%、濕度達80%以上的溫室中，2個月后，成活率達95%以上。進一步的，步驟a中所述菌根真菌的分離，具體要操作如下：選取健壯硬葉兜蘭2-3年生根，肥皂水侵泡2小時后，自來水流狀態(tài)下沖洗3-5小時，在超凈工作臺上用解剖刀輕輕刮掉根毛、根被及其他附屬物，顯微鏡鏡檢，選出具有菌絲團的根段，置于的培養(yǎng)皿中，無菌水沖洗至少3次，先用75%次氯酸鈉消毒2分鐘以上，再用0.1%升汞溶液消毒6分鐘，無菌水沖洗5次，把根段切成2-4厘米左右的小段，分裝于無菌水培養(yǎng)皿中，20℃恒溫培養(yǎng)，24小時后顯微鏡下鏡檢觀察，在顯微鏡暗視野中找到萌發(fā)長出菌絲的菌絲團，用移液槍吸取萌發(fā)菌絲團，然后轉(zhuǎn)接到面積為pda培養(yǎng)基上，20℃恒溫48h后鏡檢，找出在pda培養(yǎng)基上萌發(fā)的菌絲團，切取萌發(fā)菌絲培養(yǎng)基塊于直徑為9cm的pda培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，最后試管保存菌種。進一步的，步驟b中ms附加6-芐基氨基嘌呤(6-ba)培養(yǎng)基為8毫克/升；吲哚乙酸濃度為（iba）0.2毫克/升。進一步的，步驟b中所述的硬葉兜蘭內(nèi)生菌片的直徑0.5cm，菌塊2片，所用的打孔器與菌片大小相匹配。培養(yǎng)90天后，接種內(nèi)生菌的硬葉兜蘭試管組培苗的生物量均明顯高于無接種內(nèi)生菌的瓶苗。進一步的，步驟c中在①號營養(yǎng)液中分瓶后，每200ml的①號營養(yǎng)液，接種2號菌株，用直徑0.5cm的打孔器打取內(nèi)生菌片，每瓶接種1片，然后再進行搖床震蕩培養(yǎng)。進一步的步驟c中①號營養(yǎng)液的具體配方為：kno31900mg/l，nh4no31650mg/l，kh2po4170mg/l，mgso4·7h2o370mg/l，cacl2·2h2o440mg/l，ki0.83mg/l，h3bo36.2mg/l，mnso4·4h2o22.3mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，蔗糖25g/l；120℃高溫滅菌20分鐘，分裝于250ml的三角瓶，每瓶裝200ml；接種菌株為2號，用直徑0.5cm的打孔器打取內(nèi)生菌片，每瓶接種1片，搖床震蕩培養(yǎng)90天。進一步的，步驟c中所述的②號燕麥培養(yǎng)基，其具體配方為：燕麥20g·l，蔗糖15g·l，瓊脂2g·l，120℃高溫滅菌20分鐘，分裝于250ml的三角瓶，每瓶裝200ml。接種菌株為1號，用直徑0.5cm的打孔器打取內(nèi)生菌片，每瓶接種1片，搖床震蕩培養(yǎng)60天。進一步的，步驟c中所述的③號栽培基質(zhì)具體配方如下：樹皮40%，腐殖土40%，植金石5%，蛇木5%，苔蘚5%，松針5%，按照以上比例混合拌勻，待備用。進一步的，將硬葉兜蘭成苗（3-5年生植株）根部洗凈，用0.01%的高錳酸鉀溶液浸泡8～10min，根部施入②號菌劑，定植于③號栽培基質(zhì)中，放置于遮光度50%～60%、濕度達80%以上的溫室中，每兩個月根部再施入①號菌液，開花率達到92%。采用上述方法進行培育，當(dāng)年11月用經(jīng)過步驟a、c、d處理過的硬葉兜蘭成苗進行步驟e的處理，次年4月，開花率達到92%以上，且花期一致，極適合作為園林觀賞花卉。關(guān)于菌根共生技術(shù)中，菌株的辨別極為重要，下面就專利申請文件中的1號菌株和2號菌株在實際操作過程中的分離及鑒定，作進一步的說明：1.菌根真菌的分離1.1供試植物硬葉兜蘭健壯植株1.2分離菌根真菌培養(yǎng)基雙抗pda培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，瓊脂6g，葡萄糖15g，定容至1000ml，ph自然，150ug/ml慶大霉素和100ug/ml青霉素。1.3試驗用具、試劑及設(shè)備用具：雙面刀片、剪刀，鑷子，紗布，濾紙，脫脂棉，三角瓶及培養(yǎng)皿等。試劑：瓊脂、升汞、葡萄糖、青霉素、慶大霉素。主要設(shè)備：電子天平、sw-cj-ig單人凈化工作臺、gz-250s生化培養(yǎng)箱、cx21fs1c生物顯微鏡、101-1ab電熱鼓風(fēng)干燥箱、mls-3750全自動高壓滅菌器、電磁爐、微波爐。菌根真菌的形態(tài)鑒定2.1方法2.1.1供試菌株供試真菌菌株為硬葉兜蘭根中分離獲得的菌株。2.1.2培養(yǎng)菌株培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基：美國bd（difco）公司生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)pda（potatodextroseagar）培養(yǎng)基和cma（cornmealager）培養(yǎng)基。2.1.3用具及設(shè)備用具：雙面刀片、剪刀，鑷子，濾紙，蓋玻片、載玻片、脫脂棉、三角瓶及培養(yǎng)皿等。試劑：番紅t、氫氧化鉀、甘油、乙酸、甲醇、考馬斯亮藍。主要設(shè)備：olytmpusdp70倒置顯微鏡、電子天平、sw-cj-ig單人凈化工作臺、gz-250s生化培養(yǎng)箱、cx21fs1c生物顯微鏡、101-1ab電熱鼓風(fēng)干燥箱、mls-3750全自動高壓滅菌器、電磁爐、微波爐。2.2結(jié)果瘤菌根菌屬yydl01epulorhizasp，即1號菌株，見附圖1?；咎卣鳎焊魹橥翱赘裟?，桶孔覆墊無穿孔，弧形，菌絲細(xì)胞為雙核。bdpda培養(yǎng)基上菌落淡褐色，平滑均勻較薄，無氣生菌絲，貼培養(yǎng)基生長，具同心環(huán)，邊緣整齊，具有香味，菌絲的生長速度0.10-0.12mm/h，菌絲直角或近直角分枝，直徑2.15-5.03μm，細(xì)胞長17.35-119.02μm，分枝第一隔與分枝點的距離為1.63-4.18μm，直角或近直角分枝，距分枝起源很近處有橫隔，念珠狀細(xì)胞球形，少數(shù)柱狀或橢圓形，大小16.95-37.82×36.89-52.93，念珠狀細(xì)胞鏈一般5個細(xì)胞；bdcma培養(yǎng)基上貼培養(yǎng)基生長，無氣生菌絲，生長速度0.24-0.25mm/h，菌絲呈直角或近直角分枝，有隔，直徑3.85-8.56μm，細(xì)胞長53.21-296.34μm，分枝第一隔與分枝點的距離為2.67-5.27μm。瘤菌根菌屬yydl02epulorhizasp，即2號菌株，見附圖2?；咎卣鳎篵dpda培養(yǎng)基上菌落乳白色，平滑，蠟質(zhì)，后期中央形成絨白色菌絲，散發(fā)式生長，邊緣不整齊，具有香味，菌絲的生長速度0.06-0.07mm/h，菌絲呈銳角分枝，有隔，直徑2.85-8.31μm，細(xì)胞長30.51-86.63μm，分枝第一隔與分枝點的距離為1.21-4.90μm；bdcma培養(yǎng)基上貼培養(yǎng)基生長，無氣生菌絲，生長速度0.19-0.24mm/h，菌絲呈銳角分枝，有隔，直徑3.67-5.98μm，細(xì)胞長26.34-106.95μm，分枝第一隔與分枝點的距離為2.06-4.93μm。菌根真菌的分子鑒定3.1方法3.1.1菌絲的培養(yǎng)及收集將玻璃紙剪成培養(yǎng)皿大小，滅菌后用鑷子將玻璃紙覆蓋在bdpda平板上，將供試菌株接到bdpda培養(yǎng)基中，待菌落長至培養(yǎng)皿直徑一半時，利用解剖刀刮取表面玻璃紙表面的菌絲，菌絲放入1.5ml無菌離心管，最后放入超低溫冰箱冷凍0.5-1h。3.1.2菌株dna提取1、將材料從超低溫冰箱取出，放在冰上，加適量無菌石英砂和200μl65℃水浴預(yù)熱的ctab抽提液（50ml1mtris-hcl，20ml0.5medta，10gctab，nacl40.948g，20gpvp40，65℃水浴溶解，定容至500ml），用無菌玻璃棒研磨至均勻；2、加入400μl預(yù)熱ctab抽提液，劇烈振蕩混勻，利用浮漂固定，放入65℃水浴中裂解30min-1h，期間輕輕混勻3次；3、冷卻至室溫后，12000rpm離心10min，取上清液至另一干凈離心管中；4、加入上清液1/2體積的tris飽和酚，輕輕顛倒混勻后，再加入1/2體積的氯仿：異戊醇（24：1），顛倒混勻；5、12000rpm離心10min，取上清液至另一干凈離心管中；6、重復(fù)5、6步驟2次，視兩相界面處雜質(zhì)的多少而定；7、加入氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻后，12000rpm離心10min，盡量不要吸到中間沉淀，取上清液至另一干凈離心管中；8、向上清液加入0.7倍體積-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻后，放置于-20℃冰箱30min；9、12000rpm離心10min，棄上清，加入500μl70%乙醇漂洗，懸浮沉淀，棄上清，離心；10、重復(fù)10步一次，再用500μl無水乙醇再漂洗一次，懸浮沉淀；11、12000rpm離心5min，棄上清，室溫干燥；12、視沉淀的多少，加入適當(dāng)?shù)臒o菌水（一般為50μl）或te緩沖液（10mmtris-hcl，1medta，ph=8.0）溶解沉淀，并加入適當(dāng)比例的rnase，室溫放置1-2h后，再放入-20℃儲存?zhèn)溆谩?3、取5μl樣品在1%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外下檢測提取的真菌基因組dna。3.1.3引物合成及pcr擴增引物采用通用引物its1和its4，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。正向引物its1：5，-tccgtaggtgaacctgcgg-3，反向引物its4：5，-tcctccgcttattgatatgc-3，pcr反應(yīng)體積為25μl：模板小于1μg，10μm的正向引物its11μl，10μm的反向引物its41μl，10mmdntpsmix0.5μl，10×pcrbuffer2.5μl，2utaqdnapolymerase0.5μl，加ddh2o補足25μl。pcr儀為geneamppcrsystem。pcr反應(yīng)程序：循環(huán)前94℃變性3min，30次循環(huán)（94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min），72℃再延伸5min，每個樣擴增1管。3.1.4凝膠電泳檢測反應(yīng)結(jié)束后取5μlpcr產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，100bpdnaladdermarker，gv染色液，在syngenegbox凝膠成像系統(tǒng)中拍照。1.2.5pcr產(chǎn)物的測序及對比對合格的pcr產(chǎn)物進行測序（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成公司完成）。利用genebank通過blast對測序結(jié)果進行比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，確定菌根真菌種類。3.2結(jié)果菌株its區(qū)長度/bpgenbank登錄號種名/菌株/序列名稱相似度/%分值yydl01985aj313448epulorhizasp.onv4.296%1006yydl02720aj313442epulorhizasp.am895%1002本發(fā)明以貴州野生硬葉兜蘭分離獲得的菌種和硬葉兜蘭組培苗為原材料。在組培瓶內(nèi)培養(yǎng)和栽培條件下，用篩選出來的優(yōu)良內(nèi)生菌根菌對硬葉兜蘭組培苗進行接種，通過研究菌根真菌對硬葉兜蘭組培苗促生的效果，菌根真菌在硬葉兜蘭組培苗煉苗與移栽過程中的促進作用，建立菌根真菌與硬葉兜蘭組培苗共生體系，為硬葉兜蘭的資源保存奠定基礎(chǔ)，同時也為其菌根化育苗，快速繁殖提供技術(shù)支持。本發(fā)明的保護范圍不僅限于具體實施方式所公開的技術(shù)方案，凡利用菌根共生技術(shù)，利用本專利申請中所描述的1號2號菌株對硬葉兜蘭進行快繁育苗的技術(shù)方案，以及在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上進行的改進、等同替換，均落入本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁12