本發(fā)明屬于植物脫毒與組織培養(yǎng)快繁技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種誘導(dǎo)巴蜀報(bào)春無(wú)菌苗快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
巴蜀報(bào)春（primularupestrispaxetk.hoffm）,是報(bào)春花科報(bào)春花屬多年生草本植物。是一種重要的觀賞花卉，其繁殖方式主要依靠種子繁殖，也可以用分株法進(jìn)行繁殖。但其種子的壽命很短，發(fā)芽力喪失快，例如春天采收的種子在秋天播種，發(fā)芽率會(huì)下降一半，陳種子的發(fā)芽率更低，有的甚至不發(fā)芽。并且其種子很小，又是喜光發(fā)芽的種子，因此依靠其種子自然萌發(fā)來(lái)繁殖后代的方式效率很低。
近年來(lái)，雖然有文獻(xiàn)對(duì)報(bào)春花的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了研究，但目前為止，對(duì)巴蜀報(bào)春的相關(guān)研究還尚未報(bào)道，包括巴蜀報(bào)春的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)。巴蜀報(bào)春目前僅在湖北省宜昌市有發(fā)現(xiàn)，其他地區(qū)未見有報(bào)道，而且對(duì)其研究的文獻(xiàn)暫時(shí)也沒(méi)有。由于其種子繁殖率低，現(xiàn)已被列入瀕危保護(hù)物種。故我們希望可以通過(guò)組織培養(yǎng)的方式可以實(shí)現(xiàn)其快速繁殖的目的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)巴蜀報(bào)春無(wú)菌苗快速繁殖的方法，以解決巴蜀報(bào)春依靠其種子自然萌發(fā)來(lái)繁殖后代的方式效率很低的問(wèn)題。
本發(fā)明的目的及解決其主要技術(shù)問(wèn)題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種誘導(dǎo)巴蜀報(bào)春無(wú)菌苗快速繁殖的方法，其操作流程包括以下步驟：
1）外植體的采集及預(yù)處理：將從野外采集回來(lái)的巴蜀報(bào)春幼苗進(jìn)行修整，把不需要的部分去掉，取生長(zhǎng)狀況良好的葉片、葉柄、莖尖以及根做為外植體，自來(lái)水沖洗30min，用干凈的濾紙將水分吸干；
2）外植體的消毒：用10%naclo消毒10min，期間攪拌，無(wú)菌水沖洗3-4遍，將無(wú)菌水倒干凈，備用；
3）接種：用經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌的鑷子夾取將滅菌完的外植體接種到ms+0.6mg/lkt+0.1mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉培養(yǎng)基上，培養(yǎng)于14h/d光照，溫度22℃培養(yǎng)室中。
上述的步驟1）采用野生巴蜀報(bào)春的莖尖為最佳外植體。
上述的步驟3）用經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌的鑷子夾取已經(jīng)過(guò)滅菌處理的外植體。
上述的步驟3）培養(yǎng)基ph為5.8。
上述的步驟3）20day后可以肉眼可見長(zhǎng)出無(wú)菌苗。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和優(yōu)異效果。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明通過(guò)組織培養(yǎng)的方法對(duì)其進(jìn)行繁殖，以解決巴蜀報(bào)春依靠其種子自然萌發(fā)來(lái)繁殖后代的方式效率很低的問(wèn)題，為對(duì)巴蜀報(bào)春的研究奠定基礎(chǔ)，可以彌補(bǔ)這一物種在對(duì)報(bào)春花科的研究中的空缺，具有一定的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提出的一種誘導(dǎo)巴蜀報(bào)春無(wú)菌苗快速繁殖的方法具體實(shí)施方式、特征及其功效，詳細(xì)說(shuō)明如后。
一種誘導(dǎo)巴蜀報(bào)春無(wú)菌苗快速繁殖的方法，其操作流程包括以下步驟：
1）外植體的采集及預(yù)處理：將從野外采集回來(lái)的巴蜀報(bào)春幼苗進(jìn)行修整，把不需要的部分去掉，取生長(zhǎng)狀況良好的葉片、葉柄、莖尖以及根做為外植體，自來(lái)水沖洗30min，用干凈的濾紙將水分吸干；
2）外植體的消毒：用10%naclo消毒10min，期間攪拌，無(wú)菌水沖洗3-4遍，將無(wú)菌水倒干凈，備用；
3）接種：用經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌的鑷子夾取將滅菌完的外植體接種到ms+0.6mg/lkt+0.1mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉培養(yǎng)基上，培養(yǎng)于14h/d光照，溫度22℃培養(yǎng)室中。
上述的步驟1）采用野生巴蜀報(bào)春的莖尖為最佳外植體。
上述的步驟3）用經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌的鑷子夾取已經(jīng)過(guò)滅菌處理的外植體。
上述的步驟3）培養(yǎng)基ph為5.8。
上述的步驟3）20day后可以肉眼可見長(zhǎng)出無(wú)菌苗。
上述方法和參數(shù)是通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳方案得出的：
1.1.實(shí)驗(yàn)材料
貴州省施秉縣云臺(tái)山采取野生巴蜀報(bào)春幼苗。
1.2.材料預(yù)處理
莖尖、葉片，葉柄、根分開誘導(dǎo)，用流動(dòng)自來(lái)水小水流沖洗30min，備用。
1.3.外植體的消毒
植物組織培養(yǎng)用的外植體大部分取自田間，表面上附著大量的微生物，這是組織培養(yǎng)的一大障礙。因此在材料接種培養(yǎng)前必須要消毒處理，消毒一方面要求把材料表面上的各種微生物殺滅，同時(shí)又不能損傷或只輕微損傷組織材料而不影響其生長(zhǎng)。因此，外植體的消毒處理是植物組織培養(yǎng)工作中的重要一環(huán)。
1.3.1.常用的消毒劑
常用的消毒劑如下所示。理想的消毒劑應(yīng)具有消毒效果好，易被無(wú)菌水沖洗掉或能自行分解，對(duì)材料損傷小，對(duì)人體及其他生物無(wú)害，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉。
常用消毒劑的使用方法及效果
①酒精
酒精是最常用的表面消毒劑，以70%-75%酒精殺菌效果最好，95%或無(wú)水酒精會(huì)使菌體表面蛋白質(zhì)快速脫水凝固，形成一層干燥膜，阻止了酒精的繼續(xù)滲入，殺菌效果大大降低。
酒精具有較強(qiáng)的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)變性，殺菌效果好。同時(shí)它還具有較強(qiáng)的濕潤(rùn)作用，可排除材料上的空氣，利于其他消毒劑的滲入。但酒精對(duì)植物材料的殺傷作用也很大，浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，植物材料的生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至被酒精殺死，使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制時(shí)間。但酒精不能徹底消毒，一般不單獨(dú)使用，多與其他消毒劑配合使用。
②升汞
又稱氯化汞，hg2+可以與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，從而殺死菌體。升汞的消毒效果極佳，但易在植物材料上殘留，消毒后需用無(wú)菌水反復(fù)多次沖洗。升汞對(duì)環(huán)境危害大，對(duì)人畜的毒性極強(qiáng)，使用后應(yīng)做好回收工作。
③次氯酸鈉
次氯酸鈉是一種較好的消毒劑，它可以釋放出活性氯離子，從而殺死菌體。其消毒能力很強(qiáng)，不易殘留，對(duì)環(huán)境無(wú)害。但次氯酸鈉溶液堿性很強(qiáng)，對(duì)植物材料也有一定的破壞作用。
④漂白粉
漂白粉的有效成分是次氯酸鈣[ca(clo)2]，消毒效果很好，對(duì)環(huán)境無(wú)害。它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。
⑤過(guò)氧化氫
也稱雙氧水，消毒效果好，易清除，又不會(huì)損傷外植體，常用于葉片的消毒。
⑥新潔爾滅
這是一種廣普表面活性消毒劑，對(duì)絕大多數(shù)植物外植體傷害很小，殺菌效果好。
1.3.2.最佳消毒方法的篩選
在本次發(fā)明中選擇0.1%升汞、10%naclo以及70%酒精三種滅菌劑，分別設(shè)定不同的滅菌時(shí)間，以便篩選巴蜀報(bào)春外植體最適宜的滅菌方式，具體實(shí)驗(yàn)方案見表1。
巴蜀報(bào)春外植體分別采用以上12種方式進(jìn)行滅菌處理，其他因素皆相同。
1.4.巴蜀報(bào)春培養(yǎng)基的選擇
1.4.1.6-ba、naa激素配比的選擇
以ms培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，選擇6-ba、naa兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，分別設(shè)定7個(gè)不同濃度水平進(jìn)行試驗(yàn)以篩選巴蜀報(bào)春外植體最適宜誘導(dǎo)無(wú)菌苗的培養(yǎng)基，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方案見表2。
1.4.2.kt、2,4-d激素配比的選擇
以ms培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，選擇kt、2,4-d兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，分別設(shè)定不同濃度水平進(jìn)行試驗(yàn)以篩選巴蜀報(bào)春外植體最適宜誘導(dǎo)無(wú)菌苗的培養(yǎng)基，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方案見表3。
1.1.5巴蜀報(bào)春接種：
接種時(shí)，要穿好工作衣，戴好工作帽和口罩，不準(zhǔn)說(shuō)話或?qū)χ参锊牧匣蚺囵B(yǎng)容器口呼吸。打開包塞紙和瓶塞、瓶蓋時(shí)注意不要污染瓶口。在近酒精燈火焰處打開培養(yǎng)瓶瓶口，并使培養(yǎng)瓶?jī)A斜，以免微生物落入瓶?jī)?nèi)。瓶口可以在拔塞、開蓋前灼燒滅菌，接種工作宜在近火焰處進(jìn)行。手不能接觸接種器械的前半部分（即直接切割、觸碰植物材料的部分），接種操作時(shí)（包括擰開或擰上培養(yǎng)瓶蓋時(shí)），培養(yǎng)瓶、試管或三角瓶宜水平放置或傾斜一定角度（45度以下），避免直立放置而增大污染機(jī)會(huì)。手和手臂應(yīng)避免在培養(yǎng)基、植物材料、接種器械上方經(jīng)過(guò)。已消毒的植物材料接種時(shí)不慎掉在超凈工作臺(tái)上，不宜再用。接種期間如遇停電等事件使超凈工作臺(tái)停止運(yùn)轉(zhuǎn)，重新啟動(dòng)時(shí)應(yīng)對(duì)接種器械及暴露的植物材料重新消毒。
將接種好的材料放入培養(yǎng)室中，其中14h/10h光照，22℃培養(yǎng)，每隔三天拍照記錄。約20天后長(zhǎng)出無(wú)菌苗。
1.6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
接種5day后統(tǒng)計(jì)12種滅菌方式的染菌率，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。
用10%naclo消毒10min，污染率最低，雖然0.1%升汞滅菌效果較好，但由于其毒性較大，對(duì)外植體的損傷較大，故采用10%naclo消毒10min的方式對(duì)巴蜀報(bào)春外植體進(jìn)行滅菌。
接種20day后，統(tǒng)計(jì)不同外植體的出苗情況，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。
接種20day后，統(tǒng)計(jì)各種培養(yǎng)基中巴蜀報(bào)春的出苗情況，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6-1、表6-2、表7-1和表7-2。
通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明誘導(dǎo)巴蜀報(bào)春無(wú)菌苗最適宜的培養(yǎng)基為ms+0.6mg/lkt+0.1mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph為5.8。
本發(fā)明建立了巴蜀報(bào)春脫毒培養(yǎng)的技術(shù)體系，為大規(guī)模生產(chǎn)無(wú)病毒種苗，為巴蜀報(bào)春的繁殖提供了一種可行的方式，為彌補(bǔ)巴蜀報(bào)春在報(bào)春花科研究中的空白奠定了基礎(chǔ)。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、變換材質(zhì)、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。