本發(fā)明屬于人精子保存
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液及保存方法。
背景技術(shù)：
：精液冷凍技術(shù)是人類精子庫保存精子，得以保持其生命力和受精能力的一項(xiàng)技術(shù)。冷凍技術(shù)中向精液樣本中添加的冷凍保護(hù)劑是使精子在降溫和低溫儲(chǔ)存過程中免受冷凍損傷的關(guān)鍵性物質(zhì)。目前使用的冷凍保護(hù)劑中卵黃是主要的成分之一。但是，卵黃來源于雞蛋，具備有生物源性。卵黃由卵黃顆粒、磷脂和蛋白等生物活性物質(zhì)組成，難以通過過濾、高溫或其它方法達(dá)到完全的除菌或滅菌。其中的蛋白質(zhì)對(duì)于人體而言是一種異種蛋白，可能在使用中進(jìn)入人體引起過敏性反應(yīng)。再者溶液中混有卵黃顆粒增加了顯微鏡觀察精子時(shí)背景存在雜質(zhì)干擾，且不易去除。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液及保存方法，可有效解決現(xiàn)有的冷凍保護(hù)劑會(huì)引起不良反應(yīng)，無法達(dá)到完全滅菌以及增加觀察的干擾等問題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液，包括以下組分且在保存人精子時(shí)各組分的終濃度為：氯化鈉90～110mmol/l、氯化鉀5～6mmol/l、硫酸鎂0.2～0.5mmol/l、氯化鈣2～4mmol/l、磷酸二氫鈉0.2～0.5mmol/l、碳酸氫鈉28～35mmol/l、甘氨酸110～150mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸18～25mmol/l、葡萄糖5～8mmol/l、蔗糖30～60mmol/l、乳酸鈉12～15mmol/l、甘油50～100ml/l，余量為超純水。進(jìn)一步地，一種不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液，包括以下組分且在保存人精子時(shí)各組分的終濃度為：氯化鈉100mmol/l、氯化鉀5.365mmol/l、硫酸鎂0.49mmol/l、氯化鈣2.72mmol/l、磷酸二氫鈉0.31mmol/l、碳酸氫鈉30.95mmol/l、甘氨酸133.2mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸20mmol/l、葡萄糖5.51mmol/l、蔗糖50mmol/l、乳酸鈉12.86mmol/l、甘油70ml/l，余量為超純水。人精子冷凍保存方法，包括以下步驟：(1)將上述精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:1～3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10～15min，然后按照分段降溫方式靜置15～20min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。進(jìn)一步地，步驟(1)中精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:3。進(jìn)一步地，步驟(2)中，在室溫下平衡10min。進(jìn)一步地，步驟(2)中分段降溫方式為在-20℃靜置5min，接著在-125～-130℃靜置10min，使之盡快通過液體的冰晶形成期，進(jìn)而不會(huì)對(duì)精子造成傷害。本發(fā)明提供的一種不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液及保存方法，具有以下有益效果：(1)本發(fā)明通過特定的物質(zhì)組合成精子冷凍保護(hù)液，全為可溶性成分，易過濾除菌；不含異種或同種異體蛋白致敏原，也不會(huì)引起過敏反應(yīng)；復(fù)蘇后鏡檢，背景清晰，無雜質(zhì)，不會(huì)出現(xiàn)干擾情況；復(fù)蘇后容易通過稀釋或離心去除保護(hù)液溶質(zhì)。(2)本發(fā)明產(chǎn)品ph為7.2～7.4，其中，磷酸二氫鈉、乳酸鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸和4-羥乙基哌嗪乙磺酸提供強(qiáng)大的酸堿緩沖作用，能夠?yàn)榫舆\(yùn)動(dòng)提供最適ph范圍；此外，甘氨酸的抗氧化作用為精子提供保護(hù)作用，葡萄糖和甘氨酸結(jié)合，其抗氧化作用加強(qiáng)；葡萄糖、甘氨酸和甘油作為滲透性物質(zhì)進(jìn)入到精子細(xì)胞內(nèi)增加細(xì)胞內(nèi)液的晶體滲透壓，而分子量大的蔗糖作為非滲透性物質(zhì)可以增加細(xì)胞外液的滲透壓同時(shí)外吸細(xì)胞內(nèi)水分，可以有效的減少精子凍結(jié)時(shí)的冰晶形成和損傷；葡萄糖還為精子提供其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鈣為精子的生存提供必須的無機(jī)鹽離子。(3)本發(fā)明制備的精子冷凍保護(hù)液，能明顯增加精子的活動(dòng)能力，并且對(duì)精子生理功能無明顯的影響，冷凍復(fù)蘇率高，復(fù)蘇后的精液在國(guó)家法規(guī)允許的范圍內(nèi)使用，其臨床妊娠率高于20％。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液，包括以下組分且在保存人精子時(shí)各組分的終濃度為：氯化鈉90mmol/l、氯化鉀5mmol/l、硫酸鎂0.2mmol/l、氯化鈣2mmol/l、磷酸二氫鈉0.2mmol/l、碳酸氫鈉28mmol/l、甘氨酸110mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸18mmol/l、葡萄糖5mmol/l、蔗糖30mmol/l、乳酸鈉12mmol/l、甘油50ml/l，余量為超純水。上述不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液的制備過程：用分析天平準(zhǔn)確稱取各組分即氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸鈉和甘油，然后將各組分溶于超純水中，制成各組分的母液，其母液濃度的配制主要是根據(jù)所要保存的人精子濃度情況而定，然后將各組分混合，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆颍瑫r(shí)要保證溶液ph值為7.4，最后采用孔徑為0.22μm的過濾器過濾除菌，無菌保存。采用上述冷凍保護(hù)液保存人精子的方法，包括以下步驟：(1)將精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:1～3混勻，精子冷凍保護(hù)液和精液的體積比取決于精液樣品中精子濃度，在精液樣品達(dá)到衛(wèi)生部精液參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)前提下，當(dāng)精液中精子濃度大于等于150×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:1混勻；當(dāng)精液中精子濃度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:2混勻；當(dāng)精液中精子濃度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。實(shí)施例2一種不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液，包括以下組分且在保存人精子時(shí)各組分的終濃度為：氯化鈉110mmol/l、氯化鉀6mmol/l、硫酸鎂0.5mmol/l、氯化鈣4mmol/l、磷酸二氫鈉0.5mmol/l、碳酸氫鈉35mmol/l、甘氨酸150mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸25mmol/l、葡萄糖8mmol/l、蔗糖60mmol/l、乳酸鈉15mmol/l、甘油100ml/l，余量為超純水。上述不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液的制備過程：用分析天平準(zhǔn)確稱取各組分即氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸鈉和甘油，然后將各組分溶于超純水中，制成各組分的母液，其母液濃度的配制主要是根據(jù)所要保存的人精子濃度情況而定，然后將各組分混合，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆?，同時(shí)要保證溶液ph值為7.4，最后采用孔徑為0.22μm的過濾器過濾除菌，無菌保存。采用上述冷凍保護(hù)液保存人精子的方法，包括以下步驟：(1)將精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:1～3混勻，精子冷凍保護(hù)液和精液的體積比取決于精液樣品中精子濃度，在精液樣品達(dá)到衛(wèi)生部精液參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)前提下，當(dāng)精液中精子濃度大于等于150×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:1混勻；當(dāng)精液中精子濃度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:2混勻；當(dāng)精液中精子濃度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。實(shí)施例3一種不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液，包括以下組分且在保存人精子時(shí)各組分的終濃度為：氯化鈉95mmol/l、氯化鉀5.2mmol/l、硫酸鎂0.3mmol/l、氯化鈣2.5mmol/l、磷酸二氫鈉0.3mmol/l、碳酸氫鈉30mmol/l、甘氨酸120mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸20mmol/l、葡萄糖6mmol/l、蔗糖40mmol/l、乳酸鈉13mmol/l、甘油60ml/l，余量為超純水。上述不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液的制備過程：用分析天平準(zhǔn)確稱取各組分即氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸鈉和甘油，然后將各組分溶于超純水中，制成各組分的母液，其母液濃度的配制主要是根據(jù)所要保存的人精子濃度情況而定，然后將各組分混合，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆?，同時(shí)要保證溶液ph值為7.4，最后采用孔徑為0.22μm的過濾器過濾除菌，無菌保存。采用上述冷凍保護(hù)液保存人精子的方法，包括以下步驟：(1)將精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:1～3混勻，精子冷凍保護(hù)液和精液的體積比取決于精液樣品中精子濃度，在精液樣品達(dá)到衛(wèi)生部精液參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)前提下，當(dāng)精液中精子濃度大于等于150×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:1混勻；當(dāng)精液中精子濃度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:2混勻；當(dāng)精液中精子濃度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。實(shí)施例4一種不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液，包括以下組分且在保存人精子時(shí)各組分的終濃度為：氯化鈉105mmol/l、氯化鉀5.5mmol/l、硫酸鎂0.4mmol/l、氯化鈣3.2mmol/l、磷酸二氫鈉0.4mmol/l、碳酸氫鈉32mmol/l、甘氨酸140mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸23mmol/l、葡萄糖7mmol/l、蔗糖55mmol/l、乳酸鈉14mmol/l、甘油90ml/l，余量為超純水。上述不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液的制備過程：用分析天平準(zhǔn)確稱取各組分即氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸鈉和甘油，然后將各組分溶于超純水中，制成各組分的母液，其母液濃度的配制主要是根據(jù)所要保存的人精子濃度情況而定，然后將各組分混合，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆?，同時(shí)要保證溶液ph值為7.4，最后采用孔徑為0.22μm的過濾器過濾除菌，無菌保存。采用上述冷凍保護(hù)液保存人精子的方法，包括以下步驟：(1)將精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:1～3混勻，精子冷凍保護(hù)液和精液的體積比取決于精液樣品中精子濃度，在精液樣品達(dá)到衛(wèi)生部精液參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)前提下，當(dāng)精液中精子濃度大于等于150×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:1混勻；當(dāng)精液中精子濃度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:2混勻；當(dāng)精液中精子濃度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。實(shí)施例5一種不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液，包括以下組分且在保存人精子時(shí)各組分的終濃度為：氯化鈉100mmol/l、氯化鉀5.365mmol/l、硫酸鎂0.49mmol/l、氯化鈣2.72mmol/l、磷酸二氫鈉0.31mmol/l、碳酸氫鈉30.95mmol/l、甘氨酸133.2mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸20mmol/l、葡萄糖5.51mmol/l、蔗糖50mmol/l、乳酸鈉12.86mmol/l、甘油70ml/l，余量為超純水。上述不含卵黃的人精子冷凍保護(hù)液的制備過程：用分析天平準(zhǔn)確稱取各組分即氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸鈉和甘油，然后將各組分溶于超純水中，制成各組分的母液，其母液濃度的配制主要是根據(jù)所要保存的人精子濃度情況而定，然后將各組分混合，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆?，同時(shí)要保證溶液ph值為7.4，最后采用孔徑為0.22μm的過濾器過濾除菌，無菌保存。采用上述冷凍保護(hù)液保存人精子的方法，包括以下步驟：(1)將精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:1～3混勻，精子冷凍保護(hù)液和精液的體積比取決于精液樣品中精子濃度，在精液樣品達(dá)到衛(wèi)生部精液參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)前提下，當(dāng)精液中精子濃度大于等于150×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:1混勻；當(dāng)精液中精子濃度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:2混勻；當(dāng)精液中精子濃度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml時(shí)，精子冷凍保護(hù)液和精液按體積比為1:3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。實(shí)驗(yàn)例1生物毒性實(shí)驗(yàn)選用健康男性精液作為樣品，用本品(試驗(yàn)組)及市售含卵黃的精子冷凍保護(hù)液(對(duì)照組)在相同條件下稀釋(此處的稀釋為精液和冷凍保護(hù)液混合)，稀釋后0min、60min、120min、180min以及240min，分別觀察比較其前向運(yùn)動(dòng)精子百分比(平均值)，結(jié)果見表1：表1不同時(shí)間點(diǎn)前向運(yùn)動(dòng)精子百分比(％)0小時(shí)1小時(shí)2小時(shí)3小時(shí)4小時(shí)對(duì)照組63.862.353.849.345.1試驗(yàn)組64.763.558.756.550.7實(shí)驗(yàn)例2復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法：選取健康男性精液作為樣品，按照精子冷凍保護(hù)液(本發(fā)明實(shí)施例5制備的產(chǎn)品)和精液的比例關(guān)系將精子冷凍保護(hù)液和精液充分混勻，以市售的含卵黃的冷凍保護(hù)液作為對(duì)比例?；靹蚝笤谑覝叵缕胶?0min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min，再直接投于-196℃液氮中，當(dāng)混合液溫度穩(wěn)定后，從液氮中取出冷凍精液，在37℃水浴搖床中解凍。解凍后，顯微鏡下觀察比較前向運(yùn)動(dòng)精子百分比，計(jì)算其冷凍復(fù)蘇率。冷凍復(fù)蘇率＝凍后前向運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)量/凍前前向運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)量×100％。實(shí)驗(yàn)例和對(duì)比例分別設(shè)置10個(gè)平行，平均冷凍復(fù)蘇率分別為71.24％和62.1％。本發(fā)明所采用的精子冷凍保護(hù)液不含卵黃，不存在致病菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，且配方合理科學(xué)，所得到的冷凍效果與現(xiàn)有含卵黃的冷凍保護(hù)液相比，其精子冷凍復(fù)蘇率高。通過觀察其精子形態(tài)、頂體完整性等，其形態(tài)完整率和頂體完整率明顯比現(xiàn)有的冷凍保護(hù)液保護(hù)的精子完整率高，說明本發(fā)明精子冷凍保護(hù)液對(duì)精子不會(huì)產(chǎn)生破壞。采用本發(fā)明精子冷凍保護(hù)液冷凍保存的精子在國(guó)家法規(guī)允許的范圍內(nèi)使用后，臨床妊娠率高于20％，說明本發(fā)明精子冷凍保護(hù)液不會(huì)對(duì)精子生理功能產(chǎn)生明顯影響。當(dāng)前第1頁12