本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種廣西特色瑤族藥四方藤的組培快繁方法。

背景技術(shù)：

四方藤(cissuspterocladahayata)，別名紅四方藤、翼枝白粉藤、春根藤等，為葡萄科(vitaceae)白粉藤屬(cissuslinn.)草質(zhì)藤本植物，常生于闊葉林中，是廣西特色瑤族藥之一，主要分布于百色、陸川、賀州、博白、靖西等地，在民間廣泛用于治療風(fēng)濕痹痛、腰肌勞損、外傷、止血等，療效顯著。據(jù)《廣西中藥志》記載，四方藤莖可入藥，其味微苦，澀，甘，性平。具有舒筋活絡(luò)，去瘀生新，治跌打損傷，筋絡(luò)拘攣等功效?？捎糜谥委燂L(fēng)濕痹痛、腰肌勞損、跌打損傷、內(nèi)外傷出血、胃及十二指腸出血、疼痛等癥，并可用于產(chǎn)后保健藥浴。

作為一種具有獨(dú)特藥效的瑤族藥，目前四方藤多處于野生狀態(tài)，但由于藥農(nóng)無序采挖，其野生資源銳減，因此人工栽培四方藤顯得十分迫切！四方藤可通過種子、扦插、壓條等方式繁殖，但均存在周期長(zhǎng)、繁殖系數(shù)低下等缺點(diǎn)，限制了四方藤種苗的生產(chǎn)。因此有必要建立四方藤的組培快繁體系，本發(fā)明選擇四方藤帶節(jié)莖段為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)、增殖、生根、煉苗以及移栽等步驟，建立了四方藤的組培快速繁殖體系。本發(fā)明具有周期短、成本低廉、繁殖系數(shù)高等特點(diǎn)，可直接用于四方藤種苗的工廠化生產(chǎn)，對(duì)于促進(jìn)瑤族藥藥四方藤的植物資源開發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

至目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未有四方藤組織培養(yǎng)技術(shù)的報(bào)道，也未有四方藤組培快繁專利的申請(qǐng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種廣西特色瑤族藥四方藤的組培快繁方法，本發(fā)明選擇四方藤帶節(jié)莖段為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及移栽等步驟，其誘導(dǎo)率達(dá)到了88.5％以上，成活率達(dá)到了95％以上，實(shí)現(xiàn)了四方藤的組培快繁，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種廣西特色瑤族藥四方藤的組培快繁方法，包括依次進(jìn)行的如下步驟：獲取四方藤植株的外植體、外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽；

所述的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)操作的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基、0.5～2.0mg/l6-ba、0.2～0.5mg/lnaa、0.01～0.05mg/lpaclobutrazol、25～30g/l蔗糖、3.5～4.0g/l瓊脂、0.5～1.0g/l活性炭，ph為5.4～5.8。

在上述的廣西特色瑤族藥四方藤的組培快繁方法中，所述的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)操作的方法為：將采集得到的作為外植體的四方藤消毒后剪切成2.0～2.5cm的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25～28℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)25～35天即可誘導(dǎo)形成不定芽。

在上述的廣西特色瑤族藥四方藤的組培快繁方法中，所述的增殖培養(yǎng)操作所用到的增殖培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基、1.0～2.0mg/l6-ba、0.5～1.0mg/lnaa、20～30g/l蔗糖、3.5～4.0g/l瓊脂、0.1～0.5g/l活性炭，ph為5.4～5.8。

在上述的廣西特色瑤族藥四方藤的組培快繁方法中，所述的增殖培養(yǎng)操作具體為：將外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)操作得到的不定芽切成長(zhǎng)1.5～2.0cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～30天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖。

在上述的廣西特色瑤族藥四方藤的組培快繁方法中，所述的生根培養(yǎng)操作所用到的生根培養(yǎng)基包括：1/2ms培養(yǎng)基、0.05～0.1mg/lchlormequatchloride、0.5～1.0mg/liba、15～20g/l蔗糖、3.0～4.0g/l瓊脂、0.1～0.3g/l活性炭，ph為5.4～5.8。

在上述的廣西特色瑤族藥四方藤的組培快繁方法中，所述的生根培養(yǎng)操作的方法為：從增殖培養(yǎng)得到增殖后的不定芽的基部切取2.0～3.0cm不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根。

在上述的廣西特色瑤族藥四方藤的組培快繁方法中，所述的移栽操作的具體方法為：將經(jīng)生根培養(yǎng)操作得到的根系生長(zhǎng)良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗2～3天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、泥炭土混合基質(zhì)中栽培成苗即得四方藤種苗。

在上述的廣西特色瑤族藥四方藤的組培快繁方法中，增殖培養(yǎng)操作、生根培養(yǎng)操中培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強(qiáng)度為2500～3000lx，光照時(shí)間為12～14小時(shí)/天。

有益效果：

本發(fā)明采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立了瑤族藥四方藤的組培快繁，本發(fā)明具有周期短、成本低廉、繁殖系數(shù)高等特點(diǎn)，可直接用于四方藤種苗的工廠化生產(chǎn)，對(duì)于促進(jìn)瑤族藥四方藤的植物資源開發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。

實(shí)施例一

(1)外植體采集：在野外選取生長(zhǎng)健壯、無明顯病害的四方藤植株中上部、向陽充實(shí)的帶節(jié)藤莖為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)外植體誘導(dǎo)：將步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室的外植體置于自來水下沖洗3小時(shí)，置于超凈工作臺(tái)中于75％的乙醇溶液中消毒10秒鐘，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分鐘，無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后切成2.0～2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)25天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率達(dá)94.1％，污染率低于10％。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+0.05mg/lpaclobutrazol(多效唑)+25g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.5g/l活性炭，ph為5.4。

(3)增殖培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長(zhǎng)約1.5～2.0cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖，增殖系數(shù)達(dá)到5.0倍。所述的增殖培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+2.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa+20g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.1g/l活性炭，ph為5.4。

(4)生根培養(yǎng)：從基部切取步驟(3)增殖得到的長(zhǎng)約2.0～3.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根，生根率達(dá)到95.8％。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2ms培養(yǎng)基+0.1mg/lchlormequatchloride(矮壯素)+1.0mg/liba+15g/l蔗糖+3.0g/l瓊脂+0.1g/l活性炭，ph為5.4。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長(zhǎng)良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗2天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、泥炭土混合基質(zhì)中栽培成苗即得四方藤種苗，移栽30天后成活率達(dá)到95％以上。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2500lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天。

實(shí)施例二

(1)外植體采集：在野外選取生長(zhǎng)健壯、無明顯病害的四方藤植株中上部、向陽充實(shí)的帶節(jié)藤莖為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)外植體誘導(dǎo)：將步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室的外植體置于自來水下沖洗4小時(shí)，置于超凈工作臺(tái)中于75％的乙醇溶液中消毒13秒鐘，無菌水沖洗4次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒17分鐘，無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干水分后切成2.0～2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于26℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)31天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率達(dá)到90％以上，污染率低于15％。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+1.5mg/l6-ba+0.35mg/lnaa+0.03mg/lpaclobutrazol(多效唑)+28g/l蔗糖+3.7g/l瓊脂+0.8g/l活性炭，ph為5.6。

(3)增殖培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長(zhǎng)約1.5～2.0cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖，增殖系數(shù)達(dá)到3.9倍。所述的增殖培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+1.5mg/l6-ba+0.75mg/lnaa+25g/l蔗糖+3.7g/l瓊脂+0.3g/l活性炭，ph為5.6。

(4)生根培養(yǎng)：從基部切取步驟(3)增殖得到的長(zhǎng)約2.0～3.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根，生根率達(dá)到93％以上。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2ms培養(yǎng)基+0.07mg/lchlormequatchloride(矮壯素)+0.7mg/liba+18g/l蔗糖+3.6g/l瓊脂+0.2g/l活性炭，ph為5.6。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長(zhǎng)良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗3天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、泥炭土混合基質(zhì)中栽培成苗即得四方藤種苗，移栽30天成活率達(dá)到96％以上。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為2500～3000lx，光照時(shí)間為13小時(shí)/天。

實(shí)施例三

(1)外植體采集：在野外選取生長(zhǎng)健壯、無明顯病害的四方藤植株中上部、向陽充實(shí)的帶節(jié)藤莖為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)外植體誘導(dǎo)：將步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室的外植體置于自來水下沖洗5小時(shí)，置于超凈工作臺(tái)中于75％的乙醇溶液中消毒15秒鐘，無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘，無菌水沖洗7次后用無菌濾紙吸干水分后切成2.0～2.5cm左右的帶節(jié)藤莖并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于28℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)35天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)達(dá)到88.5％，污染率低于8％。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+0.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+0.01mg/lpaclobutrazol(多效唑)+30g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+1.0g/l活性炭，ph為5.8。

(3)增殖培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長(zhǎng)約1.5～2.0cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～30天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖，增殖系數(shù)達(dá)到4.3倍。所述的增殖培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.5g/l活性炭，ph為5.8。

(4)生根培養(yǎng)：從基部切取步驟(3)增殖得到的長(zhǎng)約2.0～3.0cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)35天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根，生根達(dá)到90％以上。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2ms培養(yǎng)基+0.05mg/lchlormequatchloride(矮壯素)+0.5mg/liba+20g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.3g/l活性炭，ph為5.8。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長(zhǎng)良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗2天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、泥炭土混合基質(zhì)中栽培成苗即得四方藤種苗，移栽30天后成活率達(dá)100％。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為3000lx，光照時(shí)間為14小時(shí)/天。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。