本發(fā)明屬于植物種子保存及萌發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種促進(jìn)低溫(-18℃至-20℃)保存后尼泊爾野桐種子萌發(fā)的方法。

背景技術(shù)：

尼泊爾野桐(mallotusnepalensismüll.arg.)是大戟科(euphorbiaceae)野桐屬(mallotuslour.)落葉灌木或小喬木樹種。分布于西藏云南海拔1700到2500米的山坡或溝谷中，國外主要分布在不丹、印度東北、緬甸及尼泊爾，國內(nèi)研究報(bào)道較少，國外有報(bào)道其提取物具有溫和抑制中樞神經(jīng)的作用。未見尼泊爾野桐種子儲(chǔ)藏方面的研究報(bào)道。

將正常型種子干燥后低溫(-18℃至-20℃)保藏可以極大的延長其壽命，這在國際上已經(jīng)形成共識(shí)，并且基于這一理論建立了多個(gè)農(nóng)作物及野生植物種子庫；但一些植物的種子在干燥和/或冷藏后萌發(fā)特性會(huì)發(fā)生變化，如本發(fā)明所涉及的尼泊爾野桐種子，低溫(-18℃至-20℃)保存一段時(shí)間后則幾乎完全不能萌發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中在低溫(-18℃至-20℃)保存一段時(shí)間后的尼泊爾野桐種子幾乎完全不能萌發(fā)的技術(shù)難題，提供一種簡便高效萌發(fā)低溫保存后尼泊爾野桐種子的方法。為實(shí)現(xiàn)該物種的長期有效保存及利用提供技術(shù)支持。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種促進(jìn)低溫保存后尼泊爾野桐種子萌發(fā)的方法，包括如下步驟：

(1)將在-18℃至-20℃冷藏保存后的種子連同其密閉容器取出，在溫度為15℃、相對(duì)濕度15％的環(huán)境中放置24小時(shí)回溫；

(2)將回溫后的種子從密閉容器中取出，放置在溫度為45℃-55℃的培養(yǎng)箱中，熱處理6小時(shí)后取出；

(3)將步驟(2)處理后的種子放置在室溫下，待種子溫度恢復(fù)到室溫后播種于含200毫克/升赤霉素的1％瓊脂培養(yǎng)基中，放置于20℃下萌發(fā)，光照強(qiáng)度為1000勒克斯，光周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗。

根據(jù)所述的一種促進(jìn)低溫保存后尼泊爾野桐種子萌發(fā)的方法，其中所述步驟(1)在-18℃至-20℃冷藏保存的種子是采集成熟飽滿的種子，先將種子置于溫度為15℃、相對(duì)濕度15％的環(huán)境中直到種子的平衡相對(duì)濕度達(dá)到15％(此時(shí)種子的含水量通常低于10％)，然后再將種子放入密閉容器中，保存于-18℃至-20℃。

本發(fā)明為一種促進(jìn)低溫保存后尼泊爾野桐種子萌發(fā)的方法，更具體的步驟是：

采集成熟飽滿的種子，將種子置于溫度為15℃、相對(duì)濕度15％的環(huán)境中，至種子的平衡相對(duì)濕度達(dá)到15％時(shí)，將種子放入密閉容器，保存于-18℃至-20℃中，以上為國際通用的正常型種子保存方法。種子保存一段時(shí)間后，根據(jù)需要，將裝有種子的密閉容器取出，在溫度為15℃、相對(duì)濕度15％的環(huán)境中放置24小時(shí)回溫；隨后將種子從容器中取出，放置在培養(yǎng)箱溫度為45℃-55℃的培養(yǎng)箱中，熱處理6小時(shí)后取出，待種子溫度恢復(fù)到室溫后播種于含200毫克/升赤霉素的1％瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基放置于20℃下萌發(fā)，光照強(qiáng)度為1000勒克斯，光周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗。

具體實(shí)施方式

下面用本發(fā)明實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：

1.材料和方法：

1.1研究材料：

2014年10月，安徽黃山徽州區(qū)富溪鄉(xiāng)新田村采集成熟的新鮮尼泊爾野桐(mallotusnepalensis)種子。采集后運(yùn)回昆明植物研究所西南野生生物種質(zhì)資源庫種子保藏中心。

1.2研究方法：

1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回溫：將1.1步驟采集到的種子置于15℃，15％相對(duì)濕度的干燥間中干燥。定期以rotronicltd.公司生產(chǎn)的hygrolabc1unit相對(duì)濕度測定儀結(jié)合同一公司生產(chǎn)的rotronichc2-aw探頭對(duì)種子相對(duì)濕度進(jìn)行測定，待平衡相對(duì)濕度達(dá)到15％后裝入密閉的容器中。2015年9月14日將裝有種子的密閉容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏處理1年后將裝有種子的密閉容器取出。放入15℃，15％相對(duì)濕度的干燥間中24小時(shí)回溫后打開裝有種子的容器，隨機(jī)取出實(shí)驗(yàn)所需種子。

1.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將種子分為2組處理，分別為對(duì)照組和熱處理組；熱處理溫度設(shè)置45、55和60℃三個(gè)梯度，時(shí)間設(shè)置6個(gè)小時(shí)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20粒種子。

1.2.3熱處理方法：將種子放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為45、55和60℃。處理6小時(shí)后每個(gè)溫度隨機(jī)取出60粒種子用于萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4萌發(fā)：將熱處理后的種子取出，放置在室溫下，待種子溫度恢復(fù)到室溫后將種子播種于含有200毫克每升赤霉素的1％瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基裝入透明自封袋中防止水分散失，然后置于于20℃的光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度為1000勒克斯，光周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗。每間隔2-3天檢查一次萌發(fā)，胚根伸長超過5mm即認(rèn)為種子萌發(fā)，將萌發(fā)種子取出，并記錄萌發(fā)數(shù)量；實(shí)驗(yàn)開始4周后連續(xù)2周無萌發(fā)即結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.2.5數(shù)據(jù)分析：利用spss16.0軟件對(duì)萌發(fā)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用one-wayanova進(jìn)行方差分析，并用s-n-k法對(duì)不同溫度處理的萌發(fā)率做多重比較。

2.結(jié)果

2.1不同溫度熱處理對(duì)采自安徽黃山冷藏后的尼泊爾野桐種子萌發(fā)的影響：

表1不同溫度熱處理對(duì)冷藏后安徽黃山尼泊爾野桐種子萌發(fā)率(％)的影響

注：數(shù)字為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,不同字母表示不同處理間的萌發(fā)率具有顯著差異

由表1可以看出，-20℃下冷藏1年后未經(jīng)熱處理的種子均完全沒有萌發(fā)，45℃處理6小時(shí)后萌發(fā)率達(dá)到28.3％，55℃和60℃處理6小時(shí)后萌發(fā)率均為35％；45、55及60℃處理之間無顯著差異。綜合考慮能耗與效果，在下面的實(shí)施例2中，將采用45-55℃處理6小時(shí)的方法。

實(shí)施例2：

1.材料和方法：

1.1研究材料：

2012年9月4日云南省文山州文山縣采集成熟的新鮮尼泊爾野桐(mallotusnepalensis)種子。采集后運(yùn)回昆明植物研究所西南野生生物種質(zhì)資源庫種子保藏中心。

1.2研究方法：

1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回溫：將1.1采集到的種子置于15℃，15％相對(duì)濕度的干燥間中干燥。定期以rotronicltd.公司生產(chǎn)的hygrolabc1unit相對(duì)濕度測定儀結(jié)合同一公司生產(chǎn)的rotronichc2-aw探頭對(duì)種子相對(duì)濕度進(jìn)行測定，待平衡相對(duì)濕度達(dá)到15％后裝入密閉的容器中。2013年8月6日將裝有種子的密閉容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏3年2個(gè)月后將裝有種子的容器取出。放入15℃，15％相對(duì)濕度的干燥間中24小時(shí)回溫后打開裝有種子的容器，隨機(jī)取出實(shí)驗(yàn)所需種子。

1.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將種子分為2組處理，分別為對(duì)照組和熱處理組；熱處理溫度設(shè)置45和55℃二個(gè)梯度，處理時(shí)間均為6小時(shí)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20粒種子。

1.2.3熱處理方法：將種子放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為45和55℃。處理6小時(shí)后取出60粒種子用于萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4萌發(fā)：將熱處理后的種子取出，放置在室溫下，待種子溫度恢復(fù)到室溫后將種子播種于含有200毫克每升赤霉素的1％瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基裝入透明自封袋中防止水分散失，然后置于于20℃的光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度為1000勒克斯，光周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗。每間隔2-3天檢查一次萌發(fā)，胚根伸長超過5mm即認(rèn)為種子萌發(fā)，將萌發(fā)種子取出，并記錄萌發(fā)數(shù)量；實(shí)驗(yàn)開始4周后連續(xù)2周無萌發(fā)即結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.2.6數(shù)據(jù)分析：利用spss16.0軟件對(duì)萌發(fā)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用one-wayanova進(jìn)行方差分析，并用s-n-k法對(duì)不同處理的萌發(fā)率做多重比較。

2.結(jié)果

2.1不同溫度熱處理對(duì)采自云南文山冷藏后尼泊爾野桐種子萌發(fā)的影響。

表2不同溫度熱處理對(duì)冷藏后云南文山尼泊爾野桐種子萌發(fā)率(％)的影響

注：數(shù)字為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同字母表示不同處理間的萌發(fā)率具有顯著差異

由表2可以看出，-20℃下冷藏3年2個(gè)月的尼泊爾野桐種子，未經(jīng)熱處理的萌發(fā)率為0；經(jīng)45℃熱處理后，萌發(fā)率提高到6.7％，但是未達(dá)到有顯著差異的水平，55攝氏度處理后萌發(fā)率為20％，與對(duì)照及45℃處理的均有顯著差異。該份種子與實(shí)施例1中的種子在45℃熱處理的效果略有不同，55℃的效果類似，可能與這兩份種子產(chǎn)地不同有關(guān)。

3、本發(fā)明的積極效果如下：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明顯著提高了不同產(chǎn)地(安徽及云南)，干燥后低溫(-18℃至-20℃)下儲(chǔ)存不同時(shí)間(1年及3年2個(gè)月)的尼泊爾野桐種子的萌發(fā)。較好的解決了尼泊爾野桐種子低溫保藏后不能萌發(fā)的問題。且處理方法簡便易行，根據(jù)產(chǎn)地不同45℃的效果有所不同，但55℃均有顯著效果，而且無任何危險(xiǎn)性及毒副作用。