本發(fā)明屬于液體活檢技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種液體活檢血液中循環(huán)腫瘤核酸和細(xì)胞的穩(wěn)定劑及其采血管。

背景技術(shù)：

液體活檢，既有極高的科研價值，又具備助力推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療臨床實(shí)踐的巨大潛能。它可用于癌癥早期篩查、診斷、監(jiān)控、治療方案指導(dǎo)和療效評估等眾多領(lǐng)域，液體活檢的優(yōu)勢使其成為最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤診療手段。游離核酸作為新型的醫(yī)療診斷標(biāo)志物，與腫瘤學(xué)、產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷的發(fā)展有著非常密切的聯(lián)系，循環(huán)腫瘤主要來源于實(shí)體腫瘤的原發(fā)病灶從腫瘤組織中脫落進(jìn)入到血液循環(huán)中，并最終稱為腫瘤的早期診斷、個性化治療、療效檢測的標(biāo)志性檢測物質(zhì)。惡性腫瘤的高度異質(zhì)性使不同個體之間存在藥效的差異，腫瘤不斷進(jìn)化，在不同階段表現(xiàn)出不一樣的生物學(xué)特征，給臨床診治造成了很大困擾。侵襲與轉(zhuǎn)移能力高的腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散至循環(huán)血后，在特定的階段及環(huán)境中種植于身體某些部位，不斷增殖形成轉(zhuǎn)移瘤，且表現(xiàn)出與原發(fā)腫瘤不一樣的生物學(xué)特征。在抗腫瘤治療中，轉(zhuǎn)移瘤克隆進(jìn)化持續(xù)發(fā)生，抗腫瘤治療失敗繼而重演。相關(guān)研究表明游離dna與腫瘤細(xì)胞dna具有一致性，能全面的反應(yīng)腫瘤細(xì)胞中遺傳信息的變化，利用液體活檢技術(shù)能克服常規(guī)腫瘤組織活檢所無法突破的腫瘤異質(zhì)性問題。通過循環(huán)腫瘤核酸檢測，能幫助實(shí)時動態(tài)監(jiān)測腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)灶基因組信息，協(xié)助早期診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷，也有助于靶向治療適應(yīng)證的評估。在遺傳診斷領(lǐng)域，通過采集孕婦外周血，并提取血液中游離脫氧核糖核酸(cfdna)并進(jìn)一步分離出游離的胎兒脫氧核糖核酸(cffdna)，結(jié)合下一代測序技術(shù)(ngs)，結(jié)合相關(guān)生物信息分析，對胎兒的遺傳信息進(jìn)行分析達(dá)到無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的目的。

然而由于相關(guān)標(biāo)記物在血液中的含量極低并且其在常溫情況下降解速度快等特點(diǎn)加大了相關(guān)標(biāo)記物獲取的困難，并且相關(guān)血樣在保存及運(yùn)輸?shù)倪^程中都受到外界條件如地理、時間、空間、溫度等條件的擾動，對血樣造成了一定的破壞，加大了液體活檢實(shí)施的困難。由此可見，液體活檢的實(shí)施的關(guān)鍵在于相關(guān)生物樣品的獲取與保存的實(shí)現(xiàn)。

常規(guī)血樣進(jìn)行保存的穩(wěn)定劑一般采用咪唑烷基脲等防腐劑，該類物質(zhì)雖然能起到防腐功效，但會釋放出甲醛等有害成分，容易攻擊游離核酸，引起游離核糖核酸(cfrna)交連成雙鍵結(jié)構(gòu)無法檢測，游離脫氧核糖核酸(cfdna)化學(xué)鍵被破壞，雙鏈結(jié)構(gòu)無法打開，無法進(jìn)行擴(kuò)增、診斷，不能夠制成醫(yī)學(xué)用采血管，無醫(yī)學(xué)上的使用價值。

再者，在進(jìn)行于癌癥相關(guān)的液體活檢測應(yīng)用中，關(guān)鍵在于保證血樣中游離脫氧核糖核酸(cfdna)、循環(huán)腫瘤dna(cfdna)及野生型基因組的完整性，而現(xiàn)有液體活檢中對血樣進(jìn)行保存的穩(wěn)定劑，一般難以保證游離核酸不降解，在進(jìn)行下游分析時，難以提供足量游離核酸用于分析；同時血樣保存的常規(guī)穩(wěn)定劑中自由基的存在，加速了核酸降解，而且能夠殺死血液中的白細(xì)胞及癌細(xì)胞，無法滿足液體活檢的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有血樣保存穩(wěn)定劑難以滿足液體活檢中游離脫氧核糖核酸(cfdna)、循環(huán)腫瘤dna(cfdna)及野生型基因組的完整性及容易產(chǎn)生甲醛等有害成分等問題，本發(fā)明的目的在于提供一種符合醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的不含有甲醛等有害物質(zhì)且能夠用于液體活檢血液中循環(huán)腫瘤核酸和細(xì)胞保存的穩(wěn)定劑及其采血管。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供一種液體活檢血液中循環(huán)腫瘤核酸和細(xì)胞的穩(wěn)定劑，以重量份計，該穩(wěn)定劑包括20-100份的防腐劑、5-50份的抗氧化劑、1-35份的抗凝劑、5-20份的ph穩(wěn)定劑、5-20份的酶抑制劑、0.1-10份的細(xì)胞凋亡抑制劑、5-25份的自由基捕獲劑和1-10份的代謝抑制劑。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述防腐劑可以包括利福平、魚精蛋白、殼聚糖、果膠分解物、三氯叔丁醇、羧甲纖維素、聚山梨酯、山梨酸、羥苯乙酯和石墨烯納米抗菌材料等中的一種或多種的組合。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述防腐劑為由利福平、魚精蛋白、殼聚糖和羥苯乙酯所組成的組合物，其中利福平、魚精蛋白、殼聚糖和羥苯乙酯質(zhì)量比為(1-2)：(3-5)：(2-10)：(5-10)。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述石墨烯納米抗菌材料制備方法為：所述石墨烯納米抗菌材料制備方法為：利用水熱法培養(yǎng)石墨烯納米材料，并將1g石墨烯納米材料溶于50ml超純水中并超聲分散，得到分散液；然后向分散液中加入20g-50g的十八烷基二甲基三甲氧基硅烷基丙基氯化銨，超聲震蕩48h、水浴5h、攪拌反應(yīng)10h、過濾、洗滌、干燥得到石墨烯納米抗菌材料。

上述石墨烯納米抗菌材料制備方法中，水熱法培養(yǎng)、超聲分散、超聲震蕩、水浴、攪拌、過濾、洗滌、干燥等工藝條件均為本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際操作進(jìn)行合理調(diào)整。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述抗氧化劑可以包括維生素c、蝦青素、類胡蘿卜素、特丁基對苯二酚、二丁基羥基甲苯、二叔丁基羥基甲苯和2,3,6,7,10,11-六羥基三苯等中的一種或多種的組合。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述抗氧化劑為由維生素c、蝦青素、類胡蘿卜素和特丁基對苯二酚所組成的組合物，其中：維生素c、蝦青素、類胡蘿卜素和特丁基對苯二酚質(zhì)量比為(1-5)：(2-5)：(3-10)：(1-5)。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述抗凝劑可以包括草酸鉀、肝素、氯化鈉、二乙胺四乙酸鉀鹽和枸櫞酸鈉等中的一種或多種的組合。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述抗凝劑為二乙胺四乙酸鉀鹽。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述ph穩(wěn)定劑可以包括tris-hcl緩沖液和/或檸檬酸。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述酶抑制劑可以包括二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦、巰基乙醇和亞硫酸氫鈉等中的一種或多種的組合。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述細(xì)胞凋亡抑制劑可以包括q-vd-oph。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述自由基捕獲劑的制備方法包括以下步驟：

以多元胺作為引發(fā)劑，加入有機(jī)溶劑、催化劑和開環(huán)材料，進(jìn)行開環(huán)聚合，得到產(chǎn)物a；

將產(chǎn)物a用乙醚提純，然后用反向硅膠柱進(jìn)一步提純，得到產(chǎn)物b；

將產(chǎn)物b溶于有機(jī)溶劑中，加入催化劑和開環(huán)材料，進(jìn)行開環(huán)聚合，并采用乙醚和反向硅膠柱依次提純產(chǎn)物，得到兩親性多臂星形聚合物；

將納米材料溶于超純水中超聲，然后加入氨水及硅化劑進(jìn)行硅基化修飾，分離得到產(chǎn)物c，將產(chǎn)物c用氨基酸進(jìn)行包被，得到產(chǎn)物d；

取產(chǎn)物d、兩親性多臂星形聚合物，加入n-羥基琥珀酰亞胺進(jìn)行端基修飾反應(yīng)，得到自由基捕獲劑。

上述自由基捕獲劑的制備方法中，各物質(zhì)用量、開環(huán)聚合反應(yīng)條件、產(chǎn)物提純條件等均為本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際操作進(jìn)行合理調(diào)整。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述開環(huán)材料包括己內(nèi)酯、丙交酯、乙烯亞胺、環(huán)氧乙烷、谷氨酸和賴氨酸中的一種或多種的組合。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述催化劑可以包括辛酸亞錫和/或氯化鋅。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述多元胺可以包括三乙烯四胺、乙二胺、二乙烯三胺和四亞乙基五胺等中的一種或多種的組合。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑可以包括二氯甲烷或二甲基亞砜。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述氨基酸可以包括賴氨酸、絲氨酸和異亮氨酸等中的一種或多種的組合。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述兩親性多臂星形聚合物結(jié)構(gòu)式包括-n-(plga-pcl-)n、-n-(pga-pcl)n-、-n-(pei-pcl)n-和-n-(dphal-plga)n-中的一種或多種的組合；其中，n取值2,4,6或8，dphal為多聚賴氨酸。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述納米材料可以包括羥基磷灰石納米顆粒、中孔硅納米顆粒和金納米顆粒等中的一種或多種的組合。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述納米材料粒徑為20nm-1000nm。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述代謝抑制劑可以包括氨基葡萄糖鹽酸鹽、甘油醛、金精三羧酸、腺嘌呤、腺苷和磷酸二氫鈉等中的一種或多種的組合。

上述穩(wěn)定劑中，優(yōu)選地，所述代謝抑制劑為氨基葡萄糖鹽酸鹽、甘油醛和金精三羧酸的組合。

本發(fā)明還提供一種真空采血管，其管中裝載有上述的穩(wěn)定劑。

上述穩(wěn)定劑中，防腐劑選用石墨烯納米抗菌材料等，能夠解決現(xiàn)有血樣穩(wěn)定劑在保存過程中釋放出甲醛等有害成分，從而保護(hù)游離核酸。

上述穩(wěn)定劑中，制備的自由基捕獲劑中，納米材料能夠與核酸進(jìn)行可逆性的結(jié)合，捕獲自由基。在效果上可以在2ml的血液中提取足量的游離核酸進(jìn)行下游分析。對于cfdna的保存可以長達(dá)18天，cfrna的保存可以長達(dá)9天(37℃情況)，做到真正的常溫保存，滿足液體活檢的需要。制備的兩親性多臂星形聚合物利用其氮上的活潑氫進(jìn)行多臂化處理，增強(qiáng)納米材料的生物活性，并且修飾后的納米材料不會影響環(huán)境的滲透壓，避免了血細(xì)胞的破裂。

本發(fā)明提供的液體活檢血液中循環(huán)腫瘤核酸和細(xì)胞的穩(wěn)定劑及其采血管，能夠運(yùn)用一步法進(jìn)行相關(guān)樣品的快速分離，能夠有效保存胎兒游離核酸，防止循環(huán)腫瘤核酸交聯(lián)性損傷并保證野生型基因的完整性，防止細(xì)胞裂解及其血液基因組核酸的釋放，實(shí)現(xiàn)癌癥患者的血樣中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及循環(huán)腫瘤核酸的常溫保存與運(yùn)輸。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例4中單離心體系和雙離心體系對應(yīng)β-actin拷貝數(shù)結(jié)果數(shù)據(jù)圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例5中室溫條件下熒光pcr擴(kuò)增β-actin及sry進(jìn)行擴(kuò)增測定cfdna和cffdna濃度對比實(shí)驗圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例5中35℃條件下熒光pcr擴(kuò)增β-actin及sry進(jìn)行擴(kuò)增測定cfdna和cffdna濃度對比實(shí)驗圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例6中健康自愿者血樣中cfdna突變率分布圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例6中直腸癌患者血樣中cfdna突變率分布圖。

具體實(shí)施方式

為了對本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說明，但不能理解為對本發(fā)明的可實(shí)施范圍的限定。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種液體活檢血液中循環(huán)腫瘤核酸和細(xì)胞的穩(wěn)定劑，以重量份計，該穩(wěn)定劑包括50mg的防腐劑(石墨烯納米抗菌材料)、25mg的二叔丁基羥基甲苯、10mg的二乙胺四乙酸二鉀、15mg的巰基乙醇、2mg的細(xì)胞凋亡抑制劑q-vd-oph、20mg的自由基捕獲劑和10mg的金精三羧酸，通過改變ph穩(wěn)定劑檸檬酸的含量，使穩(wěn)定劑最終ph值在4-5之間。

本實(shí)施例的穩(wěn)定劑中，所述石墨烯納米抗菌材料制備方法為：利用水熱法培養(yǎng)石墨烯納米材料，并將1g石墨烯納米材料溶于50ml超純水中并超聲分散，得到分散液；然后向分散液中加入20-50g的十八烷基二甲基三甲氧基硅烷基丙基氯化銨超聲震蕩48小時、水浴5小、攪拌反應(yīng)10小時、過濾洗滌、干燥得到石墨烯納米抗菌材料。

本實(shí)施例的穩(wěn)定劑中，所述自由基捕獲劑的制備方法為：

以乙二胺作為引發(fā)劑，溶于50ml二氯甲烷中以辛酸亞錫為催化劑、引發(fā)賴氨酸發(fā)生開的開環(huán)聚合，得到產(chǎn)物a；其中乙二胺與賴氧酸的摩爾比為1:20；

將產(chǎn)物a用乙醚提純，然后用反向硅膠柱進(jìn)一步提純，得到產(chǎn)物b；

將產(chǎn)物b溶于50ml二氯甲烷中，以氯化鋅為催化劑、引發(fā)丙交酯發(fā)生開環(huán)聚合，并提純產(chǎn)物，得到兩親性多臂星形聚合物-n-(dphal-plga)2-，其中產(chǎn)物b與丙交酯的摩爾比為1:20。

將納米材料1g羥基磷灰石納米顆粒(粒徑為50nm)溶于超純水中超聲，然后加入50ml氨水及80-100g氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行硅基化修飾，分離得到產(chǎn)物c，將產(chǎn)物c用賴氨酸進(jìn)行包被，得到產(chǎn)物d。

取產(chǎn)物d、兩親性多臂星形聚合物-n-(dphal-plga)2-，加入過量的n-羥基琥珀酰亞胺進(jìn)行端基修飾反應(yīng)，得到自由基捕獲劑。

本實(shí)施例還提供一種真空采血管，其裝載有本實(shí)施例制備的穩(wěn)定劑。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供一種液體活檢血液中循環(huán)腫瘤核酸和細(xì)胞的穩(wěn)定劑，以重量份計，該穩(wěn)定劑包括35mg的石墨烯納米抗菌材料20mg的特丁基對苯二酚、35mg的二乙胺四乙酸二鉀、10mg的二硫蘇糖醇、5mg的細(xì)胞凋亡抑制劑q-vd-oph、25mg的自由基捕獲劑和5mg的氨基葡萄糖鹽酸鹽，通過改變ph穩(wěn)定劑檸檬酸的含量，使穩(wěn)定劑最終ph值在4-5之間。

本實(shí)施例的穩(wěn)定劑中，所述石墨烯納米抗菌材料制備方法為：利用水熱法培養(yǎng)石墨烯納米材料，并將1g石墨烯納米材料溶于50ml超純水中并超聲分散，得到到分散液；然后向分散液中加入20-50g十八烷基二甲基三甲氧基硅烷基丙基氯化銨超聲震蕩48小時、水浴5小、攪拌反應(yīng)10小時、過濾洗滌、干燥得到石墨烯納米抗菌材料。

本實(shí)施例的穩(wěn)定劑中，所述自由基捕獲劑的制備方法為：

以二乙烯三胺作為引發(fā)劑，溶解到50ml二氯甲烷溶液中、在酸性條件下引發(fā)乙烯亞胺的聚合開環(huán)反應(yīng)，得到產(chǎn)物a，其中，二乙烯三胺與乙烯亞胺的摩爾比為1:3；

將產(chǎn)物a用乙醚提純，然后用反向硅膠柱進(jìn)一步提純，得到產(chǎn)物b；

將產(chǎn)物b溶于50ml二氯甲烷中，加入辛酸亞錫作為催發(fā)劑、引發(fā)己內(nèi)酯的聚合開環(huán)反應(yīng)，并提純產(chǎn)物，得到兩親性多臂星形聚合物-n-(pei-pcl)6-，其中，產(chǎn)物b與己內(nèi)酯摩爾比為1:60。

將2g納米金材料(粒徑為100nm)溶于超純水中超聲，然后加入50ml氨水及35g硅化劑進(jìn)行硅基化修飾，分離得到產(chǎn)物c，將產(chǎn)物c用10g賴氨酸進(jìn)行包被，得到產(chǎn)物d；

取產(chǎn)物d、兩親性多臂星形聚合物-n-(pei-pcl)6-，加入過量的n-羥基琥珀酰亞胺進(jìn)行端基修飾反應(yīng)，得到自由基捕獲劑。

本實(shí)施例還提供一種真空采血管，其裝載有本實(shí)施例制備的穩(wěn)定劑。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供一種液體活檢血液中循環(huán)腫瘤核酸和細(xì)胞的穩(wěn)定劑，以重量份計，該穩(wěn)定劑包括25mg的防腐劑(由利福平、魚精蛋白、殼聚糖和羥苯乙酯所組成的組合物，其中：利福平、魚精蛋白、殼聚糖和羥苯乙酯質(zhì)量比為1:5:2:5)、25mg的2,3,6,7,10,11-六羥基三苯、25mg的二乙胺四乙酸二鉀、15mg的亞硫酸氫鈉、10mg的細(xì)胞凋亡抑制劑q-vd-oph、25mg的自由基捕獲劑和5mg的氨基葡萄糖鹽酸鹽，通過改變ph穩(wěn)定劑檸檬酸的含量，使穩(wěn)定劑最終ph值在4-5之間。

本實(shí)施例的穩(wěn)定劑中，所述自由基捕獲劑的制備方法為：

以乙二胺作為引發(fā)劑，溶解到50ml二氯甲烷溶液中、以辛酸亞錫為催化劑、引發(fā)谷氨酸的聚合開環(huán)反應(yīng)，得到產(chǎn)物a，其中，乙二胺與谷氨酸的摩爾比為1:10；

將產(chǎn)物a用乙醚提純，然后用反向硅膠柱進(jìn)一步提純，得到產(chǎn)物b；

將產(chǎn)物b溶于50ml二氯甲烷中，加入辛酸亞錫作為催發(fā)劑、引發(fā)己內(nèi)酯的聚合開環(huán)反應(yīng)，并提純產(chǎn)物，得到兩親性多臂星形聚合物-n-(pga-pcl)2-，其中，產(chǎn)物b與己內(nèi)酯摩爾比為1:60。

將2g納米材料中孔硅納米顆粒(粒徑為50nm)溶于超純水中超聲，然后加入50ml氨水及35g硅化劑進(jìn)行硅基化修飾，分離得到產(chǎn)物c，將產(chǎn)物c用10g異亮氨酸進(jìn)行包被，得到產(chǎn)物d；

取產(chǎn)物d、兩親性多臂星形聚合物-n-(pga-pcl)2-，加入過量的n-羥基琥珀酰亞胺進(jìn)行端基修飾反應(yīng)，得到自由基捕獲劑。

本實(shí)施例還提供一種真空采血管，其裝載有本實(shí)施例制備的穩(wěn)定劑。

實(shí)施例4游離核酸快速分離實(shí)驗

本實(shí)施例1的采血管除了利用的雙離心體系之外，還可利用單離心體系進(jìn)行快速分離，操作更加便捷。通過收集分為3組樣品即為一組單離心體系(即，1600×g為15分鐘)和兩組雙離心體系(即，300×g為20分鐘隨后由5000×10分鐘或1600×g為10分鐘，其次為16000×g10分鐘)，分別并利用本實(shí)施例1采血管采取并保存血液樣品在25度溫度下靜置保存0天，7天和14天。并提取游離dna。并利用ddpcr測定β-actin的拷貝數(shù)，其結(jié)果如圖1所示，其結(jié)果證明快速分離法與二步分離法沒有明顯的差別。因此本實(shí)施例提供的采血管利用單離心體系進(jìn)行快速分離，相比二步分離法操作更加便捷。

實(shí)施例5胎兒游離dna(cell-freefetaldna,cffdna)的存儲和運(yùn)輸對比試驗

對22名經(jīng)羊水穿刺診斷表明其具有胎兒y染色體異常的孕婦志愿者進(jìn)行采血取樣，每名孕婦采取20ml血樣，分別用二支5ml普通k2edta抗凝管及二支本實(shí)施例1的采血管進(jìn)行取樣。將各組第一支血樣立即處理，將第二血進(jìn)行如下處理：將k2edta抗凝管中的血樣置于泡沫箱中并加入足夠量的干冰，密封。將二組樣品均放置于搖床上，置于室溫條件下，其轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，放置7天，用以模擬血樣的運(yùn)輸過程。使用兩步法進(jìn)行樣品的分離并利用qiamp試劑盒提取樣品中的游離核酸，進(jìn)而利用rochelightcycler480對β-actin及sry進(jìn)行擴(kuò)增，用以測定其cfdna及cffdna的濃度，其結(jié)果如圖2所示。

由圖2實(shí)驗結(jié)果可知：本實(shí)施例通過實(shí)時熒光pcr擴(kuò)增β-actin基因片段來表征cfdna濃度，并通過擴(kuò)增sry基因片段用來表征cffdna。如圖2所示，在加入大量的干冰的情況下k2edta抗凝管中的sry濃度經(jīng)過7天運(yùn)輸，其中位數(shù)為25.9copys/ml(p＜0.01)；在不加干冰的情況下，本采血管可以穩(wěn)定胎兒游離dna其濃度為33.4copys/ml。此外，我們還可明顯的觀察到，在采用k2edta抗凝管運(yùn)輸?shù)倪^程中，血液中總游離核酸含量產(chǎn)生了明顯的增加，這是由于其血液發(fā)生了溶血現(xiàn)象，引起血細(xì)胞破裂，導(dǎo)致其含量上升。而經(jīng)本采血管保存的血樣沒有發(fā)生上述問題，說明本采血管中的穩(wěn)定劑能夠有效保存胎兒游離核酸。

用相同的方法對18名志愿者進(jìn)行采血取樣，每名孕婦采取20ml血樣，分別用二支5ml普通k2edta抗凝管及二支本實(shí)施例采血管進(jìn)行取樣。將各組第一支血樣立即處理，將第二血進(jìn)行如下處理：將k2edta抗凝管中的血樣置于泡沫箱中并加入足夠量的干冰密封，將二組樣品均放置于35℃條件下3天。利用qiamp試劑盒提取樣品中的游離核酸，并利用rochelightcycler480對β-actin及sry進(jìn)行擴(kuò)增，用以測定其cfdna及cffdna的濃度，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3實(shí)驗結(jié)果可知：在室溫高于30℃的情況下，樣品中的sry濃度經(jīng)過沒有明顯的變化。然而，在采用k2edta抗凝管保存的過程中，血液中總游離核酸含量產(chǎn)生了明顯的增加，血液發(fā)生了較為明顯的溶血現(xiàn)象。

實(shí)施例6循環(huán)腫瘤dna(ctdna)突變檢測對比試驗

血漿基因分型在臨床測試中具有不可估量的應(yīng)用潛力，這種癌癥常規(guī)基因標(biāo)志的快速與無創(chuàng)篩查可以避免傳統(tǒng)侵入性的活組織檢查。與癌征相關(guān)的液體活檢測應(yīng)用的關(guān)鍵是保證所采取的血樣中的游離脫氧核糖核酸(cfdna)、循環(huán)腫瘤dna(ctdna)及野生型基因組的完整性，但很多細(xì)胞穩(wěn)定劑中含有可引起游離dna交聯(lián)性損傷，在使用pcr擴(kuò)增檢測時會導(dǎo)致野生型dna突變率的增加，針對這一現(xiàn)象本案例對本產(chǎn)品在突變率及野生型基因組的完整性的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的評估。

抽取30個健康志愿者的靜脈血保存分別保存至普通k2edta抗凝管、本實(shí)施例1采血管并加入一定量的突變核酸片段有以模擬典型癌征病人的血液特征。將所采集的樣品進(jìn)行如下處理：將k2edta抗凝管中的血樣置于泡沫箱中并加入足夠量的干冰，密封、靜置保存；對本采血管采取到的血液不做作任何特殊處理，直接放入搖床中，其轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，用以模型運(yùn)輸過對血樣造成的影響。所有樣品均置于室溫條件下。采用二步離心法進(jìn)行離心，利用qiamp試劑盒提取樣品中的游離核酸，k2edta抗凝管利用beaming技術(shù)檢測技術(shù)，檢測其k2edta抗凝管2h以及本采血管中的血樣在2h、3d、5d及7d的血樣中游離核酸變異情況，檢測結(jié)果如圖4所示。

由圖4實(shí)驗結(jié)果可知：本采血管在采集的過程中對血液中的核酸分布情況沒有影響，與傳統(tǒng)的采集方法相比，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析表明本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法所采到的血液樣品沒有顯著差別(見圖4第一組及第二組數(shù)據(jù))。另外本采血管可以用于常溫運(yùn)輸與保存血液中循環(huán)腫瘤核酸樣品，其模擬血樣在2h、3d、5d及7d的血樣中循環(huán)腫瘤核酸均未發(fā)現(xiàn)變異情況。這說明本采血管中的穩(wěn)定劑具有穩(wěn)定血液細(xì)胞，防止cfdna交聯(lián)性損傷，保證野生型基因的完整性作用。

為了進(jìn)一步驗證上述結(jié)論，我們進(jìn)一步抽取1名患有直腸癌患者的靜脈血10ml，分別用二支5ml本采血管進(jìn)行取樣，并做如下處理：將其中一個樣本室溫下靜置保存2h；另一個樣品直接放入搖床中，其轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，運(yùn)行5天，用以模型運(yùn)輸過對血樣造成的影響。，采用二步法進(jìn)行樣品的分離，并利用qiamp試劑盒提取樣品中的ctdna，利用beaming技術(shù)分析自愿者血樣中游離核酸的突變率，檢測結(jié)果如圖5所示。

由圖5實(shí)驗結(jié)果可知：直腸癌患者血液中的ctdna在2h和3d內(nèi)突變率未見明顯增加，由些可見，本采血管中穩(wěn)定劑可保存循環(huán)腫瘤dna的完整性，可以運(yùn)用于癌癥的診斷。

實(shí)施例7癌癥患者血樣的常溫保存對比實(shí)驗

循環(huán)腫瘤dna(ctdna)被越來越多地用于生物醫(yī)學(xué)和臨床研究遺傳試驗標(biāo)記物。然而，血液收集引起的血細(xì)胞破裂，會導(dǎo)致污染的血漿中的dna的增加，進(jìn)而影響ctdna的分析與診斷。本申請?zhí)峁┑姆€(wěn)定劑可以防止血細(xì)胞破裂達(dá)數(shù)周之久，并擁有保存循環(huán)腫瘤dna的能力，便于血液采集及分析樣品制備，提高結(jié)果的準(zhǔn)確度。

本實(shí)施方法選取經(jīng)診斷患有乳腺癌并且均發(fā)現(xiàn)pik3ca基因突變的志愿者6名，每名病人收集4支血樣各5ml，分別用二支普通k2edta抗凝管及二支本申請實(shí)施例1的采血管進(jìn)行取樣及保存。將各組第一支血樣立即處理，將第二血進(jìn)行如下處理：將k2edta抗凝管中的血樣置于泡沫箱中并加入足夠量的干冰，密封。將二組樣品均放置于搖床上，置于室溫條件下，其轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，放置7天，用以模擬血樣的運(yùn)輸過程。使用兩步法進(jìn)行樣品的分離并利用qiamp試劑盒提取樣品中的游離核酸，進(jìn)而利用ddpcr對e545k及h1047r位點(diǎn)進(jìn)行檢測進(jìn)而對pik3ca基因突變進(jìn)行識別以及對其野生型等位基因進(jìn)行別識，其結(jié)果如下表1所示。

表1

由表1實(shí)驗結(jié)果可知，通過對比野生型pik3ca基因和檢測兩pik3ca基因的二個突變位點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，儲存在本申請采血管中的血樣7天沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞破解現(xiàn)象，而保存在抗凝管中的基因組基因的量明顯增加，說明大量的血細(xì)胞發(fā)生破裂。由于可見，本申請采血管中的穩(wěn)定劑能夠防止細(xì)胞裂解及其血液基因組dna的釋放，實(shí)現(xiàn)癌癥患者的血樣的常溫保存。

實(shí)施例8游離核糖核酸(cfrna)的保存

本實(shí)施方法選取身體健康的志愿者8名，每名志愿者收集8支血樣各5ml，分別用4支普通k2edta抗凝管及4支實(shí)施例1采血管進(jìn)行取樣及保存。將各組其中一支血樣立即處理，將第余下血樣進(jìn)行如下處理：將k2edta抗凝管中的血樣置于泡沫箱中并加入足夠量的干冰，密封。將二組樣品均放置于搖床上，置于室溫條件下，其轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，分別放置1天、3天、7天，用以模擬血樣的運(yùn)輸過程。使用兩步法進(jìn)行樣品的分離并利用qiamp試劑盒提取樣品中的游離核酸。將提取到的rna采用rt-qpcr檢測18srrna，其上下游引物序列分別為：

上游引物(如seqidno：1所示)5’-cgaatgtctgccctatcaac-3’；

下游引物(如seqidno：2所示)5’-gtttctcaggcccctctcc-3’。

其結(jié)果如下表2所示。

表2

由上表2實(shí)驗數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明采血管中穩(wěn)定劑可以在長達(dá)7天的時間里穩(wěn)定血液中的cfrna，而在相同的條件下，即使加入的大量的干冰，k2edta抗凝管也無法順利保存及穩(wěn)定血液中的cfrna。

綜上所述，本發(fā)明提供的液體活檢血液中循環(huán)腫瘤核酸和細(xì)胞的穩(wěn)定劑及其采血管，能夠運(yùn)用一步法進(jìn)行相關(guān)樣品的快速分離，能夠有效保存胎兒游離核酸，防止循環(huán)腫瘤核酸交聯(lián)性損傷并保證野生型基因的完整性，防止細(xì)胞裂解及其血液基因組核酸的釋放，實(shí)現(xiàn)癌癥患者的血樣中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及循環(huán)腫瘤核酸的常溫保存與運(yùn)輸。

序列表

<110>云南仁橋醫(yī)療科技有限公司

<120>液體活檢血液中循環(huán)腫瘤核酸和細(xì)胞的穩(wěn)定劑及其采血管

<130>gai17cn0491

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

cgaatgtctgccctatcaac20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

gtttctcaggcccctctcc19