技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于昆蟲病原線蟲培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及一種利用海藻酸顆粒承載液體培養(yǎng)基，進行半固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)昆蟲病原線蟲。
背景技術(shù)：
小卷蛾斯氏線蟲是一種以昆蟲為寄主的昆蟲病原線蟲。處于侵入期的昆蟲病原線蟲能自主尋找寄主，侵入寄主的線蟲從腸道中釋放昆蟲致病桿菌，桿菌在寄主中大量繁殖導致寄主迅速死亡。國際上常用于防治害蟲的昆蟲病原線蟲主要屬于斯氏線蟲屬和異小桿線蟲屬。斯氏線蟲有10個種，異小桿線蟲有3個種。在工業(yè)化國家生物農(nóng)藥市場上，市場份額僅次于蘇云金芽孢桿菌，占第二位。這類線蟲對土棲性害蟲和鉆蛀性害蟲有較強的殺滅作用。昆蟲病原線蟲可規(guī)模化培養(yǎng)，且使用方便，對人畜安全，不污染環(huán)境，在美國是免注冊產(chǎn)品。我國已開發(fā)了不少殺蟲線蟲品種，目前處于中試推廣應用階段，均無注冊成產(chǎn)品。
產(chǎn)業(yè)化昆蟲病原線蟲，需要高效，穩(wěn)定的病原線蟲培養(yǎng)方法。在美國、德國等生物農(nóng)藥發(fā)達的國家一般采用液體法培養(yǎng)昆蟲病原線蟲。而我國昆蟲病原線蟲產(chǎn)業(yè)化起步較晚，從事昆蟲病原線蟲產(chǎn)業(yè)化的企業(yè)采用都是固體培養(yǎng)和非離體培養(yǎng)。非離體培養(yǎng)昆蟲病原線蟲一般包括線蟲培養(yǎng)和分離兩步驟，目前所采用方法中線蟲和營養(yǎng)液混合在一起，分離過程需要多次清洗和沉降，才能將線蟲與營養(yǎng)液以及營養(yǎng)液中混雜的固形物分離。因此，非離體培養(yǎng)法，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基與線蟲在一起，給后期線蟲的分離帶來了一定的困難，線蟲中混合培養(yǎng)基直接導致線蟲的存貯活力下降，以及運輸過程中死亡率增加。將培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分固定在固相中，后期線蟲分離簡單便捷，對線蟲的培養(yǎng)與分離有著重大作用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服原來技術(shù)上營養(yǎng)物質(zhì)與線蟲分離困難這一技術(shù)難題，本發(fā)明提供了一種利用海藻酸顆粒承載液體培養(yǎng)基，進行半固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)昆蟲病原線蟲新方法。將配制好的線蟲培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，加入3-5%的海藻酸鈉，加熱溶解。配制飽和氯化鈣溶液，將海藻酸鈉營養(yǎng)液，滴入飽和氯化鈣溶液形成顆粒。將海藻酸顆粒撈出，去離子不沖洗3-5遍，晾干表面水分。高壓滅菌后接種昆蟲病原線蟲共生桿菌，培養(yǎng)72小時后接種線蟲，繼續(xù)培養(yǎng)14天后，直接用去離子水將昆蟲病原線蟲沖出。
具體實施方式：
下面列舉了實例，對本發(fā)明進行進一步說明：
實施例1將配制好的線蟲培養(yǎng)用的培養(yǎng)基100ml（植物蛋白5%，動物蛋白5%，植物油3%，蔗糖0.5%，蛋白胨1%，酵母膏1%），加入5g的海藻酸鈉，加熱溶解。配制飽和氯化鈣溶液，將海藻酸鈉營養(yǎng)液，滴入飽和氯化鈣溶液形成顆粒。將海藻酸顆粒撈出，去離子水沖洗5遍，晾干表面水分。置于500子力學ml三角瓶中，約150ml容量，高壓滅菌外理20分鐘，將準備好的昆蟲病原線蟲共生桿菌種子液，接種昆蟲病原線蟲共生桿菌10ml，搖床培養(yǎng)72小時（25攝氏度），待桿菌在海藻酸顆粒上長勻后，接種線蟲10萬尾每瓶，繼續(xù)培養(yǎng)14天后，直接用去離子水將昆蟲病原線蟲沖出，線蟲數(shù)量為2500萬尾。
附圖說明
附圖1海藻酸顆粒承載液體培養(yǎng)基三角瓶生產(chǎn)昆蟲病原線蟲實圖。