本發(fā)明涉及作物栽培籽粒培養(yǎng)領(lǐng)域。具體涉及到一種玉米籽粒離體培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

玉米是一年生禾本科草本植物，是重要的糧食作物和重要的飼料來(lái)源，也是總產(chǎn)量很高的糧食作物。

玉米的器官有根、莖、葉、雄穗、雌穗等。其中，雌穗是肉穗花序，受精結(jié)實(shí)發(fā)育成果穗，果穗中心有穗軸，玉米花絲依附于果穗，苞葉包裹在外部。玉米的生長(zhǎng)受到諸多因素的影響，大致有溫度、濕度、溫差、日照時(shí)數(shù)、玉米病害、本身的遺傳因素以及營(yíng)養(yǎng)元素等。

近年來(lái)，我國(guó)華北、西北和東北等區(qū)域頻繁地出現(xiàn)高溫和干旱等極端性氣候，且高溫和干旱持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)，對(duì)全國(guó)玉米產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生了重要影響，已成為我國(guó)玉米生產(chǎn)的主要限制因子；另外，我國(guó)6-8月份華北、黃淮海地區(qū)連陰雨災(zāi)害經(jīng)常發(fā)生，玉米生育期內(nèi)日照不足會(huì)直接影響營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、碳氮代謝及產(chǎn)量的形成；此外，玉米生育后期的病害，如穗腐病、瘤黑粉病，也是造成玉米產(chǎn)量下降的一大原因。

除了上述生物和非生物逆境對(duì)玉米籽粒生長(zhǎng)發(fā)育的影響，在適宜的條件下，玉米籽粒庫(kù)容建成及充實(shí)主要受遺傳控制，但在大田條件下，營(yíng)養(yǎng)元素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)粒重的增加也起著調(diào)控作用。

目前針對(duì)以上生物和非生物逆境，營(yíng)養(yǎng)元素及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)玉米籽粒生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究多采用人工氣候室和大田試驗(yàn)。由于玉米生育后期植株高大，人工氣候室往往因場(chǎng)地限制不能滿(mǎn)足玉米的生長(zhǎng)要求，且無(wú)法大批量操作。而大田試驗(yàn)因受外界環(huán)境因素影響較大，無(wú)法深入研究某一脅迫或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)籽粒生長(zhǎng)發(fā)育的影響?，F(xiàn)有的玉米籽粒離體培養(yǎng)技術(shù)多集中在1980s，如1977年gengenbach提出的玉米果穗離體培養(yǎng)系統(tǒng)，1981年jones提出的玉米籽粒固體培養(yǎng)技術(shù)，1989年singletary和below提出的玉米籽粒液體培養(yǎng)技術(shù)。但上述三種方法在玉米籽粒培養(yǎng)過(guò)程中很容易出現(xiàn)染菌、籽粒不能培養(yǎng)至成熟、籽粒爆裂等問(wèn)題。

因此，為了更好地研究影響玉米籽粒生長(zhǎng)發(fā)育的因素，目前亟需一種新的玉米籽粒離體培養(yǎng)技術(shù)，從而避免在籽粒培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)上述問(wèn)題。

公開(kāi)于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種玉米籽粒離體培養(yǎng)方法，從而避免在籽粒培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)染菌、籽粒不能培養(yǎng)至成熟、籽粒爆裂等問(wèn)題，且能將籽粒培養(yǎng)至成熟，從而能夠更好地研究影響玉米籽粒發(fā)育的因素。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種玉米籽粒離體培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

(1)將玉米果穗剝?nèi)グ~，剪去花絲，用酒精滅菌；

(2)將所述滅菌后的玉米果穗分塊獲得玉米樣塊；

(3)將所述玉米樣塊進(jìn)行分粒；

(4)將所述通過(guò)分粒獲得的玉米籽粒放入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

其中所述培養(yǎng)基的組分包括氨基酸母液、大量元素母液、微量元素母液、有機(jī)母液、鐵鹽母液和碳源。

上述玉米籽粒離體培養(yǎng)方法在另一種實(shí)施方式中，在步驟(1)中用75％的酒精將剪去花絲的玉米果穗進(jìn)行滅菌，然后將所述滅菌后的玉米果穗轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)。

上述玉米籽粒離體培養(yǎng)方法在另一種實(shí)施方式中，在步驟(2)中，所述分塊為：將所述玉米果穗在與穗軸垂直的方向切出相鄰三圈籽粒作為玉米樣塊，然后將所述玉米樣塊在與穗軸平行方向切出相鄰3列籽粒并至少保留這3列籽粒的部分穗軸，獲得9顆玉米籽粒及其穗軸。

上述玉米籽粒離體培養(yǎng)方法在另一種實(shí)施方式中，在步驟(3)中，所述分粒為：切除所述獲得的9顆玉米籽粒中的8顆玉米籽粒及其穗軸，保留所述9顆玉米籽粒中央的1顆籽粒及其穗軸，然后將所述保留的1顆籽粒所連接的穗軸進(jìn)行部分切除，得到連接有部分穗軸的玉米籽粒。

上述玉米籽粒離體培養(yǎng)方法在另一種實(shí)施方式中，所述氨基酸母液包括谷氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、精氨酸、色氨酸、絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；所述大量元素母液包括kh2po4，mgcl2·6h2o和cacl2·6h2o；所述微量元素母液包括h3bo3，mnso4·h2o，znso4·7h2o，ki，namoo4·2h2o，cuso4·5h2o和cocl2·6h2o；所述有機(jī)母液包括鹽酸硫胺素、葉酸和煙酸；所述鐵鹽母液包括edta·2na和feso4·7h2o；所述碳源包括蔗糖。

上述玉米籽粒離體培養(yǎng)方法在另一種實(shí)施方式中，所述氨基酸母液中各組分的濃度分別為：谷氨酸600-650mg/l、蛋氨酸40-45mg/l、丙氨酸150-180mg/l、酪氨酸85-98mg/l、組氨酸45-65mg/l、蘇氨酸65-75mg/l、脯氨酸200-250mg/l、精氨酸45-60mg/l、色氨酸65-80mg/l、絲氨酸110-130mg/l、甘氨酸55-65mg/l、纈氨酸105-125mg/l、亮氨酸355-365mg/l、賴(lài)氨酸30-35mg/l、谷氨酰胺100-110mg/l、苯丙氨酸130-140mg/l、異亮氨酸80-90mg/l、半胱氨酸50-60mg/l、天冬氨酸170-180mg/l和天冬酰胺102-110mg/l；所述大量元素母液中各組分的濃度分別為kh2po44.5-5.5g/l，mgcl2·6h2o2.5-3.5g/l和cacl2·6h2o1.2-2.5g/l；所述微量元素母液中各組分的濃度分別為h3bo30.5-0.7g/l，mnso4·h2o1.5-1.8g/l，znso4·7h2o0.1-0.4g/l，ki0.05-0.15g/l，namoo4·2h2o0.01-0.04g/l，cuso4·5h2o0.001-0.004g/l和cocl2·6h2o0.001-0.004g/l；所述有機(jī)母液中各組分的濃度為鹽酸硫胺素0.02-0.06g/l、葉酸0.002-0.006g/l和煙酸0.005-0.03g/l；所述鐵鹽母液中各組分的濃度為edta·2na30-45mg/l和feso4·7h2o20-35mg/l；所述碳源中所包含的蔗糖的濃度為130-170g/l。

上述玉米籽粒離體培養(yǎng)方法在另一種實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包括固體培養(yǎng)基，并且所述固體培養(yǎng)基通過(guò)如下步驟制備：

在容量為2l的燒杯中倒入200-300ml蒸餾水，然后加入所述氨基酸母液80-120ml、所述大量元素母液80-120ml、所述微量元素母液8-12ml、所述有機(jī)母液8-12ml、所述鐵鹽母液3-6ml和所述碳源130-160g，攪拌溶解得到混合溶液，將所述混合溶液加入到容量瓶中，用蒸餾水定容至1l，用hcl或naoh調(diào)整ph值至5.7-5.8，再加入5-6g凝固劑，加熱至沸騰，直至所述凝固劑完全融化，然后分裝于容量為250ml的錐形瓶中，其中每個(gè)錐形瓶分裝35-45ml，將所述錐形瓶瓶口進(jìn)行封口，放入高壓滅菌鍋，110-130℃滅菌15-25分鐘獲得所述固體培養(yǎng)基；其中所述凝固劑包括瓊脂，并且所述瓊脂的濃度為3-7g/l。

上述玉米籽粒離體培養(yǎng)方法在另一種實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包括液體培養(yǎng)基，并且所述液體培養(yǎng)基通過(guò)如下步驟制備：

在容量為2l的燒杯中倒入200-300ml蒸餾水，然后加入所述氨基酸母液80-120ml、所述大量元素母液80-120ml、所述微量元素母液8-12ml、所述有機(jī)母液8-12ml、所述鐵鹽母液3-6ml和所述碳源130-160g，攪拌溶解得到混合溶液，將所述混合溶液加入到容量瓶中，用蒸餾水定容至1l，用hcl或naoh調(diào)整ph值至5.7-5.8，然后分裝于容量為250ml的錐形瓶中，其中每個(gè)錐形瓶分裝35-45ml，將所述錐形瓶瓶口進(jìn)行封口，放入高壓滅菌鍋，110-130℃滅菌15-25分鐘獲得所述液體培養(yǎng)基。

上述玉米籽粒離體培養(yǎng)方法在另一種實(shí)施方式中，將所述得到的玉米籽粒的穗軸部分向下插入所述固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

上述玉米籽粒離體培養(yǎng)方法在另一種實(shí)施方式中，在培養(yǎng)皿中加入所述液體培養(yǎng)基，將支撐物放入所述液體培養(yǎng)基中，在所述支撐物上面覆蓋濾紙，然后將所述得到的玉米籽粒的穗軸部分放在由所述支撐物支撐的所述濾紙之上進(jìn)行培養(yǎng)，其中所述培養(yǎng)皿的直徑為6-10cm，所述支撐物的高度為0.5cm-1.5cm，所述培養(yǎng)皿中需要加入所述液體培養(yǎng)基10-15ml。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本申請(qǐng)通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基組分和配比，形成了一套成熟的玉米籽粒離體培養(yǎng)方法，該玉米籽粒離體培養(yǎng)方法在保證滅菌的前提下節(jié)省了現(xiàn)有技術(shù)中多種滅菌劑的使用，從而簡(jiǎn)化了滅菌過(guò)程，降低了污染率，從而能避免在籽粒培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)染菌、籽粒不能培養(yǎng)至成熟、籽粒爆裂等問(wèn)題，并且減少了對(duì)玉米果穗造成過(guò)多切口，對(duì)籽粒的傷害程度降到最低，從而能將籽粒培養(yǎng)至成熟；并且成熟期離體培養(yǎng)玉米籽粒的干重能達(dá)到大田籽粒干重的80％；通過(guò)控制培養(yǎng)的外界條件(溫濕度、病害等)，改變培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素的含量或添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可研究環(huán)境和栽培措施對(duì)玉米籽粒發(fā)育的影響。

附圖說(shuō)明

圖1是根據(jù)本發(fā)明的玉米籽粒離體培養(yǎng)流程。

圖2是根據(jù)本發(fā)明的玉米籽粒固體培養(yǎng)法，其中，21-錐形瓶，22-玉米籽粒，23-穗軸，24-固體培養(yǎng)基。

圖3是根據(jù)本發(fā)明的玉米籽粒液體培養(yǎng)法，其中，31-培養(yǎng)皿，32-濾紙，33-支撐物。

圖4是根據(jù)本發(fā)明的不同處理籽粒的干、鮮重變化。

圖5是根據(jù)本發(fā)明的成熟期不同培養(yǎng)條件下玉米籽粒的形態(tài)，

其中，a-液體培養(yǎng)籽粒，b-固體培養(yǎng)籽粒，c-大田生長(zhǎng)籽粒。

圖6是根據(jù)本發(fā)明的離體培養(yǎng)與大田生長(zhǎng)籽粒干重的回歸分析。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

一、培養(yǎng)基配制(固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基)

培養(yǎng)基組分包括氨基酸、大量元素、微量元素、有機(jī)物、鐵鹽、碳源、凝固劑等。首先對(duì)以上組分配制成相應(yīng)的母液，具體見(jiàn)表1，然后根據(jù)需求取相應(yīng)的母液配制成培養(yǎng)基。以配制1l固體培養(yǎng)基為例，先在燒杯中倒入一些蒸餾水，分別量取氨基酸母液100ml、大量元素母液100ml、微量元素母液10ml、有機(jī)母液10ml、鐵鹽母液5ml倒入所述燒杯中，然后稱(chēng)取蔗糖150g倒入所述燒杯，攪拌溶解，加蒸餾水用容量瓶定容至1l，用hcl或naoh調(diào)整ph值至5.7-5.8，稱(chēng)取5.5g瓊脂粉倒入配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直至瓊脂粉完全融化。趁熱分裝于錐形瓶，其中每個(gè)錐形瓶含40ml培養(yǎng)基，瓶口用無(wú)菌培養(yǎng)容器封口膜(12cm*12cm)封口，放入高壓滅菌鍋，121℃滅菌20分鐘。液體培養(yǎng)基無(wú)瓊脂凝固劑，其他組分同固體培養(yǎng)基。

表1.固體培養(yǎng)基母液組分及相應(yīng)的濃度

二、培養(yǎng)流程

從玉米果穗滅菌處理到籽粒培養(yǎng)完成，整個(gè)流程可分為四個(gè)過(guò)程，即玉米果穗滅菌、玉米果穗分塊、玉米樣塊分粒和玉米籽粒培養(yǎng)，具體步驟入下：

①玉米果穗滅菌：

將玉米果穗剝?nèi)ネ饷鎺讓影~，剪去花絲，75％酒精滅菌；轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)，所述玉米穗無(wú)需再次滅菌。

②玉米果穗分塊：

根據(jù)試驗(yàn)需求，對(duì)玉米果穗進(jìn)行分塊處理。根據(jù)培養(yǎng)籽粒在穗部的位置(如強(qiáng)勢(shì)粒、弱勢(shì)粒)橫向切出三圈籽粒，所需培養(yǎng)的籽粒位于中間一圈。以穗軸中心為起點(diǎn)，切出扇形的并列3排籽粒，此時(shí)每個(gè)玉米樣塊有9顆籽粒。

③玉米樣塊分粒

切除所述獲得的9顆玉米籽粒中的8顆玉米籽粒，保留所述玉米樣塊中央的1顆籽粒，并將所述保留的1顆籽粒所連接的穗軸進(jìn)行部分切除，得到連接有部分穗軸的玉米籽粒。

④籽粒培養(yǎng)

將所述得到的玉米籽粒的穗軸部分向下插入固體培養(yǎng)基。如使用液體培養(yǎng)基，需以鋁條為支撐物(鋁條長(zhǎng)度根據(jù)培養(yǎng)皿大小調(diào)整)，所述鋁條上面覆蓋濾紙，然后將所述得到的玉米籽粒的穗軸部分放入由所述鋁條支撐的濾紙之上。每個(gè)籽粒需提供12ml的培養(yǎng)液。根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)置培養(yǎng)條件，如溫度25℃，相對(duì)濕度75％。以?xún)蓚€(gè)星期為一個(gè)周期，把培養(yǎng)的籽粒轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基。

三、玉米籽粒離體培養(yǎng)方法篩選與體系的建立

3.1不同培養(yǎng)條件下籽粒的干鮮重動(dòng)態(tài)變化

由圖4可以看出，不同處理的籽粒干、鮮重是在授粉后天數(shù)(dap)為10天后顯現(xiàn)出差異。大田籽粒的鮮重保持較高的增長(zhǎng)率，在40dap，其鮮重分別比液體、固體培養(yǎng)高62.5％、40.0％。液體、固體培養(yǎng)籽粒的鮮重變化在30dap趨于穩(wěn)定，籽粒含水量下降。各處理的籽粒干重隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，均呈上升趨勢(shì)，在40dap達(dá)到最大。就干重變化趨勢(shì)來(lái)看，固體培養(yǎng)籽粒更接近大田生長(zhǎng)籽粒。

3.2成熟期不同培養(yǎng)條件下玉米籽粒的形態(tài)

從圖5可以發(fā)現(xiàn)通過(guò)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的玉米籽粒發(fā)育飽滿(mǎn)充實(shí)，通過(guò)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的玉米籽粒發(fā)育飽滿(mǎn)充實(shí)度要低于通過(guò)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的玉米籽粒發(fā)育飽滿(mǎn)充實(shí)度。

3.3大田生長(zhǎng)于離體培養(yǎng)籽粒干重的回歸分析

液體、固體培養(yǎng)與大田生長(zhǎng)籽粒的干重回歸分析如圖6所示，兩種培養(yǎng)方法下的籽粒與大田生長(zhǎng)的干重積累呈線性回歸關(guān)系。液體、固體培養(yǎng)方法的回歸方程分別y＝-0.023+2.3785x、y＝-0.0066+1.3821x，回歸系數(shù)均為正值，均與大田生長(zhǎng)籽粒呈正相關(guān)關(guān)系。其相關(guān)系數(shù)分別為0.9491、0.9898，均為極顯著相關(guān)，但固體培養(yǎng)相關(guān)值高于液體培養(yǎng)。可見(jiàn)，離體培養(yǎng)籽粒能夠很好的反映大田自然生長(zhǎng)籽粒的干物質(zhì)積累，且固體培養(yǎng)條件下的籽粒表現(xiàn)更好。

3.4不同培養(yǎng)條件下籽粒的污染率和發(fā)育

通過(guò)比較各處理籽粒在40dap的發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)處理間的干、鮮重及體積均有顯著性差異(見(jiàn)表2)，且大小順序均為大田＞固體培養(yǎng)＞液體培養(yǎng)。液體、固體培養(yǎng)籽粒的干重分別比對(duì)照低56.5％、21.7％，鮮重分別比對(duì)照低62.5％、40％，在40dap對(duì)照籽粒的含水量比體外培養(yǎng)籽粒高。液體培養(yǎng)的污染率比固體培養(yǎng)高71.3％，但敗育率比其低4.4％。

表2在40dap不同培養(yǎng)條件下玉米籽粒的發(fā)育

同列無(wú)字母或數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(p＞0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p＜0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(p＜0.01)。

前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說(shuō)明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開(kāi)的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書(shū)及其等同形式所限定。