本發(fā)明屬于農(nóng)林育種方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種歐洲山楊品系組培育苗方法。
背景技術(shù)：
歐洲山楊原產(chǎn)中國新疆的阿爾泰、塔城、天山東部北坡至西部伊犁山區(qū)，其抗寒、喜光、喜涼爽氣候，在我國西北、東北的同緯度地區(qū)可廣泛栽培與推廣。歐洲山楊為楊屬白楊派樹種，在自然界中，它主要依靠種子和根蘗繁殖，種子繁殖子代性狀會發(fā)生分離，不能確保優(yōu)良單株性狀的表現(xiàn)，因此生產(chǎn)上使用比較廣泛是無性繁殖方法。無性繁殖方法包括扦插、嫁接、根蘗或組織培養(yǎng)等，歐洲山楊扦插生根困難，此種方法生產(chǎn)上難以利用，而利用嫁接或根蘗的繁殖方式，希望在1～2年內(nèi)達(dá)到幾萬甚至幾百萬株苗木的生產(chǎn)能力，則初始繁殖材料至少達(dá)到上千株至幾萬株。。
而且利用“三倍體歐洲無絮山楊快速繁殖體系”中的方法進(jìn)行滅菌與組織培養(yǎng)，在利用參考文獻(xiàn)“三倍體歐洲無絮山楊快速繁殖體系”中的培養(yǎng)方法進(jìn)行繁殖的過程中，主要問題如下：滅菌方法不可行，在75％酒精中約30～60秒，在0.1％的升汞中滅菌5～10分，無菌水沖洗3～5遍，褐化率達(dá)到85％～100％，褐化會導(dǎo)致培育苗難以成活，而褐化率越高表明培育苗的成活率就越低；利用不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA0.5mg/L+0.05NAAmg/L進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)，不定芽誘導(dǎo)率僅為14.2％～25.8％；對于增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0.5mg/L+0.05NAAmg/L，植株增殖率為2～3倍，且生長植株平均為1.0～1.5cm，最終導(dǎo)致培育苗的成活率低。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種歐洲山楊品系組培育苗方法，能夠提高育苗的成活率。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
一種歐洲山楊品系組培育苗方法，包括以下步驟：
1)將帶有腋芽的莖段依次經(jīng)過酒精溶液浸泡、無菌水沖洗、消毒劑消毒和無菌水再次沖洗后，去掉莖段的兩端1～2mm，得到外植體；
2)將所述步驟1)得到的外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養(yǎng)基中，分化培養(yǎng)30～45d，得到歐洲山楊不定芽；
3)將所述步驟2)得到的歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽；
4)將所述步驟3)得到的1.2～2.0cm的歐洲山楊不定芽轉(zhuǎn)接到已滅菌的不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到歐洲山楊再生組培苗。
優(yōu)選的，所述步驟1)中莖段的長度為0.5～2cm。
優(yōu)選的，所述步驟1)中酒精溶液中乙醇的體積濃度為70～75％，所述酒精溶液浸泡的時間為10～20s；
所述消毒劑為氯化汞溶液，所述氯化汞溶液中氯化汞的質(zhì)量濃度為0.05～0.15％，所述消毒劑消毒的時間為1.5～4.5min。
優(yōu)選的，所述步驟2)中的不定芽分化培養(yǎng)基包括以下濃度的組分：
NH4NO3150～250mg/L、KNO3150～200mg/L、CaCl240～55mg/L、MgSO4170～200mg/L、Ca(NO3)2260～290mg/L、K2SO4140～160mg/L、KH2PO4170～200mg/L、KI 0.41～0.42mg/L、H3BO32.5～3.5mg/L、MnSO411～12mg/L、ZnSO44.0～4.5mg/L、Na2MoO40.12～0.13mg/L、CuSO40.012～0.013mg/L、FeSO413.0～14.5mg/L、Na2-EDTA 18～19mg/L、肌醇40～60mg/L、鹽酸吡哆醇0.2～0.3mg/L、煙酸0.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素2～3mg/L、甘氨酸0.5～1.5mg/L、6-芐基腺嘌呤0.3～1.0mg/L，余量為水。
優(yōu)選的，所述分化培養(yǎng)的條件包括：
所述培養(yǎng)的溫度為20～30℃；
所述培養(yǎng)的光照時間為10～15h/d；
所述培養(yǎng)的光照強度為3500～5000Lx；
所述培養(yǎng)的光源為三基色色溫6500k熒光燈；
所述培養(yǎng)的環(huán)境濕度為70～80％。
優(yōu)選的，所述步驟3)中的繼代增殖培養(yǎng)基包括以下濃度的組分：
KNO3300～400mg/L、NH4NO3350～450mg/L、CaCl290～100mg/L、MgSO4330～400mg/L、Ca(NO3)2500～600mg/L、K2SO4550～650mg/L、KH2PO4350～400mg/L、FeSO425～30mg/L、Na2-EDTA35～40mg/L、KI 0.05～1.0mg/L、H3BO36.0～6.5mg/L、MnSO420～25mg/L、ZnSO48.0～9.0mg/L、Na2MoO40.2～0.3mg/L、CuSO40.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素3～8mg/L、煙酸0.3～0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、6-芐基腺嘌呤0.5～1.5mg/L、萘乙酸0.03～0.08mg/L，余量為水。
優(yōu)選的，所述繼代培養(yǎng)的條件包括：
所述培養(yǎng)的溫度為20～30℃；
所述培養(yǎng)的光照時間為10～15h/d；
所述培養(yǎng)的光照強度為3500～5000Lx；
所述培養(yǎng)的光源為三基色色溫6500k熒光燈；
所述培養(yǎng)的環(huán)境濕度為70～80％。
優(yōu)選的，所述步驟4)中的不定芽生根培養(yǎng)基包括以下濃度的組分：
KNO3300～400mg/L、NH4NO3350～450mg/L、CaCl290～100mg/L、MgSO4330～400mg/L、Ca(NO3)2500～600mg/L、K2SO4550～650mg/L、KH2PO4350～400mg/L、FeSO425～30mg/L、Na2-EDTA35～40mg/L、KI 0.05～1.0mg/L、H3BO36.26.0～6.5mg/L、MnSO420～25mg/L、ZnSO48.0～9.0mg/L、Na2MoO40.2～0.3mg/L、CuSO40.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素3～8mg/L、煙酸0.3～0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、乙哚丁酸1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.005～0.015mg/L，余量為水。
優(yōu)選的，所述生根培養(yǎng)的條件包括：
所述培養(yǎng)的溫度為20～30℃；
所述培養(yǎng)的光照時間為10～15h/d；
所述培養(yǎng)的光照強度為2500～3500Lx；
所述培養(yǎng)的光源為三基色色溫6500k熒光燈；
所述培養(yǎng)的環(huán)境濕度為70～80％。
本發(fā)明還包括將上述技術(shù)方案得到的歐洲山楊再生組培苗進(jìn)行兩步生根，所述兩步生根包括以下步驟：
1)將歐洲山楊再生組培苗的根部用高錳酸鉀溶液浸泡后，栽入基質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)，得到再次生根的歐洲山楊組培苗；所述培養(yǎng)過程中第1～3天環(huán)境濕度為80～95％，第4～7天環(huán)境濕度為70～85％，第8～10天環(huán)境濕度為45～55％，第11天以后為自然環(huán)境濕度；
2)將所述步驟1)得到的再次生根的歐洲山楊組培苗移栽到自然光下培養(yǎng)；所述自然光下培養(yǎng)的晝溫為21～29℃，所述培養(yǎng)的夜溫為18～21℃，所述培養(yǎng)的環(huán)境濕度為80～95％。
本發(fā)明提供了一種歐洲山楊品系組培育苗方法，包括以下步驟：1)將帶有腋芽的莖段依次經(jīng)過酒精溶液浸泡、無菌水沖洗、消毒劑消毒和無菌水再次沖洗后，去掉莖段的兩端1～2mm，得到外植體；2)將所述步驟1)得到的外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養(yǎng)基中，分化培養(yǎng)30～45d，得到歐洲山楊不定芽；3)將所述步驟2)得到的歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽；4)將所述步驟3)得到的1.2～2.0cm的歐洲山楊不定芽轉(zhuǎn)接到已滅菌的不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到歐洲山楊再生組培苗。采用此種方法進(jìn)行移栽，將煉苗與移栽同步進(jìn)行，減少了以往在培養(yǎng)瓶中煉苗，培養(yǎng)基被空氣中的雜菌污染，導(dǎo)致苗木污染，成活率降低。另外，利用速蘸高錳酸鉀的方式替代在多菌靈溶液中浸泡的方式進(jìn)行苗木滅菌，減少了苗木與藥品接觸的面積，降低了成活率。采用本發(fā)明的組培育苗方法，得到組培苗的成活率為91.4～91.6％。本發(fā)明的組培育苗方法可使以一個莖段為基數(shù)，經(jīng)培養(yǎng)一年內(nèi)可增殖到10000～100000株組培苗。
具體實施方式
本發(fā)明提供了一種歐洲山楊品系組培育苗方法，包括以下步驟：
1)將帶有腋芽的莖段依次經(jīng)過酒精溶液浸泡、無菌水沖洗、消毒劑消毒和無菌水再次沖洗后，去掉莖段的兩端1～2mm，得到外植體；
2)將所述步驟1)得到的外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養(yǎng)基中，分化培養(yǎng)30～45d，得到歐洲山楊不定芽；
3)將所述步驟2)得到的歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽；
4)將所述步驟3)得到的1.2～2.0cm的歐洲山楊不定芽轉(zhuǎn)接到已滅菌的不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到歐洲山楊再生組培苗。
本發(fā)明以帶有腋芽的莖段作為原材料培養(yǎng)得到歐洲山楊再生組培苗。在本發(fā)明中，所述莖段的來源優(yōu)選為歐洲山楊根部萌發(fā)的或者生長在植株底部的嫩枝，將所述嫩枝在流水下沖洗1～2h后，除去所述嫩枝葉片，將帶有腋芽的嫩枝剪切成0.5～2cm長的莖段，所述莖段的長度更優(yōu)選為1.0～1.5cm。
得到莖段后，本發(fā)明采用酒精溶液對所述莖段進(jìn)行浸泡。在本發(fā)明中，所述酒精溶液的體積濃度優(yōu)選為70～75％，更優(yōu)選為72～74％；所述酒精溶液浸泡的時間優(yōu)選為10～20s，更優(yōu)選浸泡12～18s。
所述酒精溶液浸泡后，本發(fā)明采用無菌水對酒精溶液浸泡后的莖段進(jìn)行沖洗。在本發(fā)明中，所述無菌水沖洗的次數(shù)優(yōu)選為2～6次，更優(yōu)選為沖洗3～5次。
所述無菌水沖洗后，本發(fā)明將沖洗后的莖段用消毒劑消毒。在本發(fā)明中，所述消毒劑優(yōu)選為氯化汞溶液；所述氯化汞溶液中氯化汞的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.05～0.15％，更優(yōu)選為0.08～0.12％，最優(yōu)選為0.10％。在本發(fā)明中，所述消毒劑消毒的時間優(yōu)選為1.5～4.5min，更優(yōu)選為1.8～4.2min，最優(yōu)選為2.0～4.0min。
所述消毒后，本發(fā)明將所述消毒后的莖段再次用無菌水進(jìn)行沖洗，所述無菌水沖洗的次數(shù)優(yōu)選為2～6次，更優(yōu)選為3～5次。
所述無菌水再次沖洗后，本發(fā)明優(yōu)選采用無菌濾紙將所述再次沖洗后的莖段上的無菌水吸干。
上述技術(shù)方案所述前處理過程后，本發(fā)明將得到的莖段去掉兩端1～2mm，得到外植體。在本發(fā)明的實施例中，具體采用已消毒的解剖刀對莖段的兩端切除。
得到外植體后，本發(fā)明將所述外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，得到歐洲山楊不定芽。在本發(fā)明中，所述分化培養(yǎng)的條件優(yōu)選包括：所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為20～30℃，更優(yōu)選為23～26℃；所述培養(yǎng)的光照時間優(yōu)選為10～15h/d，更優(yōu)選為12～14h/d；所述培養(yǎng)的光照強度優(yōu)選為3500～5000Lx，更優(yōu)選為3800～4800Lx；所述培養(yǎng)的光源為三基色色溫6500k熒光燈；所述培養(yǎng)的環(huán)境濕度優(yōu)選為70～80％，更優(yōu)選為72～78％；所述培養(yǎng)的天數(shù)為30～45d，優(yōu)選為35～40d。
在本發(fā)明中，所述不定芽分化培養(yǎng)基優(yōu)選包括以下組分：NH4NO3150～250mg/L、KNO3150～200mg/L、CaCl240～55mg/L、MgSO4170～200mg/L、Ca(NO3)2260～290mg/L、K2SO4140～160mg/L、KH2PO4170～200mg/L、KI0.41～0.42mg/L、H3BO32.5～3.5mg/L、MnSO411～12mg/L、ZnSO44.0～4.5mg/L、Na2MoO40.12～0.13mg/L、CuSO40.012～0.013mg/L、FeSO413.0～14.5mg/L、Na2-EDTA 18～19mg/L、肌醇40～60mg/L、鹽酸吡哆醇0.2～0.3mg/L、煙酸0.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素2～3mg/L、甘氨酸0.5～1.5mg/L、6-芐基腺嘌呤0.3～1.0mg/L，余量為水；更優(yōu)選包括NH4NO3180～220mg/L、KNO3160～180mg/L、CaCl2 45～50mg/L、MgSO4 180～190mg/L、Ca(NO3)2270～280mg/L、K2SO4145～155mg/L、KH2PO4180～190mg/L、KI0.412～0.418mg/L、H3BO32.8～3.3mg/L、MnSO411.10～11.18mg/L、ZnSO44.1～4.4mg/L、Na2MoO40.121～0.128mg/L、CuSO40.0121～0.0128mg/L、FeSO413.3～14.2mg/L、Na2-EDTA 18.2～18.8mg/L、肌醇45～55mg/L、鹽酸吡哆醇0.22～0.28mg/L、煙酸0.22～0.28mg/L、鹽酸硫胺素2.2～2.8mg/L、甘氨酸0.8～1.2mg/L、6-芐基腺嘌呤0.4～0.8mg/L，余量為水；最優(yōu)選包括NH4NO3200mg/L、KNO3170mg/L、CaCl248mg/L、MgSO4185mg/L、Ca(NO3)2275mg/L、K2SO4300mg/L、KH2PO4185mg/L、KI 0.415mg/L、H3BO33.1mg/L、MnSO411.15mg/L、ZnSO44.3mg/L、Na2MoO40.125mg/L、CuSO40.0125mg/L、FeSO413.9mg/L、Na2-EDTA 18.6mg/L、肌醇50mg/L、鹽酸吡哆醇0.25mg/L、煙酸0.25mg/L、鹽酸硫胺素2.5mg/L、甘氨酸1.0mg/L、6-芐基腺嘌呤0.5mg/L，余量為水。
本發(fā)明對所述不定芽分化培養(yǎng)基的滅菌條件沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的方法即可，如115～121℃滅菌15～30min。
得到歐洲山楊不定芽后，本發(fā)明將所述所述歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽。在本發(fā)明中，所述繼代培養(yǎng)的條件包括：所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為20～30℃，更優(yōu)選為23～26℃；所述培養(yǎng)的光照時間優(yōu)選為10～15h/d，更優(yōu)選為12～14h/d；所述培養(yǎng)的光照強度優(yōu)選為3500～5000Lx，更優(yōu)選為3800～4800Lx；所述培養(yǎng)的光源為三基色色溫6500k熒光燈；所述培養(yǎng)的環(huán)境濕度優(yōu)選為70～80％，更優(yōu)選為72～78％；所述培養(yǎng)的天數(shù)為20～30d，優(yōu)選為23～28d。
在本發(fā)明中，所述繼代增殖培養(yǎng)基優(yōu)選包括以下濃度的組分：KNO3300～400mg/L、NH4NO3350～450mg/L、CaCl290～100mg/L、MgSO4330～400mg/L、Ca(NO3)2500～600mg/L、K2SO4550～650mg/L、KH2PO4350～400mg/L、FeSO425～30mg/L、Na2-EDTA35～40mg/L、KI 0.5～1.0mg/L、H3BO36.0～6.5mg/L、MnSO420～25mg/L、ZnSO48.0～9.0mg/L、Na2MoO40.2～0.3mg/L、CuSO40.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素3～8mg/L、煙酸0.3～0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、6-芐基腺嘌呤0.5～1.5mg/L、萘乙酸0.03～0.08mg/L，余量為水；更優(yōu)選包括KNO3320～360mg/L、NH4NO3380～420mg/L、CaCl293～97mg/L、MgSO4350～380mg/L、Ca(NO3)2520～580mg/L、K2SO4580～620mg/L、KH2PO4360～380mg/L、FeSO426～29mg/L、Na2-EDTA36～38mg/L、KI 0.5～0.9mg/L、H3BO36.1～6.3mg/L、MnSO421～24mg/L、ZnSO48.4～8.8mg/L、Na2MoO40.22～0.28mg/L、CuSO40.22～0.28mg/L、鹽酸硫胺素5～7mg/L、煙酸0.4～0.7mg/L、鹽酸吡哆醇0.4～0.7mg/L、肌醇95～105mg/L、甘氨酸1.5～2.5mg/L、6-芐基腺嘌呤0.8～1.2mg/L、萘乙酸0.04～0.07mg/L，余量為水；最優(yōu)選包括KNO3340mg/L、NH4NO3400mg/L、CaCl296mg/L、MgSO4370mg/L、Ca(NO3)2550mg/L、K2SO4600mg/L、KH2PO4370mg/L、FeSO427.8mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO422.3mg/L、ZnSO48.6mg/L、Na2MoO40.25mg/L、CuSO40.25mg/L、鹽酸硫胺素5mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、6-芐基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.05mg/L，余量為水。
本發(fā)明對所述繼代增殖培養(yǎng)基的滅菌條件沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的方法即可，如115～121℃滅菌15～30min。
得到1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽后，本發(fā)明將所述1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽轉(zhuǎn)接到已滅菌的不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到歐洲山楊再生組培苗。在本發(fā)明中，所述生根培養(yǎng)的條件包括：所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為20～30℃，更優(yōu)選為23～26℃；所述培養(yǎng)的光照時間優(yōu)選為10～15h/d，更優(yōu)選為12～14h/d；所述培養(yǎng)的光照強度優(yōu)選為2000～4000Lx，更優(yōu)選為2500～3500Lx；所述培養(yǎng)的光源為三基色色溫6500k熒光燈；所述培養(yǎng)的環(huán)境濕度優(yōu)選為70～80％，更優(yōu)選為72～78％，所述培養(yǎng)的天數(shù)為20～30d，優(yōu)選為23～28d。
在本發(fā)明中，所述組培苗的高度優(yōu)選為3～6cm，更優(yōu)選為4～5cm；所述組培苗優(yōu)選具有2～6片葉片，更優(yōu)選為3～5片。
在本發(fā)明中，所述不定芽生根培養(yǎng)基優(yōu)選包括以下濃度的組分：KNO3300～400mg/L、NH4NO3350～450mg/L、CaCl290～100mg/L、MgSO4330～400mg/L、Ca(NO3)2500～600mg/L、K2SO4550～650mg/L、KH2PO4350～400mg/L、FeSO425～30mg/L、Na2-EDTA35～40mg/L、KI 0.05～1.0mg/L、H3BO36.0～6.5mg/L、MnSO420～25mg/L、ZnSO48.0～9.0mg/L、Na2MoO40.2～0.3mg/L、CuSO40.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素3～8mg/L、煙酸0.3～0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、乙哚丁酸1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.005～0.015mg/L，余量為水；更優(yōu)選包括KNO3320～360mg/L、NH4NO3380～420mg/L、CaCl294～98mg/L、MgSO4350～390mg/L、Ca(NO3)2520～570mg/L、K2SO4580～620mg/L、KH2PO4360～380mg/L、FeSO426～19mg/L、Na2-EDTA 36～38mg/L、KI 0.7～0.9mg/L、H3BO36.1～6.4mg/L、MnSO421～24mg/L、ZnSO48.4～8.8mg/L、Na2MoO40.22～0.0.28mg/L、CuSO40.22～0.28mg/L、鹽酸硫胺素6～7mg/L、煙酸0.4～0.6mg/L、鹽酸吡哆醇0.4～0.6mg/L、肌醇95～105mg/L、甘氨酸1.5～2.5mg/L、乙哚丁酸1.2～1.8mg/L、萘乙酸0.008～0.012mg/L，余量為水；最優(yōu)選包括KNO3340mg/L、NH4NO3400mg/L、CaCl2370mg/L、MgSO4370mg/L、Ca(NO3)2550mg/L、K2SO4600mg/L、KH2PO4370mg/L、FeSO427.8mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO422.3mg/L、ZnSO48.6mg/L、Na2MoO40.25mg/L、CuSO40.25mg/L、鹽酸硫胺素5mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、乙哚丁酸1.5mg/L、萘乙酸0.01mg/L，余量為水。
本發(fā)明對所述不定芽生根培養(yǎng)基的滅菌條件沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的方法即可，如115～121℃滅菌15～30min。
得到歐洲山楊再生組培苗后，優(yōu)選將所述組培苗的根部沾入高錳酸鉀溶液中，滅菌后直接栽入已滅菌的裝有蛭石的育苗盤內(nèi)。在本發(fā)明中，高錳酸鉀溶液中高錳酸鉀的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.3～0.8％，更優(yōu)選為0.5％。在本發(fā)明中，所述育苗盤內(nèi)，組培苗的株行距為3cm×4cm。
在本發(fā)明中，所述組培苗移栽到育苗盤內(nèi)的當(dāng)日澆透水，優(yōu)選在以后3d內(nèi)用塑料膜將育苗盤連同所述組培苗一同蓋嚴(yán)，第4～10d逐漸揭去塑料膜。第1～3天空氣濕度優(yōu)選保持在80～95％，更優(yōu)選為85～90％；第4～7天空氣濕度優(yōu)選保持在70～85％，更優(yōu)選為75～80％；第8～10d空氣濕度優(yōu)選保持在45～55％更優(yōu)選為50％。優(yōu)選在第2、7d分別以1/4MS培養(yǎng)基大量元素溶液進(jìn)行葉面施肥，施肥量優(yōu)選為25～35ml/m2，更優(yōu)選為30ml/m2；移栽第7～15d后組培苗木長出新根。
在本發(fā)明中，將所述已經(jīng)長出新根的組培苗連同粘在上面的蛭石優(yōu)選一起植入輕基質(zhì)網(wǎng)袋育苗容器內(nèi)，在溫室中緩苗2～3d后移入自然光下，整個過程環(huán)境條件為：晝溫21℃～29℃、夜溫18℃～21℃、濕度80％～95％。
在本發(fā)明中，移栽到輕基質(zhì)網(wǎng)袋育苗容器內(nèi)的組培苗的水肥管理優(yōu)選為容器內(nèi)的基質(zhì)濕度優(yōu)選保持在45～85％，更優(yōu)選為60％～70％。組培苗恢復(fù)生長后25～35d，用復(fù)合肥和尿素每隔10d噴施1次。所述復(fù)合肥與尿素的質(zhì)量比優(yōu)選為(0.5～1.5):(0.5～1.5)，更優(yōu)選為1:1。所述噴施的濃度優(yōu)選為0.3～0.8％，更優(yōu)選為0.5％。所述噴施的噴施量優(yōu)選為0.1～0.5％，更優(yōu)選為0.3％。第二個月，所述噴施的濃度優(yōu)選為0.5～0.6％，更優(yōu)選為0.55％。第三個月，所述噴施的濃度優(yōu)選為0.7～1.1％，更優(yōu)選為0.8～1.0％。在本發(fā)明中，噴施復(fù)合肥和尿素后，優(yōu)選采用清水沖洗液面，以免造成肥害。
在本發(fā)明中，移栽到輕基質(zhì)網(wǎng)袋育苗容器內(nèi)的組培苗的病害防治優(yōu)選為每月用質(zhì)量濃度為0.5％波爾多液與多菌靈500倍藥液交替噴灑1次，以防止立枯病的發(fā)生。所述0.5％波爾多液中的活性物質(zhì)為硫酸銅和生石灰，質(zhì)量比為1:1。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種歐洲山楊品系組培育苗方法進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
實施例1
將歐洲山楊根部萌發(fā)的嫩枝剪下，在流水下沖洗1h后，去除嫩枝葉片，將帶腋芽的嫩枝剪成1.0cm的莖段，用質(zhì)量濃度為70％乙醇溶液對莖段表面進(jìn)行消毒10ss，然后用無菌水沖洗3遍，再用質(zhì)量濃度為0.1％氯化汞消毒2.0min后，再次用無菌水沖洗3遍，最后用無菌濾紙吸干無菌水，用已消毒的解剖刀切除帶腋芽莖段的兩端1mm，得到外植體；
將外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，得到歐洲山楊不定芽，培養(yǎng)的條件包括溫度23℃、光照時間12h/d，光強3500Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度70％的條件下培養(yǎng)30d，得到歐洲山楊的不定芽；不定芽分化培養(yǎng)基的組分為：NH4NO3200mg/L、KNO3170mg/L、CaCl248mg/L、MgSO4 185mg/L、Ca(NO3)2275mg/L、K2SO4300mg/L、KH2PO4185mg/L、KI 0.415mg/L、H3BO33.1mg/L、MnSO411.15mg/L、ZnSO44.3mg/L、Na2MoO40.125mg/L、CuSO40.0125mg/L、FeSO413.9mg/L、Na2-EDTA 18.65mg/L、肌醇50mg/L、鹽酸吡哆醇0.25mg/L、煙酸0.25mg/L、鹽酸硫胺素2.5mg/L、甘氨酸1.0mg/L、6-芐基腺嘌呤0.5mg/L，余量為水。
將歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到1.5cm高的歐洲山楊不定芽。繼代培養(yǎng)的條件包括：溫度23℃、光照時間12h/d、光強3500Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度70％；繼代增殖培養(yǎng)基的組分為：KNO3340mg/L、NH4NO3400mg/L、CaCl296mg/L、MgSO4370mg/L、Ca(NO3)2550mg/L、K2SO4600mg/L、KH2PO4370mg/L、FeSO427.8mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO422.3mg/L、ZnSO48.6mg/L、Na2MoO40.25mg/L、CuSO40.25mg/L、鹽酸硫胺素5mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、6-芐基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.05mg/L，余量為水。
將1.5cm苗高的歐洲山楊不定芽轉(zhuǎn)接到已滅菌的不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到歐洲山楊再生組培苗。生根培養(yǎng)的條件包括：溫度23℃、光照時間12h/d、光強2500Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈、濕度70％～80％，得到苗高為4cm且具有3片葉片的歐洲山楊再生組培苗。不定芽生根培養(yǎng)基的組分為：KNO3340mg/L、NH4NO3400mg/L、CaCl296mg/L、MgSO4370mg/L、Ca(NO3)2550mg/L、K2SO4600mg/L、KH2PO4370mg/L、FeSO427.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO422.3mg/L、ZnSO48.6mg/L、Na2MoO40.25mg/L、CuSO40.25mg/L、鹽酸硫胺素5mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、乙哚丁酸1.5mg/L、萘乙酸0.01mg/L，余量為水。
將歐洲山楊組培苗從不定芽生根培養(yǎng)基中拔出，洗掉根上附著的培養(yǎng)基，將根沾入質(zhì)量濃度為0.5％的高錳酸鉀溶液中滅菌后直接栽入已滅菌的裝有蛭石的育苗盤內(nèi)，株行距為3cm×4cm，當(dāng)日澆透水，以后3d內(nèi)用塑料膜將育苗盤連同移栽小苗一同蓋嚴(yán)，以保持相對濕度，第4～10d逐漸揭去塑料膜，第1～3d空氣濕度保持在85％，第4～7d空氣濕度保持在75％，第8～10d空氣濕度保持在50％。期間第2、7d分別以1/4MS培養(yǎng)基大量元素溶液進(jìn)行葉面施肥，施肥量30ml/m2，移栽第7～15d后苗木長出新根。將已經(jīng)長出新根的小苗連同粘在上面的蛭石一起植入輕基質(zhì)網(wǎng)袋育苗容器內(nèi)在溫室中緩苗2～3d，移入自然光下，正常生長和管理。
容器苗苗期水肥管理與病蟲害防治：輕基質(zhì)網(wǎng)袋育苗法苗期生長要特別注意水肥的管理，基質(zhì)濕度保持在25％。芽苗恢復(fù)生長后約30d，用復(fù)合肥和尿素對半拌勻，每隔10d追施1次，施肥濃度按0.5％，施肥量0.3g/株，隨著苗木增大，移栽后第二個月施肥濃度調(diào)整為0.55％，第三個月后調(diào)整為0.8％，同時施肥后用清水沖洗葉面，以免肥害。芽苗移栽成活后，每月用0.5％波爾多液與多菌靈500倍藥液交替噴灑1次，以防止立枯病的發(fā)生。
莖段經(jīng)過酒精溶液浸泡和氯化汞溶液消毒后，對莖段的殺傷率為7.5％，對莖段的污染率為12.5％；莖段在不定芽分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)后，分化率為87％，分化系數(shù)為4.23；歐洲山楊不定芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)為4.5；歐洲山楊不定芽轉(zhuǎn)接到不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根率為89.6％，每組培苗生根條數(shù)為10條，成活率為91.4％；本發(fā)明的莖段經(jīng)過分化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)三個階段，使莖段的繁殖周期縮短1～2個月；將歐洲山楊組培苗移栽到育苗盤內(nèi)，待長出新根后再移栽到育苗容器內(nèi)培養(yǎng)，可使組培苗的移栽成活率在95％以上；移栽的歐洲山楊組培苗的莖、根干質(zhì)量比例為1.5:1，組培苗的苗干90％以上達(dá)到木質(zhì)化。
實施例2
將歐洲山楊根部萌發(fā)的嫩枝剪下，在流水下沖洗2h后，去除嫩枝葉片，將帶腋芽的嫩枝剪成1.5cm的莖段，用質(zhì)量濃度為75％乙醇溶液對莖段表面進(jìn)行消毒15s，然后用無菌水沖洗3遍，再用質(zhì)量濃度為0.12％氯化汞消毒4.0min后，再次用無菌水沖洗3遍，最后用無菌濾紙吸干無菌水，用已消毒的解剖刀切除帶腋芽莖段的兩端2mm，得到外植體；
將外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，得到歐洲山楊不定芽，培養(yǎng)的條件包括溫度26℃、光照時間14h/d，光強5000Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度80％的條件下培養(yǎng)45d，得到歐洲山楊的不定芽；不定芽分化培養(yǎng)基的組分為：NH4NO3150mg/L、KNO3150mg/L、CaCl240mg/L、MgSO4200mg/L、Ca(NO3)2260mg/L、K2SO4140mg/L、KH2PO4200mg/L、KI 0.41mg/L、H3BO33.5mg/L、MnSO412mg/L、ZnSO44.5mg/L、Na2MoO40.12mg/L、CuSO40.012mg/L、FeSO413.0mg/L、Na2-EDTA18mg/L、肌醇40mg/L、鹽酸吡哆醇0.3mg/L、煙酸0.3mg/L、鹽酸硫胺素2.0mg/L、甘氨酸1.5mg/L、6-芐基腺嘌呤0.3mg/L，余量為水。
將歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到2.0cm高的歐洲山楊不定芽。繼代培養(yǎng)的條件包括：溫度26℃、光照時間14h/d、光強5000Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度80％；繼代增殖培養(yǎng)基的組分為：KNO3300mg/L、NH4NO3350mg/L、CaCl290mg/L、MgSO4330mg/L、Ca(NO3)2500mg/L、K2SO4550mg/L、KH2PO4350mg/L、FeSO425mg/L、Na2-EDTA40mg/L、KI 0.5mg/L、H3BO36.5mg/L、MnSO425mg/L、ZnSO49.0mg/L、Na2MoO40.3mg/L、CuSO40.3mg/L、鹽酸硫胺素8mg/L、煙酸0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3mg/L、肌醇110mg/L、甘氨酸3mg/L、6-芐基腺嘌呤1.5mg/L、萘乙酸0.08mg/L，余量為水。
將2.0cm苗高的歐洲山楊不定芽轉(zhuǎn)接到已滅菌的不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到歐洲山楊再生組培苗。生根培養(yǎng)的條件包括：溫度26℃、光照時間14h/d、光強2500Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈、濕度80％，得到苗高為4cm且具有5片葉片的歐洲山楊再生組培苗。不定芽生根培養(yǎng)基的組分為：KNO3300mg/L、NH4NO3350mg/L、CaCl296mg/L、MgSO4330mg/L、Ca(NO3)2500mg/L、K2SO4550mg/L、KH2PO4350mg/L、FeSO425mg/L、Na2-EDTA40mg/L、KI 0.5mg/L、H3BO36.5mg/L、MnSO425mg/L、ZnSO49.0mg/L、Na2MoO40.3mg/L、CuSO40.3mg/L、鹽酸硫胺素8mg/L、煙酸0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3mg/L、肌醇90mg/L、甘氨酸1mg/L、乙哚丁酸1.0mg/L、萘乙酸0.015mg/L，余量為水。
將歐洲山楊組培苗從不定芽生根培養(yǎng)基中拔出，洗掉根上附著的培養(yǎng)基，將根沾入質(zhì)量濃度為0.5％的高錳酸鉀溶液中滅菌后直接栽入已滅菌的裝有蛭石的育苗盤內(nèi)，株行距為3cm×4cm，當(dāng)日澆透水，以后3d內(nèi)用塑料膜將育苗盤連同移栽小苗一同蓋嚴(yán)，以保持相對濕度，第4～10d逐漸揭去塑料膜，第1～3d空氣濕度保持在85％，第4～7d空氣濕度保持在75％，第8～10d空氣濕度保持在50％。期間第2、7d分別以1/4MS培養(yǎng)基大量元素溶液進(jìn)行葉面施肥，施肥量30ml/m2，移栽第7～15d后苗木長出新根。將已經(jīng)長出新根的小苗連同粘在上面的蛭石一起植入輕基質(zhì)網(wǎng)袋育苗容器內(nèi)在溫室中緩苗2～3d，移入自然光下，正常生長和管理。
容器苗苗期水肥管理與病蟲害防治：輕基質(zhì)網(wǎng)袋育苗法苗期生長要特別注意水肥的管理，基質(zhì)濕度保持在25％。芽苗恢復(fù)生長后約30d，用復(fù)合肥和尿素對半拌勻，每隔10d追施1次，施肥濃度按0.5％，施肥量0.3g/株，隨著苗木增大，移栽后第二個月施肥濃度調(diào)整為0.55％，第三個月后調(diào)整為0.8％，同時施肥后用清水沖洗葉面，以免肥害。芽苗移栽成活后，每月用0.5％波爾多液與多菌靈500倍藥液交替噴灑1次，以防止立枯病的發(fā)生。
莖段經(jīng)過酒精溶液浸泡和氯化汞溶液消毒后，對莖段的殺傷率為7.4％，對莖段的污染率為12.0％；莖段在不定芽分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)后，分化率為88％，分化系數(shù)為4.23；歐洲山楊不定芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)為4.6；歐洲山楊不定芽轉(zhuǎn)接到不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根率為90％，每組培苗生根條數(shù)為14條，成活率為91.6％；本發(fā)明的莖段經(jīng)過分化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)三個階段，使莖段的繁殖周期縮短1～2個月；將歐洲山楊組培苗移栽到育苗盤內(nèi)，待長出新根后再移栽到育苗容器內(nèi)培養(yǎng)，可使組培苗的移栽成活率在95％以上，移栽的歐洲山楊組培苗的莖、根干質(zhì)量比例為1.5:1，組培苗的苗干90％以上達(dá)到木質(zhì)化。
實施例3
將歐洲山楊根部萌發(fā)的嫩枝剪下，在流水下沖洗1.5h后，去除嫩枝葉片，將帶腋芽的嫩枝剪成1.5cm的莖段，用質(zhì)量濃度為75％乙醇溶液對莖段表面進(jìn)行消毒20s，然后用無菌水沖洗3遍，再用質(zhì)量濃度為0.08％氯化汞消毒3.5min后，再次用無菌水沖洗3遍，最后用無菌濾紙吸干無菌水，用已消毒的解剖刀切除帶腋芽莖段的兩端1.5mm，得到外植體；
將外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，得到歐洲山楊不定芽，培養(yǎng)的條件包括溫度24℃、光照時間13h/d，光強4000Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度75％的條件下培養(yǎng)35d，得到歐洲山楊的不定芽；不定芽分化培養(yǎng)基的組分為：NH4NO3250mg/L、KNO3200mg/L、CaCl255mg/L、MgSO4 170mg/L、Ca(NO3)2290mg/L、K2SO4160mg/L、KH2PO4170mg/L、KI 0.42mg/L、H3BO32.5mg/L、MnSO411mg/L、ZnSO44.0mg/L、Na2MoO40.13mg/L、CuSO40.013mg/L、FeSO414.5mg/L、Na2-EDTA19mg/L、肌醇60mg/L、鹽酸吡哆醇0.2mg/L、煙酸0.2mg/L、鹽酸硫胺素3.0mg/L、甘氨酸0.5mg/L、6-芐基腺嘌呤1.0mg/L，余量為水。
將歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到2.0cm高的歐洲山楊不定芽。繼代培養(yǎng)的條件包括：溫度25℃、光照時間13h/d、光強4000Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度75％；繼代增殖培養(yǎng)基的組分為：KNO3400mg/L、NH4NO3450mg/L、CaCl2100mg/L、MgSO4400mg/L、Ca(NO3)2600mg/L、K2SO4650mg/L、KH2PO4400mg/L、FeSO430mg/L、Na2-EDTA35mg/L、KI 1.0mg/L、H3BO36.0mg/L、MnSO430mg/L、ZnSO48.0mg/L、Na2MoO40.2mg/L、CuSO40.2mg/L、鹽酸硫胺素3mg/L、煙酸0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.8mg/L、肌醇90mg/L、甘氨酸1mg/L、6-芐基腺嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.03mg/L，余量為水。
將2.0cm苗高的歐洲山楊不定芽轉(zhuǎn)接到已滅菌的不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到歐洲山楊再生組培苗。生根培養(yǎng)的條件包括：溫度24℃、光照時間13h/d、光強3000Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈、濕度75％，得到苗高為4cm且具有4片葉片的歐洲山楊再生組培苗。不定芽生根培養(yǎng)基的組分為：KNO3400mg/L、NH4NO3350mg/L、CaCl296mg/L、MgSO4330mg/L、Ca(NO3)2500mg/L、K2SO4550mg/L、KH2PO4350mg/L、FeSO425mg/L、Na2-EDTA40mg/L、KI 0.5mg/L、H3BO36.5mg/L、MnSO425mg/L、ZnSO49.0mg/L、Na2MoO40.3mg/L、CuSO40.3mg/L、鹽酸硫胺素8mg/L、煙酸0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3mg/L、肌醇90mg/L、甘氨酸1mg/L、乙哚丁酸1.0mg/L、萘乙酸0.015mg/L，余量為水。
將歐洲山楊組培苗從不定芽生根培養(yǎng)基中拔出，洗掉根上附著的培養(yǎng)基，將根沾入質(zhì)量濃度為0.5％的高錳酸鉀溶液中滅菌后直接栽入已滅菌的裝有蛭石的育苗盤內(nèi)，株行距為3cm×4cm，當(dāng)日澆透水，以后3d內(nèi)用塑料膜將育苗盤連同移栽小苗一同蓋嚴(yán)，以保持相對濕度，第4～10d逐漸揭去塑料膜，第1～3d空氣濕度保持在85％，第4～7d空氣濕度保持在75％，第8～10d空氣濕度保持在50％。期間第2、7d分別以1/4MS培養(yǎng)基大量元素溶液進(jìn)行葉面施肥，施肥量30ml/m2，移栽第7～15d后苗木長出新根。將已經(jīng)長出新根的小苗連同粘在上面的蛭石一起植入輕基質(zhì)網(wǎng)袋育苗容器內(nèi)在溫室中緩苗2～3d，移入自然光下，正常生長和管理。
容器苗苗期水肥管理與病蟲害防治：輕基質(zhì)網(wǎng)袋育苗法苗期生長要特別注意水肥的管理，基質(zhì)濕度保持在25％。芽苗恢復(fù)生長后約30d，用復(fù)合肥和尿素對半拌勻，每隔10d追施1次，施肥濃度按0.5％，施肥量0.3g/株，隨著苗木增大，移栽后第二個月施肥濃度調(diào)整為0.55％，第三個月后調(diào)整為0.8％，同時施肥后用清水沖洗葉面，以免肥害。芽苗移栽成活后，每月用0.5％波爾多液與多菌靈500倍藥液交替噴灑1次，以防止立枯病的發(fā)生。
莖段經(jīng)過酒精溶液浸泡和氯化汞溶液消毒后，對莖段的殺傷率為7.3％，對莖段的污染率為12.2％；莖段在不定芽分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)后，分化率為89％，分化系數(shù)為4.23；歐洲山楊不定芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)為4.6；歐洲山楊不定芽轉(zhuǎn)接到不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根率為90％，每組培苗生根條數(shù)為9條，成活率為91.6％；本發(fā)明的莖段經(jīng)過分化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)三個階段，使莖段的繁殖周期縮短1～2個月；將歐洲山楊組培苗移栽到育苗盤內(nèi)，待長出新根后再移栽到育苗容器內(nèi)培養(yǎng)，可使組培苗的移栽成活率在95％以上，移栽的歐洲山楊組培苗的莖、根干質(zhì)量比例為1.5:1，組培苗的苗干90％以上達(dá)到木質(zhì)化。
由以上實施例可知，采用本發(fā)明的歐洲山楊品系組培育苗方法，得到組培苗的成活率為91.4～91.6％。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。