本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥領(lǐng)域，具體的說是gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物在防治植物害蟲與病原線蟲中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小菜蛾plutelaxylostellal.(dbm)屬鱗翅目菜蛾科，是十字花科植物重要害蟲。小菜蛾發(fā)生世代多且重疊嚴(yán)重，對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖系數(shù)高，在我國各省區(qū)均有分布。嚴(yán)重為害甘藍(lán)、花椰菜、球莖甘藍(lán)、芥菜、白菜、蘿卜和油菜等，也取食馬鈴薯、番茄、蔥和洋蔥等，甚至包括紫羅蘭、桂竹香等觀賞植物及板藍(lán)根等藥用植物。多年來對小菜蛾的防治以使用化學(xué)合成農(nóng)藥為主，不但使小菜蛾的抗性不斷增強(qiáng)，而且污染自然環(huán)境，影響食品安全。
近年來，隨著番茄保護(hù)地栽培面積迅速擴(kuò)大，根結(jié)線蟲病發(fā)生的程度逐年加重。同時(shí)，根結(jié)線蟲危害還加重了枯萎病、根腐病等土傳性真菌病害和部分細(xì)菌病害的發(fā)生，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量與品質(zhì)。與小菜蛾的防治類似，番茄根結(jié)線蟲病也主要依靠化學(xué)合成農(nóng)藥，同樣帶來環(huán)境相容性差等問題。
因此，尋找并開辟小菜蛾與番茄根結(jié)線蟲病防治新途徑成為當(dāng)前蔬菜生產(chǎn)中急需解決的問題之一。其中，利用微生物來控制小菜蛾與番茄根結(jié)線蟲病，并開發(fā)微生物農(nóng)藥是近年來的研究熱點(diǎn)。微生物農(nóng)藥作為一種“環(huán)境友好”的無公害綠色農(nóng)藥，能夠有效克服化學(xué)合成農(nóng)藥的弊端，在植物病蟲害防治中的作用日益明顯。因此，從微生物中尋找并開發(fā)綠色環(huán)保的生物農(nóng)藥已經(jīng)成為未來農(nóng)藥發(fā)展的趨勢。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物在防治植物害蟲與病原線蟲中的應(yīng)用，所述gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物可用于制備微生物殺蟲劑與殺線蟲劑。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物在制備防治植物害蟲與病原線蟲微生物農(nóng)藥中的應(yīng)用。所述菌株保藏于2016年12月9日，保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13199。所述植物害蟲為小菜蛾、甜菜夜蛾與粉紋夜蛾中的一種或幾種。所述植物病原線蟲為番茄根結(jié)線蟲、西洋參根結(jié)線蟲與棉花根結(jié)線蟲中的一種或幾種。
所述gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物的制備方法如下：gibberellaintermediaqjp2經(jīng)培養(yǎng)基搖床或靜置發(fā)酵10-30天，乙酸乙酯提取3次得到。所述培養(yǎng)基比例為：甘露醇2%，葡萄糖2%，kh2po40.05%，mgso4?7h2o0.03%，酵母浸粉0.3%，玉米漿0.1%，人工海水（nacl3%）配制，ph6.5。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物可由菌株gibberellaintermediaqjp2經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、提取分離而獲得，其對小菜蛾具有較好的殺蟲活性，1.0mg/ml濃度，致死率達(dá)85.6±1.3%，可用于制備防治植物害蟲的微生物殺蟲劑；gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物對番茄根結(jié)線蟲病也具有較好的防控效果，其50倍與100倍稀釋液對番茄根結(jié)線蟲的致死率分別為95%與81%，可用于制備防治植物病原線蟲的微生物農(nóng)藥。
本發(fā)明所涉及的gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物可以利用微生物進(jìn)行規(guī)模發(fā)酵，具有生產(chǎn)工藝簡單、周期短、產(chǎn)品成本低等特點(diǎn)；且在環(huán)境中易于降解，對人畜毒性較低。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是示例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例1：gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物的制備
（1）發(fā)酵培養(yǎng)
按照微生物的常規(guī)培養(yǎng)方法，挑取少量保存于pda培養(yǎng)基斜面的菌株gibberellaintermediaqjp2，接種于pda平板表面，28℃培養(yǎng)5天，作為規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的菌種，待用。
pda培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂12g，蒸餾水1000ml，ph調(diào)至7.0。
切取上述pda平板表面的菌種，接種至已滅菌的、盛有mh2培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃、120rpm搖床培養(yǎng)10天。
mh2培養(yǎng)基：甘露醇2%，葡萄糖2%，kh2po40.05%，mgso4?7h2o0.03%，酵母浸粉0.3%，玉米漿0.1%，人工海水（nacl3%）配制，ph6.5。
（2）發(fā)酵提取物的制備
將培養(yǎng)基以四層紗布過濾，得到發(fā)酵液與菌絲體。發(fā)酵液以乙酸乙酯萃取3次，菌絲體以乙酸乙酯超聲提取3次，合并得到發(fā)酵提取物。
實(shí)施例2：小菜蛾殺蟲活性測定
采用葉碟浸漬法測定菌株發(fā)酵提取物對小菜蛾2齡幼蟲的殺蟲活性。
操作步驟：（1）將新鮮的油菜葉片剪成1cm×1cm的小葉碟，樣品（實(shí)施例1中制備得到的發(fā)酵提取物）用90%丙酮溶液配制成一定濃度的溶液；（2）吸取50μl樣品溶液加入裝有4片葉碟的24孔板中，每濃度8個(gè)重復(fù)，以90%丙酮溶液做空白對照；（3）待溶劑揮干后，加入小菜蛾2齡幼蟲，每孔1頭，蓋好蓋子，35℃、rh40%條件下避光培養(yǎng)；（4）培養(yǎng)72h后，觀察小菜蛾幼蟲取食和死亡情況，計(jì)算校正死亡率。校正死亡率=（a-ck）/（1-ck）×100%，a為樣品孔致死率，ck為對照孔致死率。
實(shí)驗(yàn)表明，gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物在濃度為1.0mg/ml時(shí)，對小菜蛾具有較好的殺蟲活性，致死率為85.6±1.3%，可用于制備防治植物害蟲的微生物殺蟲劑。
實(shí)施例3：殺線蟲活性
（1）實(shí)驗(yàn)方法
供試線蟲培養(yǎng)方法
稱取20g燕麥片加60ml水，滅菌后加入1ml番茄根結(jié)線蟲懸液，25℃培養(yǎng)7d。在無菌條件下，挑取適量已培養(yǎng)好的含線蟲的燕麥放于濾紙上，用簡易貝曼漏斗法洗出線蟲，將線蟲懸于無菌水中備用，濃度約為2000條/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
殺線蟲活性測定
取一定量樣品（實(shí)施例1中制備得到的發(fā)酵提取物），以50%dmso水溶液分別稀釋50與100倍，吸取1ml至滅菌離心管中，再加入線蟲懸液100μl，以50%dmso處理為對照，25℃靜置12h?；靹蚝?，吸取混合液點(diǎn)到載玻片上，置于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)死亡線蟲數(shù)及線蟲總數(shù)（線蟲僵直不動(dòng)視為死亡），計(jì)算死亡率。每次觀察的線蟲數(shù)不少于30條。
判斷活性級別的標(biāo)準(zhǔn)為：死亡率＞90%為“+++”級；70%＜死亡率＜90%，為“++”級；50%＜線蟲死亡率＜70%，為“+”級；死亡率＜50%，為“－”級。
（2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果
gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物的50倍稀釋液對番茄根結(jié)線蟲的致死率為95%，活性級別為“+++”級；12h后在顯微鏡下觀察各處理蟲體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)死亡線蟲的蟲體僵直，而對照活線蟲運(yùn)動(dòng)活潑。
而gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物的100倍稀釋液對番茄根結(jié)線蟲的致死率為81%，活性級別為“++”級?？梢姡M管發(fā)酵提取物進(jìn)一步稀釋后，致死率有所下降，但相比空白對照（5%）仍表現(xiàn)出明顯的殺線蟲活性。因此，gibberellaintermediaqjp2發(fā)酵提取物能夠有效防治植物病原線蟲，尤其是番茄根結(jié)線蟲，可用于制備防治植物病原線蟲的微生物農(nóng)藥。