本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬鈴薯莖段組織培養(yǎng)基，還包括馬鈴薯試管苗莖段一步成苗培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

馬鈴薯(solanumtuberosuml.)是茄科茄屬一年生草本塊莖植物，是重要的糧、菜、飼料和工業(yè)原料兼農(nóng)作物，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有相當(dāng)重要的地位。為了創(chuàng)新種質(zhì)資源，組織培養(yǎng)技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于馬鈴薯育種研究中，并取得了顯著成果。

近年來,生物技術(shù)的迅猛發(fā)展為馬鈴薯的研究和生產(chǎn)帶來了勃勃生機(jī),通過組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行馬鈴薯遺傳改良，已成為馬鈴薯分子育種的重要方面。然而，無(wú)論是遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，還是突變體的篩選、優(yōu)良種苗的快速繁殖及體細(xì)胞雜交等技術(shù)都有賴于組織培養(yǎng)再生環(huán)節(jié)。再生體系的建立是利用生活的植物細(xì)胞具有全能性的理論基礎(chǔ),通過愈傷組織再生形成新的植株,即通過對(duì)外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化成苗來獲得再生植株。目前馬鈴薯再生體系中采用的外植體主要有試管苗的葉片、莖段、葉柄、根等，主要采用外植體-愈傷組織(誘導(dǎo)培養(yǎng))-分化幼苗(分化培養(yǎng))-生根(生根培養(yǎng))等多個(gè)培養(yǎng)程序。即將外植體進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)出愈傷組織，再將愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中再生植株。經(jīng)多步培養(yǎng)途徑煩瑣、再生率普遍較低且誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，而且再生系統(tǒng)易受基因型、外植體種類、植物激素的種類及濃度、培養(yǎng)條件和操作技術(shù)水平等諸多因素影響，使馬鈴薯不同品種的再生系統(tǒng)存在較大差異。本專利針對(duì)這些問題研究提出了以莖段為外植體的一步成苗培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基使馬鈴薯試管苗莖段組織培養(yǎng)一步成苗，具有再生周期短，繁殖系數(shù)和再生頻率高，基因型適應(yīng)性廣譜，易操作，培養(yǎng)程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，為馬鈴薯優(yōu)良種苗快速繁殖、突變體篩選及品種改良提供一條有效途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于針對(duì)馬鈴薯再生體系研究中存在的再生頻率低、誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，不同基因型之間誘導(dǎo)再生條件存在差異等問題，提供一種一步成苗的馬鈴薯莖段組織培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。馬鈴薯試管苗莖段在形成愈傷組織后，不需要轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，而是直接在原培養(yǎng)基上分化成苗，提高了馬鈴薯試管苗莖段愈傷組織的再生效率、縮短了培養(yǎng)時(shí)間、簡(jiǎn)化了操作步驟，且基因型適應(yīng)性廣譜，為馬鈴薯優(yōu)良種苗快速繁殖、突變體篩選及品種改良提供一條有效途徑。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:

一種馬鈴薯莖段組織培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

a.培養(yǎng)基制備

每升ms培養(yǎng)基中添加1～3mg6-芐基氨基嘌呤、0.01～0.1mg萘乙酸、2.5～7.5mg赤霉素、50-100mg肌醇、25～30g食用白糖和3～4.5g瓊脂；

ｂ.培養(yǎng)基處理

培養(yǎng)基加熱至沸騰，加熱過程中不斷攪拌，待瓊脂完全溶解后將ph值調(diào)整為5.8～6.0；分裝后高壓蒸汽滅菌，滅菌后的培養(yǎng)基靜置降溫凝固；

c.接種苗處理

選取苗齡20～30天的馬鈴薯無(wú)菌試管苗，無(wú)菌條件下，切取0.5cm～1cm不帶腋芽的莖段，接種于步驟b的培養(yǎng)基；

d.接種苗培養(yǎng)

將步驟c接種莖段的培養(yǎng)基置于溫度為21±2℃、光照強(qiáng)度3500～4000lx、光照時(shí)間16h/天的條件下培養(yǎng)；

e.分段培養(yǎng)

培養(yǎng)15天，莖段膨大，有愈傷組織形成，表面形成顆粒狀物質(zhì)或瘤狀突起；培養(yǎng)25～30天，莖段愈傷組織分化叢生芽；培養(yǎng)28-35天，獲得馬鈴薯再生植株。

所述步驟b中培養(yǎng)基加熱至沸騰，加熱過程中不斷攪拌，待瓊脂完全溶解后將ph值調(diào)整為5.8～6.0；分裝后高壓蒸汽滅菌，蒸汽溫度120℃、壓力1.5mpa條件下消毒15～20min，滅菌后的培養(yǎng)基靜置降溫凝固。

所述每升ms培養(yǎng)基中添加3mg6-芐基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明的基本培養(yǎng)基選用ms傳統(tǒng)培養(yǎng)基，提供培養(yǎng)組織生長(zhǎng)發(fā)育所需的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素和部分有機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素；6-芐氨基嘌呤、萘乙酸、赤霉素是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)培養(yǎng)組織形成叢生芽的作用；肌醇促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)和芽形成；食用白糖提供培養(yǎng)組織生長(zhǎng)發(fā)育所需的碳素營(yíng)養(yǎng)；瓊脂的主要作用是固化培養(yǎng)基，起支撐作用。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基具有廣譜性，適合多數(shù)馬鈴薯品種莖段組織培養(yǎng)一步成苗。本發(fā)明通過合理掌控激素用量及相互間的配比，以及其他輔料的添加，使莖段外植體在形成愈傷組織后，不需要轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，而是直接在原培養(yǎng)基上分化成苗，縮短培養(yǎng)時(shí)間兩個(gè)月左右，降低了經(jīng)濟(jì)成本；而且該培養(yǎng)基具有廣譜性，適應(yīng)于大多數(shù)品種。該培養(yǎng)基使馬鈴薯試管苗莖段組織培養(yǎng)一步成苗，具有再生周期短，繁殖系數(shù)和再生頻率高，基因型適應(yīng)性廣譜，易操作，培養(yǎng)程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，為馬鈴薯優(yōu)良種苗快速繁殖、突變體篩選及品種改良提供一條有效途徑。

附圖說明

圖1為本發(fā)明培養(yǎng)的叢生芽圖；

圖2為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯植株圖；

圖3為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯大西洋再生圖；

圖4為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯隴薯12號(hào)再生圖；

圖5為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯隴薯8號(hào)再生圖；

圖6為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯隴薯7號(hào)再生圖；

圖7為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯隴薯9號(hào)再生圖；

圖8為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯lk99再生圖；

圖9為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯隴薯11號(hào)再生圖；

圖10為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯隴薯14號(hào)再生圖；

圖11為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯隴薯4號(hào)再生圖；

圖12為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯隴薯5號(hào)再生圖；

圖13為本發(fā)明培養(yǎng)的馬鈴薯隴薯3號(hào)再生圖。

具體實(shí)施方式

一種馬鈴薯莖段組織培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟：

a、培養(yǎng)基制備

每升ms培養(yǎng)基中添加1～3mg6-芐基氨基嘌呤、0.01～0.1mg萘乙酸、2.5～7.5mg赤霉素、50-100mg肌醇、25～30g食用白糖和3～4.5g瓊脂；

ｂ、培養(yǎng)基處理

培養(yǎng)基加熱至沸騰，加熱過程中不斷攪拌，待瓊脂完全溶解后將ph值調(diào)整為5.8～6.0；分裝后高壓蒸汽滅菌，蒸汽溫度120℃、壓力1.5mpa條件下消毒15～20min，滅菌后的培養(yǎng)基靜置降溫凝固；

c、接種苗處理

選取苗齡20～30天的馬鈴薯無(wú)菌試管苗，無(wú)菌條件下，切取0.5cm～1cm不帶腋芽的莖段，接種于步驟b的培養(yǎng)基；

d、接種苗培養(yǎng)

將步驟c接種莖段的培養(yǎng)基置于溫度為21±2℃、光照強(qiáng)度3500～4000lx、光照時(shí)間16h/天的條件下培養(yǎng)；

e、分段培養(yǎng)

培養(yǎng)15天，莖段膨大，有愈傷組織形成，表面形成顆粒狀物質(zhì)或瘤狀突起；培養(yǎng)25～30天，莖段愈傷組織分化叢生芽；培養(yǎng)28-35天，獲得馬鈴薯再生植株。

優(yōu)選的所述每升ms培養(yǎng)基中添加3mg6-芐基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇。

以下實(shí)施例為本發(fā)明作詳細(xì)闡述，圖3至圖13分別為各品種試管苗莖段一步再生苗。

試驗(yàn)材料選用馬鈴薯品種隴薯8號(hào)的脫毒試管苗，由甘肅省農(nóng)科院馬鈴薯所提供。

以ms基本培養(yǎng)基作為對(duì)照，采用l16(4⁵)正交設(shè)計(jì)，在ms培養(yǎng)基中添加不同濃度和組合的6-芐基氨基嘌呤（6-ba）、萘乙酸（naa）、赤霉素（ga3）和肌醇，配制成16組不同的培養(yǎng)基。各組中含有的6-芐基氨基嘌呤、萘乙酸、赤霉素和肌醇的濃度和組合見表1。

將培養(yǎng)基滅菌后，選取苗齡20～30天的隴薯8號(hào)無(wú)菌試管苗，無(wú)菌條件下，切取0.5cm～1cm不帶腋芽的莖段，接種于上述培養(yǎng)基上。將接種好的培養(yǎng)瓶置于燈光培養(yǎng)架上培養(yǎng)，溫度為21±2℃、光照強(qiáng)度3500lx、光照時(shí)間16h/d。培養(yǎng)30d左右統(tǒng)計(jì)芽分化率（分化率%=分化外植體數(shù)/總外植體數(shù)），結(jié)果見表2。

注：同列中的不同小寫字母表示差異顯著，p<0.05；大寫字母表示差異極顯著，p<0.01

分析表2所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，4種成分對(duì)隴薯8號(hào)誘導(dǎo)芽分化的能力由強(qiáng)到弱依次為：6-ba>肌醇>ga3>naa，可看出，6-ba的存在對(duì)不定芽的形成影響最大，肌醇的影響次之，ga3和naa的影響較弱。為尋求最佳濃度的激素組合，進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，組合6、8、16之間無(wú)極顯著差異，但均極顯著大于其他組合，其中組合6與8無(wú)顯著差異，6與16差異顯著，8與16無(wú)顯著差異；組合8、16、9和14之間，16、9、14和11之間，9、14、11和10之間，10、13和4之間，13、4、15和5之間，4、15、5、2和12之間均無(wú)極顯著差異，但差異顯著，而組合2、12和7之間以及7、1、3之間既無(wú)極顯著差異也無(wú)顯著差異。綜上說明組合6和8均是促進(jìn)不定芽形成的最優(yōu)組合，而從叢生芽的長(zhǎng)勢(shì)來看，組合8誘導(dǎo)的叢生芽數(shù)量較多且生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)。

綜上可知，能夠使馬鈴薯莖段離體培養(yǎng)一步成苗的培養(yǎng)基組分為：以ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并在1lms培養(yǎng)基中，還需補(bǔ)加的組分及各組分的終濃度為：

赤霉素2.5～7.5mg/l；

6-芐基氨基嘌呤1～3mg/l；

萘乙酸0.01～0.1mg/l；

肌醇50-100mg/l。

再結(jié)合表2分析第8組所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中的各成分的濃度和組合，可知，最佳的馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基的組分為：1lms培養(yǎng)基中，含有終濃度為5mg/l赤霉素、3mg/l6-芐基氨基嘌呤、100mg/l肌醇和0.01mg/l萘乙酸。

實(shí)施例2

利用所述的馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基，使馬鈴薯莖段組織培養(yǎng)一步成苗，包括如下步驟：(1)、每升ms培養(yǎng)基中添加1mg6-芐基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、2.5mg赤霉素、50mg肌醇、25g食用白糖和3g瓊脂；ph值調(diào)整為5.8；分裝后高壓蒸汽滅菌。滅菌后的培養(yǎng)基放入接種室內(nèi)靜置，讓其降溫后凝固。

（2）選取苗齡20～30天的馬鈴薯品種大西洋無(wú)菌試管苗，無(wú)菌條件下，切取0.5cm～1cm不帶腋芽的莖段，接種于上述培養(yǎng)基上。將接種好的培養(yǎng)瓶置于燈光培養(yǎng)架上培養(yǎng)，溫度為21±2℃、光照強(qiáng)度3500lx、光照時(shí)間16h/d。

（3）培養(yǎng)28d，得馬鈴薯再生植株。

實(shí)施例3

每升ms培養(yǎng)基中添加3mg6-芐基氨基嘌呤、0.1mg萘乙酸、7.5mg赤霉素、100mg肌醇、30g食用白糖和4.5g瓊脂；培養(yǎng)基加熱至沸騰，加熱過程中不斷攪拌，待瓊脂完全溶解后將ph值調(diào)整為6.0；分裝后高壓蒸汽滅菌，蒸汽溫度120℃、壓力1.5mpa條件下消毒15～20min，滅菌后的培養(yǎng)基靜置降溫凝固；無(wú)菌條件下，切取0.5cm～1cm不帶腋芽的莖段，接種于步驟b的培養(yǎng)基；將步驟c接種莖段的培養(yǎng)基置于溫度為21±2℃、光照強(qiáng)度4000lx、光照時(shí)間16h/天的條件下培養(yǎng)；選取苗齡20～30天的馬鈴薯品種lk99，一步成苗培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)方法同上，培養(yǎng)40d，得馬鈴薯再生植株。

實(shí)施例4

每升ms培養(yǎng)基中添加3mg6-芐基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇30g食用白糖和4.5g瓊脂；培養(yǎng)基加熱至沸騰，加熱過程中不斷攪拌，待瓊脂完全溶解后將ph值調(diào)整為6.0；分裝后高壓蒸汽滅菌，蒸汽溫度120℃、壓力1.5mpa條件下消毒15～20min，滅菌后的培養(yǎng)基靜置降溫凝固；無(wú)菌條件下，切取0.5cm～1cm不帶腋芽的莖段，接種于步驟b的培養(yǎng)基；將步驟c接種莖段的培養(yǎng)基置于溫度為21±2℃、光照強(qiáng)度4000lx、光照時(shí)間16h/天的條件下培養(yǎng)；

選取苗齡20～30天的馬鈴薯品種隴薯7號(hào)，一步成苗培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)方法同上，培養(yǎng)32d，得馬鈴薯再生植株。

實(shí)施例5

每升ms培養(yǎng)基中添加2mg6-芐基氨基嘌呤、0.05mg萘乙酸、5mg赤霉素、70mg肌醇、26g食用白糖和4g瓊脂；培養(yǎng)基加熱至沸騰，加熱過程中不斷攪拌，待瓊脂完全溶解后將ph值調(diào)整為6.0；分裝后高壓蒸汽滅菌，蒸汽溫度120℃、壓力1.5mpa條件下消毒15～20min，滅菌后的培養(yǎng)基靜置降溫凝固；無(wú)菌條件下，切取0.5cm～1cm不帶腋芽的莖段，接種于步驟b的培養(yǎng)基；將步驟c接種莖段的培養(yǎng)基置于溫度為21±2℃、光照強(qiáng)度3800lx、光照時(shí)間16h/天的條件下培養(yǎng)；選取苗齡20～30天的馬鈴薯品種隴薯12號(hào)，一步成苗培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)方法同上，培養(yǎng)30d，得馬鈴薯再生植株。

實(shí)施例6

每升ms培養(yǎng)基中添加3mg6-芐基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇30g食用白糖和4.5g瓊脂；培養(yǎng)基加熱至沸騰，加熱過程中不斷攪拌，待瓊脂完全溶解后將ph值調(diào)整為6.0；分裝后高壓蒸汽滅菌，蒸汽溫度120℃、壓力1.5mpa條件下消毒15～20min，滅菌后的培養(yǎng)基靜置降溫凝固；無(wú)菌條件下，切取0.5cm～1cm不帶腋芽的莖段，接種于步驟b的培養(yǎng)基；將步驟c接種莖段的培養(yǎng)基置于溫度為21±2℃、光照強(qiáng)度4000lx、光照時(shí)間16h/天的條件下培養(yǎng)；

選取苗齡20～30天的馬鈴薯品種隴薯9號(hào)，一步成苗培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)方法同上，培養(yǎng)30d，得馬鈴薯再生植株。

實(shí)施例7

每升ms培養(yǎng)基中添加3mg6-芐基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇30g食用白糖和4.5g瓊脂；培養(yǎng)基加熱至沸騰，加熱過程中不斷攪拌，待瓊脂完全溶解后將ph值調(diào)整為6.0；分裝后高壓蒸汽滅菌，蒸汽溫度120℃、壓力1.5mpa條件下消毒15～20min，滅菌后的培養(yǎng)基靜置降溫凝固；無(wú)菌條件下，切取0.5cm～1cm不帶腋芽的莖段，接種于步驟b的培養(yǎng)基；將步驟c接種莖段的培養(yǎng)基置于溫度為21±2℃、光照強(qiáng)度4000lx、光照時(shí)間16h/天的條件下培養(yǎng)；

選取苗齡20～30天的馬鈴薯品種隴薯5號(hào)，一步成苗培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)方法同上，培養(yǎng)40d，得馬鈴薯再生植株。

實(shí)施例8

每升ms培養(yǎng)基中添加3mg6-芐基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇30g食用白糖和4.5g瓊脂；培養(yǎng)基加熱至沸騰，加熱過程中不斷攪拌，待瓊脂完全溶解后將ph值調(diào)整為6.0；分裝后高壓蒸汽滅菌，蒸汽溫度120℃、壓力1.5mpa條件下消毒15～20min，滅菌后的培養(yǎng)基靜置降溫凝固；無(wú)菌條件下，切取0.5cm～1cm不帶腋芽的莖段，接種于步驟b的培養(yǎng)基；將步驟c接種莖段的培養(yǎng)基置于溫度為21±2℃、光照強(qiáng)度4000lx、光照時(shí)間16h/天的條件下培養(yǎng)；

選取苗齡20～30天的馬鈴薯品種隴薯3號(hào)、隴薯4號(hào)、隴薯11號(hào)、隴薯14號(hào)，一步成苗培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)方法同上，培養(yǎng)35d，得馬鈴薯再生植株。