本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單葉鐵線蓮的組培快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

植物是藥物的天然寶庫，人類利用藥用植物來防病治病已有幾千年歷史。全世界約有75％的人口以植物作為治療疾病的藥物來源(刑建民，2001)。當(dāng)今的處方藥有25％左右來自于藥用植物(邱德有,2000)。植物是化合物的重要來源之一。植物合成和積累的用于提取的次生代謝物的數(shù)量被視為經(jīng)濟(jì)實(shí)用的原料，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品等行業(yè)。工業(yè)化加上城市化不斷地增加自然資源的壓力。由于棲息地的破壞和掠奪式的過度采收，致使很多中藥資源蘊(yùn)含量下降，甚至耗竭，一些種類瀕臨滅絕(黃璐琦,2001)。生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展為從根本上改變傳統(tǒng)藥材的生產(chǎn)提供了一個(gè)嶄新的方法。在快速繁殖、保護(hù)和增強(qiáng)有用的次級(jí)代謝物的水平以滿足藥物的需求并減少原位采收自然資源方面，植物組織培養(yǎng)技術(shù)擁有巨大的潛力(bapat等，2008)。近年來，國內(nèi)外在這方面已做了大量工作，已成功離體培養(yǎng)獲得試管植株的藥用植物有200多種。

鐵線蓮屬(clematis)為毛茛科(ranunculaceae)植物，該屬大多數(shù)種類為多年生木質(zhì)藤本，少數(shù)為直立草本、灌木或亞灌木。全世界約355種，我國有147種，分布于全國各地(wu，2001)。由于該屬植物花萼大，顏色豐富、花期長，因此是園林藤本花木中的重要類群。除了觀賞價(jià)值高之外，本屬的大部分種類還具有藥用價(jià)值。如《中國藥典》2010版收錄的威靈仙的原植物為威靈仙(clematischinensisosbeck)、棉團(tuán)鐵線蓮(c.hexapetalapall.)、東北鐵線蓮(c.mandshuricarupr.)的干燥根或根莖；川木通的原植物為小木通(c.armandiifranch.)、繡球藤(c.montanabuch.-ham.)的干燥藤莖(國家藥典委員會(huì),2010)。該屬植物的主要次生代謝產(chǎn)物為五環(huán)三萜類皂苷。迄今為止，在該屬植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)50多種的齊墩果酸型(oleanolictypeprototype)的皂苷，40多種常春藤苷配基(hederagenintypeprototype)的皂苷和兩種絲石竹配基(gypsogenin)的皂苷以及50多種黃酮類化合物，24種木脂素類化合物，11種生物堿等(hao等，2013)。該屬的26種植物被用于各種疾病的治療，如神經(jīng)紊亂、梅毒、痛風(fēng)、瘧疾、痢疾、風(fēng)濕病、哮喘和具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎、利尿、抗腫瘤、抗菌和抗癌活性(chawla等，2012)。

單葉鐵線蓮(c.henryioliv.)為該屬多年生常綠木質(zhì)藤本植物，又名雪里開、地雷、拐子藥等，生于海拔400～1200m的溪邊、林緣、灌叢或石縫中，分布于長江流域中、下游和以南各省區(qū)。根含甾醇類，能清熱解毒、抗菌消炎、活血消腫，可治急慢性支氣管炎、腮腺炎。莖葉能行氣活血，可治頭、胃、肌肉、關(guān)節(jié)等疼痛(浙江植物志，1992)。

近年來，為開發(fā)利用該資源，雷永軍等(2000)對(duì)單葉鐵線蓮的藥材性狀及粉末特征等進(jìn)行了組織顯微鑒別?；瘜W(xué)成分的研究表明其含有β-谷甾醇、甘露醇、胡蘿卜苷、熊果酸等化合物(劉韶等，2007)；藥理研究表明其具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的作用(周雪仙,1985)。

迄今為止，國內(nèi)外關(guān)于單葉鐵線蓮組織培養(yǎng)方面的研究還是有限的和初步的。黃余磊等人(2011)利用單葉鐵線蓮的嫩莖誘導(dǎo)愈傷組織，從愈傷組織上分化出不定芽，不定芽細(xì)弱，葉片不開展，并且愈傷組織的基部出現(xiàn)類似原球莖的結(jié)構(gòu)，這個(gè)在蘭科植物組織培養(yǎng)過程中的常見現(xiàn)象出現(xiàn)在鐵線蓮中，非常值得考證。并且通過愈傷組織的誘導(dǎo)和分化得到的不定芽容易出現(xiàn)變異，不利于該物種的繁衍和保存，因此探索更加有效的單葉鐵線蓮的繁殖方式迫在眉睫。由于本種植物目前全部是野生，用途廣泛、藥效顯著，毫無節(jié)制地狂采濫挖，導(dǎo)致該資源日漸枯竭。該物種瘦果較小，具有伸長呈羽狀的宿存花柱，導(dǎo)致果實(shí)很容易隨風(fēng)飄散，難以收獲。因此，發(fā)展和利用離體快繁的方法勢在必行。現(xiàn)有的單葉鐵線蓮野生資源難以滿足日益增長的醫(yī)藥領(lǐng)域的需要，為了保護(hù)野生的單葉鐵線蓮資源，同時(shí)又能滿足醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用，因此有必要建立單葉鐵線蓮的離體再生體系，這對(duì)豐富植物組織培養(yǎng)的理論和應(yīng)用生物技術(shù)保護(hù)種質(zhì)資源以及滿足臨床應(yīng)用等均有重要意義。

上文中涉及的參考文獻(xiàn)如下：

1、國家藥典委員會(huì).中華人們共和共藥典.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010。

2、黃璐琦,李慧,陳京荔.珍稀瀕危中藥資源保護(hù)的相關(guān)問題探討.世界科學(xué)技術(shù)——中藥現(xiàn)代化,2001,3(6):46-49。

3、黃余磊,呂枷薪,蔣明等.單葉鐵線蓮clematishenryi愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,23(4):731－735。

4、雷永軍,孟黎明,夏昌斌等.雪里開的性狀及組織顯微鑒別.中藥材,2000,第23(11)679-680。

5、劉韶,向大雄,顏苗,等.單葉鐵線蓮化學(xué)成分研究.中成藥,2007,29(9):1379-1380。

6、邱德有.試論藥用植物有效成分基因調(diào)控的研究進(jìn)展.世界科學(xué)技術(shù)——中藥現(xiàn)代化,2000,2(3):30-34。

7、邢建民,趙德修,葉和春等.水母雪蓮細(xì)胞生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng).植物學(xué)報(bào),2000,42(1):98-101。

8、浙江植物志編輯委員會(huì).浙江植物志第二卷，1992,283-284。

9、周雪仙.雪里開的藥理研究.中藥藥理與臨床,1985,95。

10、bapatva,yadavsr,dixitgb.rescueofendangeredplantsthroughbiotechnologicalapplications.nationalacademyscienceletters-india.2008,31(7&8):201-211(bapatva,yadavsr,dixitgb.通過生物技術(shù)的應(yīng)用拯救瀕危植物.印度國家科學(xué)院學(xué)報(bào),2008,31(7&8):201-211).

11、chawlar,kumars，sharmaa.thegenusclematis(ranunculaceae):chemicalandpharmacologicalperspectives.journalofethnopharmacology,2012,(143):116–150.(chawlar,kumars，sharmaa.毛茛科鐵線蓮屬：化學(xué)和藥理學(xué)展望.民族藥理學(xué)雜志,2012,(143):116–150)

12、dirrma.manualofwoodylandscapeplants:theiridentification,ornamentalcharacteristics,culture,propagation,anduses.champaign,il:stipespublishing,1990,pp.1007(dirr,m.a.木本景觀植物手冊(cè)：它們的鑒定，觀賞特征，培養(yǎng)，繁殖和用途.尚佩恩,il葉柄出版公司,1990,pp.1007).

13、haodc，guxj，xiaopg，pengy.chemicalandbiologicalresearchofclematismedicinalresources.chinesesciencebulletin,2013,58(10):1120-1129.(haodc，guxj，xiaopg，pengy.鐵線蓮屬藥用資源的化學(xué)和生物學(xué)研究.中國科學(xué)通報(bào)，2013,58(10):1120-1129).

14、wangwt,bruceb.clematisl.wuzy,ravenph(eds:floraofchina(vol6)beijing:sicencepress,2001:333-386(wangwt,bruceb.鐵線蓮屬.wuzy,ravenph(eds)中國植物志，第6卷，北京：科學(xué)出版社,2001:333-386).

文中所提及的縮寫字母的以及見如下縮略詞表：

msmurashigeandskoogmediumms培養(yǎng)基

bapn6-benzylaminopurine6-芐基腺嘌呤

ktkinetin激動(dòng)素

naaα-naphthaleneaceticacidα-柰乙酸

iaaindole-3-aceticacid吲哚乙酸

ibaindole-3-butyricacid吲哚丁酸

ga3gibberellicacid3赤霉素

2,4-d2,4-dicholrophenoxyacetic2，4-二氯苯氧乙酸

acid

pvppolyvinylpyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮

acactivatedcharcoal活性炭。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種單葉鐵線蓮的組培快速繁殖方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種單葉鐵線蓮的組培快速繁殖方法，利用單葉鐵線蓮的種子為外植體，依次進(jìn)行以下步驟：

1)、取材：

選擇單葉鐵線蓮的瘦果，剝離果皮(體視顯微鏡下剝離果皮，果皮上布滿絨毛，容易造成滅菌不徹底而污染)，得種子；

2)、種子消毒：

將步驟1)所得的種子進(jìn)行消毒，得消毒后種子；

3)、種子休眠的破除：

先將消毒后種子用抽濾滅菌后的bap溶液、或ga3溶液浸泡22～26小時(shí)(較佳為24小時(shí))，然后用無菌水沖洗，接著播種在種子培養(yǎng)基上，黑暗狀態(tài)下培養(yǎng)6～8天(較佳為一周)后轉(zhuǎn)入光/暗交替培養(yǎng)直至頂芽長至0.5～1cm時(shí)停止培養(yǎng)(培養(yǎng)時(shí)間約為7天)，得無菌苗；

所述種子培養(yǎng)基為ms+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂，ph5.8～6.0；

bap溶液的濃度為18～22mg/l(較佳為20mg/l)，ga3溶液的濃度為95～105mg/l(較佳為100mg/l)；

4)、頂芽的增殖培養(yǎng)(快速擴(kuò)增)：

將無菌苗的頂芽(長度為0.5～1cm)切下，轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)；

所述增殖培養(yǎng)基為：

ms基本培養(yǎng)基+bap0.5～1mg/l+iaa或naa0.05～0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8～6.0；

增殖培養(yǎng)的條件為：光/暗交替培養(yǎng)；

當(dāng)頂芽長成≥2cm(一般為2～3cm)的幼苗、且每個(gè)芽的周圍有3～6個(gè)新芽出現(xiàn)時(shí)結(jié)束增殖培養(yǎng)，得叢生芽；

5)、將所得的叢生芽切割成單芽后，替代步驟4)中的無菌苗的頂芽重復(fù)進(jìn)行上述步驟4)；

或者，將叢生芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行步驟9)的生根培養(yǎng)；

6)、葉片愈傷組織的誘導(dǎo)：

將步驟3)所得的無菌苗的葉片，切去邊緣和頂端后切成0.5×0.5cm，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基ⅰ或愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基ⅱ上進(jìn)行誘導(dǎo)；

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基ⅰ為ms+2.4-d1mg/l+naa1mg/l+bap0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8-6.0；

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基ⅱ為ms+bap2mg/l+naa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8-6.0；

所述誘導(dǎo)條件為：黑暗培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)入光/暗交替培養(yǎng)，當(dāng)葉片邊緣顆粒狀的愈傷組織塊聚集在一起直至直徑達(dá)到1～1.5cm時(shí)，結(jié)束誘導(dǎo)培養(yǎng)；

備注說明：一般交替培養(yǎng)1-2周后，可以看到葉片的邊緣有黃綠色、顆粒狀的愈傷組織出現(xiàn)；

7)、愈傷組織的分化：

將步驟6)所得的愈傷組織(直徑1～1.5cm)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基ⅰ上，進(jìn)行不定芽的分化；

所述分化培養(yǎng)基為以下任意一種：

ms+kt1～2mg/l+iaa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8～6.0；

ms+bap0.5～2mg/l+iaa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8～6.0；

所述分化培養(yǎng)條件為：光/暗交替培養(yǎng)；當(dāng)每塊愈傷組織上分化形成5～9個(gè)、且長度≥2cm(一般為2～3cm)的幼苗時(shí)結(jié)束分化培養(yǎng)，形成了叢生的不定芽；

備注說明：經(jīng)過28～35天的培養(yǎng)，愈傷組織在分化培養(yǎng)基上形成了叢生的不定芽；

8)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生：

將步驟3)所得的無菌苗的葉片在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基ⅱ上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件同步驟6)；

將所得的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基ⅱ上進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化培養(yǎng)，體細(xì)胞胚胎發(fā)生的培養(yǎng)條件為光/暗交替培養(yǎng)；

分化培養(yǎng)基ⅱ為ms+bap0.5+naa0.1mg/l+ac0.8g/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂，ph5.8-6.0；

當(dāng)愈傷組織塊上出現(xiàn)向上形成芽且向下形成根的雙極性體細(xì)胞胚、且芽的高度達(dá)到3-4cm和根的長度≥5cm(一般為5-7cm)時(shí)，結(jié)束此步驟的培養(yǎng)轉(zhuǎn)入步驟10)；

或者，當(dāng)愈傷組織塊上出現(xiàn)只向上形成芽的單極性體細(xì)胞胚、且芽的高度達(dá)到2-3cm時(shí)，結(jié)束此步驟的培養(yǎng)轉(zhuǎn)入步驟9)；

即，本步驟8)直接形成了體細(xì)胞胚，并進(jìn)一步發(fā)育直接形成了芽和根，產(chǎn)生了適合煉苗移栽的植株；

9)、生根培養(yǎng)：

將步驟4)培養(yǎng)所得的幼苗(高度為2～3cm)、叢生芽，步驟7)愈傷組織上分化出的不定芽(叢生的不定芽)，步驟8)愈傷組織上分化出來的單極性體細(xì)胞胚(株高2～3cm、胚長成幼苗)中的至少一種轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；

生根培養(yǎng)的條件為首先在黑暗條件下培養(yǎng)3～5天，然后轉(zhuǎn)入光/暗交替培養(yǎng)；當(dāng)苗的基部產(chǎn)生4～6條根，長度≥5cm(一般約5～7cm)時(shí)結(jié)束生根培養(yǎng)；

所述生根培養(yǎng)基為以下任意一種：

1/2ms+iaa0.5～1mg/l+蔗糖15g/l+6.6g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8～6.0；

1/2ms+naa0.05～0.1mg/l+iba0.05～0.1mg/l+蔗糖15g/l+6.6g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8～6.0；

10)、移栽：

將步驟9)已生根的植株取出，栽培于河沙：泥炭土為1:1的混合基質(zhì)上；或者將步驟8)所得的雙極性體細(xì)胞胚進(jìn)行移栽。

作為本發(fā)明的單葉鐵線蓮的組培快速繁殖方法的改進(jìn)：

黑暗培養(yǎng)的溫度為23～25℃；

光/暗交替培養(yǎng)時(shí)：光照培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度為35～40μmol·m^-2·s^-1，時(shí)間為16小時(shí)，溫度為25～27℃；黑暗培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為8小時(shí)，溫度為23～25℃。

作為本發(fā)明的單葉鐵線蓮的組培快速繁殖方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

所述步驟5)中，將步驟4)所得的叢生芽在無菌條件下取出，用解剖刀分開成單芽，置于增殖培養(yǎng)基按照步驟4)所述條件進(jìn)行培養(yǎng)；當(dāng)每個(gè)單芽再生出3～6個(gè)新芽時(shí)結(jié)束增殖培養(yǎng)(培養(yǎng)時(shí)間約為28～35天)。

備注說明：此步驟中，是以上述單芽替代步驟4)中的無菌苗的頂芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)基，目的為了獲得更多的叢生芽。

作為本發(fā)明的單葉鐵線蓮的組培快速繁殖方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

所述步驟10)為：

將已生根的植株取出，栽培于河沙：泥炭土為1：1重量比的混合基質(zhì)上，將裝有生根幼苗的培養(yǎng)容器置于自然環(huán)境(自然溫度、光照的環(huán)境)下鍛煉5～7天，然后打開瓶蓋，在培養(yǎng)基表面澆水(少量水)，再放置1～2天后，將植株基部的瓊脂洗凈，將苗移栽到河沙：泥炭土為1：1的混合基質(zhì)培養(yǎng)20～35天，開始10～14天溫度為23～25℃，相對(duì)濕度為70～80％；

將步驟8)所得的雙極性體細(xì)胞胚進(jìn)行移栽時(shí)，將裝有雙極性體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器置于自然環(huán)境(自然溫度、光照的環(huán)境)下鍛煉5～7天，然后打開瓶蓋，在培養(yǎng)基表面澆水(少量水)，放置1～2天后，將根基部的瓊脂洗凈，將植株移栽到河沙：泥炭土為1：1的混合基質(zhì)培養(yǎng)20～35天，開始10～14天溫度為23～25℃，相對(duì)濕度為70～80％。

作為本發(fā)明的單葉鐵線蓮的組培快速繁殖方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

所述步驟2)中的消毒為：將步驟1)所得的種子依次進(jìn)行蒸餾水浸泡、酒精浸泡、無菌水沖洗、次氯酸鈉滅菌、無菌水沖洗，得消毒后種子。

具體為：種子用蒸餾水浸泡10～15分鐘，放到超凈臺(tái)上，先用70％(體積％)酒精浸泡處理20～30秒，無菌水沖洗后，再用含1％有效氯的次氯酸鈉滅菌6～8分鐘，無菌水沖洗干凈后，得消毒后種子(備用)。

在本發(fā)明的方案中：一種方式是通過種子無菌苗頂芽的快速擴(kuò)增來實(shí)現(xiàn)；另一種繁殖方式是通過種子無菌苗的葉片誘導(dǎo)愈傷組織，然后誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)行不定芽的分化或體細(xì)胞胚胎分化來進(jìn)行快繁。包括種子的消毒，種子休眠的打破，種子萌發(fā)，頂芽的切割與增殖，葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，葉片愈傷組織的增殖，愈傷組織不定芽的分化，愈傷組織體細(xì)胞胚胎發(fā)生，生根培養(yǎng)及試管苗的移栽。

在本發(fā)明中，抽濾滅菌是指液體過0.22μm的無菌濾膜，從而實(shí)現(xiàn)滅菌；在步驟9)中，首先在黑暗條件下培養(yǎng)3～5天，隨后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)7～10天可誘導(dǎo)形成根，再培養(yǎng)14～21天形成發(fā)達(dá)的根系。

在本發(fā)明中，種子培養(yǎng)基為ms+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂，ph5.8～6.0。該種子培養(yǎng)基的制備方法為：以ms基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入蔗糖、瓊脂，均勻混合，利用1mol/l的koh或1mol/l的hcl調(diào)節(jié)ph為5.8～6.0；每1l的ms基本培養(yǎng)基加入30g蔗糖，6.2g瓊脂。

其余培養(yǎng)基，按照其特定的配方，按照上述類似方式制備而得。

本發(fā)明中利用種子萌發(fā)的無菌苗的頂芽切割后進(jìn)行快速擴(kuò)增，以及應(yīng)用頂芽擴(kuò)增出的不定芽再進(jìn)行離體快速繁殖，此過程是芽生芽的途徑不經(jīng)過愈傷組織階段，能保持試管苗的遺傳穩(wěn)定性。

本發(fā)明中葉片經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)、在分化培養(yǎng)時(shí)，能直接從愈傷組織上產(chǎn)生體細(xì)胞胚，產(chǎn)生的體細(xì)胞胚具有二極性(向上形成芽，向下形成根)，直接成苗。此操作減少了培養(yǎng)步驟，省時(shí)、省力(常規(guī)的培養(yǎng)是愈傷組織先分化芽，然后再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)分化根)。

本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢：

(1)單葉鐵線蓮的生產(chǎn)可以在人為控制條件下進(jìn)行，不受季節(jié)、氣候條件與土壤等因素的制約。

(2)增殖速度快(頂芽的增殖系數(shù)平均為5)，生產(chǎn)周期短(全程僅需63～73天)，設(shè)備簡單，占地面積少，能節(jié)省人力、物力等，便于工廠化生產(chǎn)。

(3)該技術(shù)方法解決了單葉鐵線蓮快速繁殖和穩(wěn)定生根的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，達(dá)到技術(shù)穩(wěn)定，繁殖系數(shù)高的要求，可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的目的。

(4)使用本發(fā)明提供的組培快繁技術(shù)得到的單葉鐵線蓮幼苗進(jìn)行人工栽培，可以得到個(gè)體差異小，品質(zhì)均一的單葉鐵線蓮塊根成品，可以為臨床應(yīng)用提供品質(zhì)穩(wěn)定的原材料。

(5)可以保存單葉鐵線蓮的種質(zhì)資源，同時(shí)有利于保護(hù)野生資源，減少對(duì)自然資源的破壞。

綜上所述，本發(fā)明通過大量試驗(yàn)，摸索出一套成熟的方法，成功實(shí)現(xiàn)了單葉鐵線蓮的組培快繁，可以快速培育出大量幼苗，為中藥材gap種植提供一種切實(shí)可行的開發(fā)項(xiàng)目。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1為單葉鐵線蓮?fù)庵搀w及萌發(fā)的種子的示意圖；

圖1中，a：采集的莖段；b：采集的種子；c：體視鏡下種子的形態(tài)，顯示果皮上的短絨毛及細(xì)長的花柱；d：bap20mg/l處理后萌發(fā)的種子；e：ga3100mg/l處理后萌發(fā)的種子。

圖2為單葉鐵線蓮頂芽的快速繁殖、無菌苗的生根以及葉片愈傷組織的誘導(dǎo)、芽的分化、體細(xì)胞胚的分化的示意圖；

圖2中，

a：頂芽在ms+bap0.5mg/l+iaa0.05mg/l培養(yǎng)基上生長4星期后增殖的苗；

b：無菌苗在1/2ms+iaa1.0mg/l的培養(yǎng)基上生長5周后的生根植株；

c：葉片在ms+bap2mg/l+naa0.1mg/l培養(yǎng)基上生長4星期后的愈傷組織；

d：培養(yǎng)6星期后葉片愈傷組織在ms+kt2mg/l+iaa0.1mg/l培養(yǎng)上分化出不定芽；

e：葉片愈傷組織在ms+bap0.5mg/l+naa0.1mg/l的培養(yǎng)基上產(chǎn)生的雙極性體細(xì)胞胚(形成芽和根)；

f：為單極性體細(xì)胞胚(僅形成芽)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

以下案例中，黑暗培養(yǎng)(24小時(shí)全部黑暗培養(yǎng))的溫度為23～25℃；光/暗交替培養(yǎng)時(shí)：光照培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度為35～40μmol·m^-2·s^-1，時(shí)間為16小時(shí)，溫度為25～27℃；黑暗培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為8小時(shí)，溫度為23～25℃。

實(shí)施例1、一種單葉鐵線蓮的組培快繁法，依次進(jìn)行以下步驟：

1)、種子外植體的選?。?/p>

選擇單葉鐵線蓮的瘦果，放在水中，漂浮去除癟粒后，然后在體視顯微鏡下剝?nèi)ス?果皮上布滿絨毛，容易造成滅菌不徹底而污染)，得種子。

2)、種子消毒：

將種子置于蒸餾水中浸泡10～15分鐘后，放到超凈臺(tái)上，先用70％(體積％)酒精浸泡處理20～30秒，無菌水沖洗后，再用1％有效氯的次氯酸鈉溶液(每100ml溶液內(nèi)加2～3滴洗潔精)滅菌處理6～8分鐘，無菌水沖洗3～5次后，得消毒后種子；備用。

3)、種子休眠的破除(種子萌發(fā))：

將步驟2)所得的種子轉(zhuǎn)移到抽濾滅菌的20mg/lbap溶液或100mg/lga3溶液浸泡24小時(shí)，無菌水沖洗后接種于在種子培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)，黑暗狀態(tài)下培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)入光/暗交替培養(yǎng)7天，此時(shí)，種子的真葉抽出，頂芽長至0.5～1cm，所得稱為無菌苗；即，該無菌苗的頂芽長0.5～1cm；

上述抽濾滅菌是指液體過0.22μm的無菌濾膜，從而實(shí)現(xiàn)滅菌；

種子培養(yǎng)基為ms+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂，ph5.8～6.0；

備注說明：上述ga3處理的萌發(fā)率為36.3％，bap處理的萌發(fā)率為33.3％。

4)、頂芽的增殖培養(yǎng)：

切取步驟3)所得無菌苗的頂芽放置在增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)；

增殖培養(yǎng)基為ms+bap0.5～1mg/l+iaa(或者naa)0.05～0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8～6.0；

增殖培養(yǎng)的條件為光/暗交替培養(yǎng)；當(dāng)頂芽長成2～3cm的幼苗、且每個(gè)芽的周圍有3～6個(gè)新芽出現(xiàn)時(shí)結(jié)束增殖培養(yǎng)(約28～35天)；得叢生芽。

5)、所得的叢生芽切割成單芽后，替代步驟4)中的無菌苗的頂芽(長度為0.5-1cm)重復(fù)進(jìn)行上述步驟4)；

或者，該叢生芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行步驟9)的生根培養(yǎng)。

6)、葉片愈傷組織的誘導(dǎo)：

將種子萌發(fā)的真葉(即，步驟3)所得的無菌苗的葉片)先切去邊緣和頂端，然后切塊(0.5×0.5cm)置于愈傷組織培養(yǎng)基ⅰ或ⅱ上進(jìn)行誘導(dǎo)：

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基ⅰ為ms+2.4-d1mg/l+naa1mg/l+bap0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8-6.0；

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基ⅱ為ms+bap2mg/l+naa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8-6.0；

所述誘導(dǎo)條件為：暗中培養(yǎng)2周后(24小時(shí)黑暗培養(yǎng))轉(zhuǎn)入光/暗交替培養(yǎng)；當(dāng)葉片邊緣顆粒狀的愈傷組織塊聚集在一起，直徑達(dá)到1～1.5cm的結(jié)束愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)；

備注說明：交替培養(yǎng)1-2周后，可以看到葉片的邊緣有黃綠色、顆粒狀的愈傷組織出現(xiàn)。

7)、愈傷組織的分化：

將步驟6)所得的愈傷組織(顆粒狀、致密的愈傷組織，直徑1～1.5cm)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽的分化；

所述分化培養(yǎng)基為以下任意一種：

ms+kt1～2mg/l+iaa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8～6.0；

ms+bap0.5～2mg/l+iaa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8～6.0；

所述分化培養(yǎng)條件為光/暗交替培養(yǎng)，當(dāng)每塊愈傷組織上分化形成5～9個(gè)長2～3cm的幼苗時(shí)結(jié)束分化培養(yǎng)；形成了叢生的不定芽；

備注說明：經(jīng)過28～35天的培養(yǎng)，愈傷組織在分化培養(yǎng)基上形成了叢生的不定芽；

8)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生：

將步驟3)所得的無菌苗的葉片在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基ⅱ上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件同步驟6)；

將所得的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基ⅱ上進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化培養(yǎng)，體細(xì)胞胚胎發(fā)生的培養(yǎng)條件為光/暗交替培養(yǎng)；

分化培養(yǎng)基ⅱ為ms+bap0.5+naa0.1mg/l+ac0.8g/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂，ph5.8～6.0；

當(dāng)愈傷組織塊上出現(xiàn)向上形成芽且向下形成根的雙極性體細(xì)胞胚時(shí)，且芽的高度達(dá)到3～4cm且根的長度達(dá)到5～7cm時(shí)，結(jié)束此步驟的培養(yǎng)轉(zhuǎn)入步驟10)；

當(dāng)愈傷組織塊上出現(xiàn)只向上形成芽的單極性體細(xì)胞胚時(shí)，當(dāng)芽的高度達(dá)到2～3cm時(shí)，結(jié)束此步驟的培養(yǎng)轉(zhuǎn)入步驟9)；

即，本步驟8)直接形成了體細(xì)胞胚，并進(jìn)一步發(fā)育直接形成了芽和根，產(chǎn)生了適合煉苗移栽的植株。

9)、生根培養(yǎng)：

將步驟4)培養(yǎng)所得的高度為2～3cm幼苗及叢生芽、步驟7)愈傷組織上分化出高度為2～3cm的不定芽或者步驟8)愈傷組織上分化出來的單極性體細(xì)胞胚(株高2～3cm)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；生根培養(yǎng)的條件為首先在黑暗條件下培養(yǎng)3～5天(24小時(shí)黑暗培養(yǎng))，然后轉(zhuǎn)入光/暗交替培養(yǎng)。當(dāng)苗的基部產(chǎn)生4～6條根，長度約5～7cm時(shí)結(jié)束生根培養(yǎng)；

所述生根培養(yǎng)基為以下任意一種：

1/2ms+iaa0.5～1mg/l+蔗糖15g/l+6.6g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8～6.0；

1/2ms+naa0.05～0.1mg/l+iba0.05～0.1mg/l+蔗糖15g/l+6.6g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8-6.0；

一般而言，7～10天后可以看到有根原基形成，再培養(yǎng)14～21天完成生根。

10)、移栽：

將步驟9)所得已生根的植株取出，栽培于河沙：泥炭土為1：1重量比的混合基質(zhì)上，將裝有生根幼苗的培養(yǎng)容器置于自然溫度、光照的環(huán)境下鍛煉5～7天，然后打開瓶蓋，在培養(yǎng)基表面澆少量水，再放置1～2天后取出，將植株基部的瓊脂洗凈，將苗移栽到河沙：泥炭土為1：1的混合基質(zhì)培養(yǎng)20～35天，開始10～14天保持環(huán)境溫度為23～25℃，相對(duì)濕度為70～80％；隨后即可逐漸過渡到自然的環(huán)境條件。

將步驟8)所得的雙極性體細(xì)胞胚進(jìn)行移栽時(shí)，將裝有雙極性體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器置于自然溫度、光照的環(huán)境下鍛煉5～7天，然后打開瓶蓋，在培養(yǎng)基表面澆少量水，放置1～2天后取出，將根基部的瓊脂洗凈，將植株移栽到河沙：泥炭土為1：1的混合基質(zhì)培養(yǎng)20～35天，開始10～14天保持環(huán)境溫度為23～25℃，相對(duì)濕度為70～80％；隨后即可逐漸過渡到自然的環(huán)境條件。

上述煉苗(約一個(gè)月)后移栽到大田，平均存活率達(dá)到87.3％。

使用本發(fā)明將單葉鐵線蓮的種子萌發(fā)后，利用頂芽28～35天可誘導(dǎo)形成叢生芽，在此基礎(chǔ)上繼代培養(yǎng)，叢生芽可大量繁殖，大約每30天繼代一次，平均增殖倍數(shù)為5。把繼代后的叢生芽轉(zhuǎn)移到本發(fā)明提供的生根培養(yǎng)基中21～28天可大量發(fā)根，出根率在85％左右，培養(yǎng)30～45天可出瓶煉苗。采用本發(fā)明提供的葉片愈傷組織誘導(dǎo)、芽分化以及體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，為通過基因工程改良該植物，為提高該植物次生代謝產(chǎn)物的含量提供了基礎(chǔ)。

采用上述措施的本發(fā)明，掌握了單葉鐵線蓮組織培養(yǎng)中叢生芽的誘導(dǎo)和生根等關(guān)鍵階段的技術(shù)，成功解決了單葉鐵線蓮組培中增殖率低、成活率低等困難，使單葉鐵線蓮這一珍稀藥用植物實(shí)現(xiàn)快速育苗、工廠化栽培成為可能。使用本發(fā)明同時(shí)可以有效地保護(hù)這一珍稀野生植物資源、減少私挖濫采、形成可持續(xù)利用和合理開發(fā)相互協(xié)調(diào)的良性循環(huán)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在：提供了單葉鐵線蓮的組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)，摸索出了快速繁殖及其穩(wěn)定生根等重要環(huán)節(jié)的關(guān)鍵性技術(shù)，一個(gè)外植體一年就可克隆繁殖出數(shù)萬株后代，為該藥用植物的商品化生產(chǎn)提供了一套切實(shí)可行的生產(chǎn)技術(shù)路線，可以應(yīng)用于單葉鐵線蓮的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

按照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)1、取采自天目山的單葉鐵線蓮的瘦果；

步驟3)：將種子轉(zhuǎn)移到抽濾滅菌的100mg/lga3的無菌玻璃瓶中浸泡處理；

步驟4)中的增殖培養(yǎng)基為ms+bap0.5mg/l+iaa0.05mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp，ph5.8～6.0；生長4周，增殖倍數(shù)為5，平均苗高為2.58厘米。

將頂芽基部發(fā)出的不定芽用解剖刀分開，分別置于裝有上述相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，4周后，各培養(yǎng)容器內(nèi)的芽可再生出數(shù)個(gè)新芽。再將每個(gè)芽分開，轉(zhuǎn)接于ms+bap0.5mg/l+iaa0.05mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+pvp0.8g/l上培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，以達(dá)到快速增殖的目的，其中加入抗氧化劑pvp0.8g/l防止褐化。

將高度達(dá)到2～3cm的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2ms+iaa1.0mg/l+蔗糖15g/l+6.6g/l瓊脂+pvp0.8g/l，ph5.8～6.0的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。21～28天可生根。

一個(gè)月后移栽到大田中，可達(dá)到90％的存活率。

實(shí)驗(yàn)2、取采自天目山的單葉鐵線蓮的瘦果，

步驟3)：將種子轉(zhuǎn)移到抽濾滅菌的20mg/lbap的無菌玻璃瓶中浸泡處理；

將培養(yǎng)2周的無菌苗的葉片，切成0.5×0.5cm的切塊，接種到ms+2.4-d1mg/l+naa1mg/l+bap0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+pvp0.8g/l的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。在此培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到88.9％，愈傷組織呈現(xiàn)黃綠色，致密的顆粒狀。將生長4周的愈傷組織一部分轉(zhuǎn)移到同樣的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖，另一部分愈傷組織轉(zhuǎn)移到ms+kt2mg/l+iaa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+0.8g/lpvp的培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的分化。愈傷組織不定芽的分化率為52.4％，每塊愈傷組織上的不定芽的數(shù)量平均有8.7個(gè)。生長6周后不定芽的平均高度為2.6厘米。將高度達(dá)到2～3cm的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2ms+iaa1.0mg/l+蔗糖15g/l+6.6g/l瓊脂+pvp0.8g/l培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。21～28天可生根。

一個(gè)月后移栽到大田中，可達(dá)到82％的存活率。

實(shí)驗(yàn)3、采自天目山的單葉鐵線蓮的瘦果；

步驟3)：將種子轉(zhuǎn)移到抽濾滅菌的20mg/lbap的無菌玻璃瓶中浸泡處理

將培養(yǎng)2周的無菌苗的葉片，切成0.5×0.5cm的切塊，接種到ms+bap2mg/l+naa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂+pvp0.8g/l的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。在此培養(yǎng)基上的愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到50％，愈傷組織呈現(xiàn)黃綠色，致密的顆粒狀。將生長4周的愈傷組織一部分轉(zhuǎn)移到同樣的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖，另一部分愈傷組織轉(zhuǎn)移到ms+bap0.5mg/l+naa0.1mg/l+ac0.8g/l+30g/l蔗糖+6.2g/l瓊脂的培養(yǎng)基上進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生。經(jīng)過4周的培養(yǎng)，在愈傷組織上出現(xiàn)了體細(xì)胞胚，體細(xì)胞胚的分化率為80％，其中雙極性的體細(xì)胞胚占45％，單極性的體細(xì)胞胚占55％。雙極性的體細(xì)胞胚向上產(chǎn)生芽，向下產(chǎn)生根，形成完整植株。單極性體細(xì)胞胚向上產(chǎn)生芽，未向下產(chǎn)生根。需要將此植株轉(zhuǎn)移到1/2ms+naa0.1mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖15g/l+6.6g/l瓊脂+pvp0.8g/l培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。21～28天可生根。

一個(gè)月后移栽到大田中，可達(dá)到88％的存活率。

對(duì)比例1-1、將實(shí)驗(yàn)1中的增殖培養(yǎng)基中的iaa0.05mg/l換成naa0.05mg/l，其余等同于實(shí)驗(yàn)1。最終所得的結(jié)果為：

增殖倍數(shù)為3.33，移栽成活率為82.5％。

對(duì)比例1-2、將實(shí)驗(yàn)1中的光照培養(yǎng)時(shí)間由16小時(shí)改為24小時(shí)，其余參數(shù)不變，最終所得的結(jié)果為頂芽的增殖倍數(shù)為2.8，部分植株出現(xiàn)白化，移栽成活率為72％。

對(duì)比例1-3、將實(shí)驗(yàn)1中的生根培養(yǎng)基iaa的濃度由1.0mg/l改為0.5mg/l，其余等同于實(shí)驗(yàn)1。最終所得的結(jié)果為：

增殖倍數(shù)為3.0，移栽成活率為84％。

對(duì)比例2-1、將實(shí)驗(yàn)2中愈傷組織分化的培養(yǎng)基中kt的濃度由2mg/l改為1mg/l，其余等同于實(shí)驗(yàn)2。最終所得的結(jié)果為：愈傷組織上不定芽的分化率為33.3％；每塊愈傷組織上的不定芽的數(shù)量平均有6.5個(gè)，不定芽的平均高度為2.87厘米。

對(duì)比例2-2、將實(shí)驗(yàn)2中愈傷組織培養(yǎng)的條件由兩周黑暗培養(yǎng)，然后再置于光/暗交替培養(yǎng)(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)，改為愈傷組織全部放置在光/暗交替培養(yǎng)(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)，其余參數(shù)不變。最終所得的結(jié)果為：愈傷組織上不定芽的分化率為38％；每塊愈傷組織上的不定芽的數(shù)量平均有5.8個(gè)，不定芽的平均高度為2.04厘米。

對(duì)比例2-3、將實(shí)驗(yàn)2中愈傷組織分化的培養(yǎng)基中2mg/lkt改為bap2mg/l，其余等同于實(shí)驗(yàn)2。最終所得的結(jié)果為：愈傷組織上不定芽的分化率為24.3％；生長6周后，不定芽的平均高度為2.45厘米，每塊愈傷組織上的不定芽的數(shù)量平均有5.4個(gè)。

對(duì)比例3-1、將實(shí)驗(yàn)3中，將愈傷組織分化培養(yǎng)基中ac0.8g/l改為pvp0.8g/l，其余等同于實(shí)驗(yàn)3，結(jié)果體細(xì)胞胚的分化率為62.3％，其中雙極性的體細(xì)胞胚占25％，單極性的體細(xì)胞胚占75％。

對(duì)比例3-2、將實(shí)驗(yàn)3中愈傷組織分化的培養(yǎng)基中bap的濃度由0.5mg/l改為1.0mg/l，其余等同于實(shí)驗(yàn)3，結(jié)果體細(xì)胞胚的分化率為71.5％，其中雙極性的體細(xì)胞胚占12.5％，單極性的體細(xì)胞胚占87.5％。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。