本發(fā)明屬于植物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種枳的組織培養(yǎng)再生苗的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf)是蕓香科柑橘亞科枳屬(Poncirus Raf.)的一種植物，為小喬木；樹冠傘形或圓頭形，枝有刺，花單朵或成對腋生，果近圓球形或梨形，為溫帶樹種，喜光，稍耐蔭，喜溫暖濕潤氣候，耐寒力較強，耐熱；對土壤不要求不嚴，多以此作柑橘類砧木，同時具有較高的藥用價值和觀賞價值，中國各地均有栽培。

枳雖然在中國各地均有栽培，但隨著柑橘類的果樹栽培面積越來越廣，枳作為一種抗逆性較強，生長旺的砧木，需求量也越來越大，同時，對枳砧木的要求也越來越高。若沿用傳統(tǒng)的分株繁殖方法，繁殖系數(shù)低，增殖速度慢，遠遠不能滿足人們的需要；若用種子播種，存在變異變化大，難以保存親本的優(yōu)良性狀等缺點；同時自然環(huán)境復雜，傳統(tǒng)繁殖方法培育的砧木存在細菌、真菌及病毒的侵害，還會對嫁接的柑橘接穗造成一定的影響。因此，通過組織培養(yǎng)建立無毒再生苗的培育體系成為當前的一種趨勢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對枳的繁殖系數(shù)低、增殖速度慢及易受到細菌、真菌、病毒侵害的問題，提供了一種枳的組織培養(yǎng)再生苗的培養(yǎng)方法，建立枳的高效再生體系，可實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化規(guī)?；a(chǎn)及實驗室脫毒再生苗的培養(yǎng)體系。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種枳的組織培養(yǎng)再生苗的培養(yǎng)方法，選取枳的莖段作為組培用的外植體；對莖段進行愈傷組織誘導；成功誘導后通過切割愈傷組織進行進一步繼代培養(yǎng)、增大并逐漸分化形成不定芽；再通過光下誘導不定芽再分化形成莖和葉；最后，經(jīng)生根培養(yǎng)形成不定根后進行馴化移栽，然后正常培養(yǎng)。

進一步地，包括以下步驟：

步驟1、外植體的選擇及處理：選取枳的莖段為起始材料，消毒后作為組培用的外植體；

步驟2、愈傷組織的誘導培養(yǎng)：將經(jīng)過消毒的外植體接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+6-BA1.0-2.0mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+GA₃0.25-0.5mg/L上進行暗培養(yǎng)，莖段切口處逐漸形成愈傷組織。

步驟3、愈傷組織的增殖培養(yǎng)：

形成的愈傷組織經(jīng)切割后轉(zhuǎn)接到愈傷組織增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0.5-1.0mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+GA₃0.25-0.5mg/L上進行暗培養(yǎng)，愈傷組織較為迅速的生長膨大；

步驟4、愈傷組織的分化及再分化培養(yǎng)：

將增殖后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)，通過光誘導，迅速分化形成不定芽，而后緩慢分化為莖和葉；

步驟5、生根成苗及馴化移栽：

將再分化形成的莖和葉轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.25-0.5mg/L上進行培養(yǎng)，20～30天后，長出1-2條肉質(zhì)不定根，生根成苗成為新的植株，煉苗、緩苗后正常培養(yǎng)。

進一步地，愈傷組織的誘導及增殖的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度23-27℃，避光進行暗培養(yǎng)；愈傷組織分化及再分化培養(yǎng)、再生苗的生根培養(yǎng)條件均為23-27℃，光照時間為10～12h/d，光照強度為2500-3000lux。

進一步地，愈傷組織誘導培養(yǎng)基、愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基及再生苗的生根培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為20～40g/L，凝固劑為瓊脂粉、用量為6～7g/L，培養(yǎng)基pH為5.7-5.9。

進一步地，煉苗、緩苗具體為：先在組培室打開瓶蓋煉苗3天，然后將其移至溫室或蔭棚，再煉苗3天；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其表面的瓊脂，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中進行緩苗，然后正常培養(yǎng)。

進一步地，培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石與珍珠鹽。

進一步地，培養(yǎng)基質(zhì)含水量25％以內(nèi)，空氣相對濕度60～80％，遮光50％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明通過選取枳的莖段作為組培用的外植體；對莖段進行愈傷組織誘導培養(yǎng)形成愈傷組織；愈傷組織可通過特定培養(yǎng)基進行有效增殖，并逐漸分化形成不定芽；不定芽可繼續(xù)分化形成莖和葉；再通過生根培養(yǎng)形成不定根后進行馴化移栽，然后正常培養(yǎng)，解決了枳的繁殖系數(shù)低、增殖速度慢及易受細菌、真菌和病毒侵害的問題，建立了枳的高效再生體系；

2)通過莖段組織培養(yǎng)進行枳的愈傷組織誘導，不受地區(qū)、季節(jié)、氣候限制，可實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)再生苗的工廠化規(guī)模化生產(chǎn)及實驗室脫毒再生苗的培養(yǎng)體系，而且遺傳性狀相對穩(wěn)定一致；

3)為完善枳的遺傳轉(zhuǎn)化體系，建立分子育種的平臺，從分子水平對其進行遺傳改良，深入研究開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

當然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明枳的組織培養(yǎng)再生苗過程對比圖；圖中，A為枳莖段誘導的愈傷組織，B為愈傷組織的增殖培養(yǎng)，C為愈傷組織進行分化形成不定芽，D為愈傷組織開始再分化形成莖和葉，E為枳經(jīng)愈傷組織形成的未生根的再生苗，F(xiàn)為生根培養(yǎng)后的完整的枳再生苗；

圖2是本發(fā)明愈傷組織切割增殖效率。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。

本發(fā)明公開了一種枳的組織培養(yǎng)再生苗的培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟：

步驟1、外植體的選擇及處理：

選取枳的莖段為起始材料，消毒后作為組培用的外植體；

具體地，所述消毒具體為：材料去葉后用多菌靈1000倍液處理30min-50min，清水洗凈后流水沖洗2小時后備用；在超凈工作臺上剪成小段后轉(zhuǎn)移到無菌燒杯中；用體積分數(shù)為75％的乙醇滅菌30s，期間不斷晃動燒杯，然后用無菌水(ddH₂O)清洗2-3次，再用質(zhì)量分數(shù)為0.1％的HgCl₂浸泡8-10min,無菌水清洗2-3次。

步驟2、愈傷組織的誘導培養(yǎng)：

在超凈工作臺上，將經(jīng)過表面消毒的外植體轉(zhuǎn)移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，用消過毒的鑷子將材料橫向接種于培養(yǎng)基中，并輕壓，保證材料嵌入培養(yǎng)基中；愈傷組織誘導的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0-2.0mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+GA₃0.25-0.5mg/L，接種后20-30d形成明顯的愈傷組織；誘導出的愈傷組織切割后如圖1(A)所示；

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度25±2℃，暗培養(yǎng)。

愈傷組織(callus)原指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的組織。是由植物創(chuàng)口的細胞脫分化形成的薄壁細胞，在一定條件下可進一步誘導器官再生或胚狀體而形成植株。

步驟3、愈傷組織的增殖培養(yǎng)：

將步驟2形成的愈傷組織經(jīng)切割后轉(zhuǎn)接到愈傷組織增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0.5-1.0mg/L+IBA0.1-0.2mg/L+GA₃0.25-0.5mg/L上進行暗培養(yǎng)，愈傷組織較為迅速的生長膨大，如圖1(B)所示。

切除莖段兩側(cè)切口處的愈傷組織，接到繼代培養(yǎng)基上；愈傷組織在上述愈傷組織增殖培養(yǎng)基中各組分濃度范圍內(nèi)均能正常生長。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度25±2℃，暗培養(yǎng)。

步驟4、愈傷組織的分化及再分化：

將增殖后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)，通過光誘導，迅速分化形成不定芽，如圖1(C)所示；而后緩慢分化為莖和葉，如圖1(D)所示。

培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25±2℃，光照時間為10～12h/d，光照強度為2500-3000lux。

步驟5、生根成苗及馴化移栽

將再分化形成的莖和葉轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.25-0.5mg/L上進行培養(yǎng)，如圖1(E)所示；20～30天后，長出1-2條肉質(zhì)不定根，生根成苗成為新的植株，如圖1(F)所示；煉苗、緩苗后正常培養(yǎng)。

其中，愈傷組織誘導培養(yǎng)、愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)及再生苗的生根培養(yǎng)，所用的基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為20～40g/L，凝固劑為瓊脂粉、用量為6～7g/L，培養(yǎng)基pH為5.8±0.1；其中，所添加的植物激素為6-BA：芐氨基嘌呤、IBA：吲哚丁酸、GA3：赤霉素。

進一步地，所述煉苗、緩苗具體為：先在組培室打開瓶蓋煉苗3天，然后將其移至溫室或蔭棚，再煉苗3天；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其表面的瓊脂，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中進行緩苗，然后正常培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石與珍珠鹽；所述培養(yǎng)基質(zhì)含水量25％以內(nèi)，空氣相對濕度60～80％，遮光50％。

本發(fā)明利用枳的莖段在一定濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑誘導下產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織又能進行增殖培養(yǎng)；又因增殖培養(yǎng)后的愈傷組織能經(jīng)過光誘導和生根培養(yǎng)形成完整的再生苗；期間，能通過切割愈傷組織使之能以幾何倍數(shù)進行增殖生長，還可通過有無光誘導來調(diào)控是否進行分化與再分化，從而可實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)模化生產(chǎn)，而且遺傳性狀相對穩(wěn)定一致。

其中，IBA是植物主根生長促進劑，常用于木本和草本植物的浸根移栽，硬枝桿插，能加速根的生長，提高植物生根的百分率，也可用于植物種子的浸種和拌種，可提高發(fā)芽率和成活率。6-BA的主要作用是促進芽的形成,也可以誘導愈傷組織發(fā)生。GA₃為植物生長調(diào)節(jié)劑，主要用于促進作物的生長發(fā)育，提早成熟，提高產(chǎn)量和打破種子、塊莖、鱗莖等器官的休眠，促進發(fā)芽等。在前期愈傷組織的誘導和培養(yǎng)中，6-BA能有效的促進愈傷組織的發(fā)生及增殖，而赤霉素能促進愈傷組織的增殖生長。IBA可提高植物的發(fā)芽率和成活率，同時在生根培養(yǎng)中，能十分有效的加速根的形成與生長。

其中，6-BA的取值范圍為1.0-2.0mg/L、IBA的取值范圍為0.1-0.2mg/L、GA₃的取值范圍為0.25-0.5mg/L；光照時長為10-12h/d，光照強度為2500-3000lux。6-BA在1.0mg/L的條件下能成功誘導愈傷組織，但誘導率不高，在2.0mg/L的時候誘導率最高，如再繼續(xù)添加，反而會抑制愈傷組織的發(fā)生；IBA同理，在0.1mg/L的時候能有效促進愈傷組織生長分化及生根，0.2mg/L的時候為最適濃度，但如果超過0.2mg/L，則會出現(xiàn)抑制效果。GA₃的濃度0.25mg/L時，對芽的分化及再分化有促進作用，但不明顯，當達到0.5mg/L的時候，效果最佳，但如果繼續(xù)增加濃度，則會大幅度抑制芽的分化及再分化。光照時長和光照強度為協(xié)同作用，當光照時長為10h/d時，光照強度為2500lux時，愈傷組織能進行正常的分化和再分化，但增殖系數(shù)不高，且在生根培養(yǎng)條件下，葉片會出現(xiàn)不同程度的營養(yǎng)不良，表現(xiàn)為黃化，但不影響生根及煉苗移栽的成活率。光照時長為12h/d時，光照強度為3000lux為最佳條件。如果繼續(xù)增加其光照時長或光照強度，在愈傷組織分化和再分化中則會出現(xiàn)愈傷組織快速老化的現(xiàn)象，表現(xiàn)為愈傷組織表面變成淡黃色至深黃色，愈傷組織表現(xiàn)為疏散，且與正常愈傷組織比較為干燥，同時，老化的愈傷組織不能有效的進行分化和再分化，即使分化成不定芽，也會在再分化過程中停止再分化，變黃后衰亡。

實施例1

一種枳的組織培養(yǎng)再生苗的培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟：

步驟1、外植體的選擇及處理：

選取枳的莖段為起始材料，消毒后作為組培用的外植體；消毒具體為：材料去葉后用多菌靈1000倍液處理30min，清水洗凈后流水沖洗2小時后備用；在超凈工作臺上剪成小段后轉(zhuǎn)移到無菌燒杯中；用75％乙醇滅菌30s，期間不斷晃動燒杯，然后用無菌水(ddH₂O)清洗2-3次，再用0.1％HgCl₂浸泡8-10min,無菌水清洗2-3次。

步驟2、愈傷組織的誘導培養(yǎng)：

在超凈工作臺上，將經(jīng)過表面消毒的外植體轉(zhuǎn)移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，用消過毒的鑷子將材料橫向接種于培養(yǎng)基中，并輕壓，保證材料嵌入愈傷組織誘導培養(yǎng)基中；接種后20-30d形成明顯的愈傷組織；誘導出的愈傷組織切割后如圖1(A)所示；

枳莖段愈傷組織誘導：采用愈傷組織誘導培養(yǎng)基，愈傷組織誘導培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含大量元素)，瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L，培養(yǎng)基pH為5.8；培養(yǎng)溫度25℃，暗培養(yǎng)；其中，愈傷組織誘導培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度如表1所示：

表1愈傷組織誘導培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度

愈傷組織誘導成功率為100％，莖段兩側(cè)切口均能長出愈傷組織。

步驟3、愈傷組織的增殖培養(yǎng)：

將步驟2形成的愈傷組織經(jīng)切割后轉(zhuǎn)接到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)，愈傷組織較為迅速的生長膨大，如圖1(B)所示。

枳莖段愈傷組織增殖培養(yǎng)條件：采用愈傷組織增殖培養(yǎng)基，愈傷組織增殖培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含大量元素)，瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L，培養(yǎng)基pH為5.8；培養(yǎng)溫度25℃，暗培養(yǎng)；愈傷組織增殖培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度如表2所示：

表2愈傷組織增殖培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度

步驟4、愈傷組織的分化及再分化：

將增殖后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)，通過光誘導，迅速分化形成不定芽，如圖1(C)所示；而后緩慢分化為莖和葉，如圖1(D)所示。

培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為12h/d，光照強度為3000lux。在上述濃度下，光下培養(yǎng)，再分化率為80％；已分化出不定芽。未分化的主要原因為愈傷組織的老化。

步驟5、生根成苗及馴化移栽

將再分化形成的莖和葉轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，如圖1(E)所示；20～30天后，長出1-2條肉質(zhì)不定根，生根成苗成為新的植株，如圖1(F)所示；煉苗、緩苗后正常培養(yǎng)。

生根培養(yǎng)條件：采用生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含大量元素)，瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L，培養(yǎng)基pH為5.8；培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為12h/d，光照強度為3000lux。生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度如表3所示：

表3生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度

煉苗、緩苗具體為：先在組培室打開瓶蓋煉苗3天，然后將其移至溫室或蔭棚，再煉苗3天；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其表面的瓊脂，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中進行緩苗，然后正常培養(yǎng)。培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石與珍珠鹽；所述培養(yǎng)基質(zhì)含水量25％以內(nèi)，空氣相對濕度60～80％，遮光50％。

實施例2

一種枳的組織培養(yǎng)再生苗的培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟：

步驟1、外植體的選擇及處理：

選取枳的莖段為起始材料，消毒后作為組培用的外植體；消毒具體為：材料去葉后用多菌靈1000倍液處理30min，清水洗凈后流水沖洗2小時后備用；在超凈工作臺上剪成小段后轉(zhuǎn)移到無菌燒杯中；用75％乙醇滅菌30s，期間不斷晃動燒杯，然后用無菌水(ddH₂O)清洗2-3次，再用0.1％HgCl₂浸泡8-10min,無菌水清洗2-3次。

步驟2、愈傷組織的誘導培養(yǎng)：

在超凈工作臺上，將經(jīng)過表面消毒的外植體轉(zhuǎn)移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，用消過毒的鑷子將材料橫向接種于培養(yǎng)基中，并輕壓，保證材料嵌入愈傷組織誘導培養(yǎng)基中；接種后20-30d形成明顯的愈傷組織；誘導出的愈傷組織切割后如圖1(A)所示；

枳莖段愈傷組織誘導：采用愈傷組織誘導培養(yǎng)基，愈傷組織誘導培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含大量元素)，瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L，培養(yǎng)基pH為5.8；培養(yǎng)溫度23℃，暗培養(yǎng)；其中，愈傷組織誘導培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度如表4所示：

表4愈傷組織誘導培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度

愈傷組織誘導成功率為80％，部分切口未成功誘導愈傷組織。

步驟3、愈傷組織的增殖培養(yǎng)：

將步驟2形成的愈傷組織經(jīng)切割后轉(zhuǎn)接到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)，愈傷組織較為迅速的生長膨大，如圖1(B)所示。

枳莖段愈傷組織增殖培養(yǎng)條件：采用愈傷組織增殖培養(yǎng)基，愈傷組織增殖培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含大量元素)，瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L，培養(yǎng)基pH為5.8；培養(yǎng)溫度25℃，暗培養(yǎng)；愈傷組織增殖培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度如表5所示：

表5愈傷組織增殖培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度

步驟4、愈傷組織的分化及再分化：

將增殖后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)，通過光誘導，迅速分化形成不定芽，如圖1(C)所示；而后緩慢分化為莖和葉，如圖1(D)所示。

培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度23℃，光照時間為10h/d，光照強度為2500lux。在上述濃度下，光下培養(yǎng)，再分化率為64％；已分化出不定芽。未分化的主要原因為愈傷組織的老化，且老化的愈傷組織明顯增多。

步驟5、生根成苗及馴化移栽

將再分化形成的莖和葉轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，如圖1(E)所示；20～30天后，長出1-2條肉質(zhì)不定根，生根成苗成為新的植株，如圖1(F)所示；煉苗、緩苗后正常培養(yǎng)。

生根培養(yǎng)條件：采用生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含大量元素)，瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L，培養(yǎng)基pH為5.8；培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為10h/d，光照強度為2500lux。生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度如表6所示：

表6生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度

煉苗、緩苗具體為：先在組培室打開瓶蓋煉苗3天，然后將其移至溫室或蔭棚，再煉苗3天；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其表面的瓊脂，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中進行緩苗，然后正常培養(yǎng)。培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石與珍珠鹽；所述培養(yǎng)基質(zhì)含水量25％以內(nèi)，空氣相對濕度60～80％，遮光50％。

實施例3

一種枳的組織培養(yǎng)再生苗的培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟：

步驟1、外植體的選擇及處理：

選取枳的莖段為起始材料，消毒后作為組培用的外植體；消毒具體為：材料去葉后用多菌靈1000倍液處理30min，清水洗凈后流水沖洗2小時后備用；在超凈工作臺上剪成小段后轉(zhuǎn)移到無菌燒杯中；用75％乙醇滅菌30s，期間不斷晃動燒杯，然后用無菌水(ddH₂O)清洗2-3次，再用0.1％HgCl₂浸泡8-10min,無菌水清洗2-3次。

步驟2、愈傷組織的誘導培養(yǎng)：

在超凈工作臺上，將經(jīng)過表面消毒的外植體轉(zhuǎn)移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，用消過毒的鑷子將材料橫向接種于培養(yǎng)基中，并輕壓，保證材料嵌入愈傷組織誘導培養(yǎng)基中；接種后20-30d形成明顯的愈傷組織；誘導出的愈傷組織切割后如圖1(A)所示；

枳莖段愈傷組織誘導：采用愈傷組織誘導培養(yǎng)基，愈傷組織誘導培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含大量元素)，瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L，培養(yǎng)基pH為5.8；培養(yǎng)溫度27℃，暗培養(yǎng)；其中，愈傷組織誘導培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度如表7所示：

表7愈傷組織誘導培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度

愈傷組織誘導成功率為100％，莖段兩側(cè)切口均能長出愈傷組織。

步驟3、愈傷組織的增殖培養(yǎng)：

將步驟2形成的愈傷組織經(jīng)切割后轉(zhuǎn)接到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)，愈傷組織較為迅速的生長膨大，如圖1(B)所示。

枳莖段愈傷組織增殖培養(yǎng)條件：采用愈傷組織增殖培養(yǎng)基，愈傷組織增殖培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含大量元素)，瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L，培養(yǎng)基pH為5.8；培養(yǎng)溫度27℃，暗培養(yǎng)；愈傷組織增殖培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度如表7所示：

表7愈傷組織增殖培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度

步驟4、愈傷組織切割及再培養(yǎng)：

將步驟3增殖出的愈傷組織進行切割，每塊愈傷組織切割至10個小塊，然后繼續(xù)放在愈傷組織增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3周即可用于再次切割，也可培養(yǎng)4-5周，用于分化及再分化；以上操作均在無菌操作臺進行。

步驟5、愈傷組織的分化及再分化：

將增殖后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)，通過光誘導，迅速分化形成不定芽，如圖1(C)所示；而后緩慢分化為莖和葉，如圖1(D)所示。

培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度25℃，光照時間為12h/d，光照強度為3000lux。在上述濃度下，光下培養(yǎng)，再分化率為80％；已分化出不定芽。未分化的主要原因為愈傷組織的老化。

步驟6、生根成苗及馴化移栽

將再分化形成的莖和葉轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，如圖1(E)所示；20～30天后，長出1-2條肉質(zhì)不定根，生根成苗成為新的植株，如圖1(F)所示；煉苗、緩苗后正常培養(yǎng)。

生根培養(yǎng)條件：采用生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含大量元素)，瓊脂為6g/L,蔗糖為30g/L，培養(yǎng)基pH為5.8；培養(yǎng)溫度27℃，光照時間為12h/d，光照強度為3000lux。生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度如表9所示：

表9生根培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度

煉苗、緩苗具體為：先在組培室打開瓶蓋煉苗3天，然后將其移至溫室或蔭棚，再煉苗3天；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其表面的瓊脂，移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中進行緩苗，然后正常培養(yǎng)。培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石與珍珠鹽；所述培養(yǎng)基質(zhì)含水量25％以內(nèi)，空氣相對濕度60～80％，遮光50％。采用本發(fā)明的方法愈傷組織切割增殖效率如圖2所示，增殖培養(yǎng)后的愈傷組織，可經(jīng)過切割，繼續(xù)進行增殖培養(yǎng)，愈傷組織的個數(shù)將成幾何倍數(shù)增長(以增值后的愈傷組織切割成10個較小的愈傷組織為例)；切割后培養(yǎng)(培養(yǎng)至可切割大小為2-3周，培養(yǎng)至可誘導分化為4-5周)的愈傷組織經(jīng)過可按本發(fā)明后續(xù)的技術(shù)措施進行分化及再分化、生根培養(yǎng)、煉苗移栽。采用本發(fā)明的繁殖方法對枳進行繁殖，在步驟2中對增殖后的愈傷組織進行切割再培養(yǎng)可使其增殖系數(shù)呈現(xiàn)幾何基數(shù)式增長，遠遠高于傳統(tǒng)的分株繁殖方式，采用上述通過枳的組織培養(yǎng)再生苗的方法，繁殖系數(shù)高，增殖速度快，且不受地區(qū)、季節(jié)、氣候限制，可實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)再生苗的工廠化規(guī)?；a(chǎn)及實驗室脫毒再生苗的培養(yǎng)體系。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應當理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。