本發(fā)明涉及生物篩選
技術(shù)領(lǐng)域：
，且特別涉及一種輪蟲的篩選方法。
背景技術(shù)：
：不論是海水魚還是淡水魚，在育苗及幼體培育期間，其開口活餌料主要選用輪蟲。按照每尾育苗每天攝食20～50只輪蟲來計算，1個生產(chǎn)5000萬尾魚苗的中小型育苗企業(yè)，每天對輪蟲的需求量就需要達到15～25億只，按照1：1的比例采收輪蟲來計算，育苗單位每天需要生產(chǎn)25～50億只輪蟲。輪蟲大多數(shù)品系為周期性孤雌繁殖，即其生活史由孤雌繁殖和有性繁殖兩部分構(gòu)成。通常情況下，輪蟲通過高效的孤雌繁殖過程增加種群數(shù)量，但是在高密度養(yǎng)殖條件下，則啟動有性繁殖，產(chǎn)生休眠卵來抵御不良環(huán)境條件。有性繁殖的產(chǎn)生大大限制了種群繁殖的效率，甚至有崩潰的危險，從而限制了輪蟲的產(chǎn)量，所帶來的是活餌料供應不足的問題。因此實際生產(chǎn)中需要得到有性生殖傾向低的輪蟲品系擴大培養(yǎng)，而該篩選方法目前尚未見報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種輪蟲的篩選方法，用于快速、精準的篩選有性生殖傾向最低的輪蟲品系，從而解決高密度培養(yǎng)條件下輪蟲的有性生殖所帶來的輪蟲餌料供應不足的問題，提高培養(yǎng)效率，節(jié)約生產(chǎn)成本，具有極佳的推廣價值。本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明提出一種輪蟲的篩選方法，用于篩選有性生殖傾向最低的輪蟲，包括：將多個目標輪蟲品系分別于環(huán)境密度≤0.1ind./ml的條件下穩(wěn)定化增殖2-4周，建立單克隆培養(yǎng)母種群，從單克隆培養(yǎng)母種群中選擇帶卵輪蟲作為母體，使其于環(huán)境密度≤0.1ind./ml的條件下生產(chǎn)F1代輪蟲幼體，將齡長<2h的F1代輪蟲幼體分別放置于不同體積的輪蟲培養(yǎng)液中單獨培養(yǎng)，并使得各F1代輪蟲在發(fā)育過程中經(jīng)歷穩(wěn)定的種群密度，每天更換一次輪蟲培養(yǎng)液。將不同種群密度下培養(yǎng)的各F1代輪蟲產(chǎn)生的F2代幼體分別挑出單獨培養(yǎng)，計算各F1代輪蟲種群對應的F2代有性個體比率。將F2代有性個體比率和對應的F1代經(jīng)歷的種群密度進行非線性擬合，求得各F1代輪蟲種群的有性生殖閾密度。將多個目標輪蟲品系的F1代輪蟲種群的有性生殖閾密度進行比較，得有性生殖傾向最低的輪蟲品系。本發(fā)明較佳實施例提供的輪蟲的篩選方法的有益效果是：通過多個目標輪蟲品系分別于環(huán)境密度≤0.1ind./ml的條件下穩(wěn)定化增殖以及于環(huán)境密度≤0.1ind./ml的條件下生產(chǎn)F1代幼體，有效控制母系效應對輪蟲F1代以及F2代的影響，提高實驗結(jié)果的可重復性。通過不同種群密度的F1代輪蟲種群以及對應的F2代有性個體比率進行非線性擬合，求得各F1代輪蟲種群的有性生殖閾密度；并通過比較多個目標輪蟲品系的有性生殖閾密度，得到有性生殖閾密度值最高的，即有性生殖傾向最低的輪蟲，并用于大批量培養(yǎng)，可顯著提高生產(chǎn)種群的輪蟲最大培養(yǎng)密度，有利于高密度集約化培養(yǎng)，從而節(jié)約生產(chǎn)成本。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明試驗例提供的各品系輪蟲種群(有性生殖閾密度不同)的種群增長圖。具體實施方式為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下面對本發(fā)明實施例的一種輪蟲的篩選方法進行具體說明。一種輪蟲的篩選方法，用于篩選有性生殖傾向最低的輪蟲，包括：將多個目標輪蟲品系分別于環(huán)境密度≤0.1ind./ml的條件下穩(wěn)定化增殖2-4周，建立單克隆培養(yǎng)母種群。其中，本發(fā)明中目標輪蟲品系可以為不同品種的輪蟲，也可以為同一品種采集自不同地區(qū)的輪蟲，例如不同地區(qū)采集的萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)，本領(lǐng)域工作人員可根據(jù)實際情況進行選定，在此不做限定。由于跨代母體效應在輪蟲有性生殖的傾向性方面具有顯著影響，且建立單克隆培養(yǎng)母種群需要輪蟲不斷的生殖，而有性生殖則會產(chǎn)生休眠卵以及雄卵，降低種群增長速度，加大實驗成本以及影響實驗效果，因此采用孤雌生殖快速穩(wěn)定的建立單克隆培養(yǎng)母種群。經(jīng)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，于環(huán)境密度≤0.1ind./ml的條件下穩(wěn)定化增殖2-4周是建立單克隆培養(yǎng)母種群的最佳時間以及最佳環(huán)境密度，該密度下，輪蟲進行孤雌生殖效果佳且培養(yǎng)成本較為低廉。優(yōu)選地，目標輪蟲品系由從野外采集的休眠卵置于盛有輪蟲培養(yǎng)液的容器內(nèi)，將容器放置于20-25℃，光周期L：D＝16:8、光照強度為1000-3000lx的恒溫培養(yǎng)箱中孵化而得。該條件下，孵化速率快，孵化后的輪蟲成活率高。其中休眠卵采集是指在野外，從水流靜緩的河汊、池塘、海邊潟湖等處采集富含休眠卵的底泥，將底泥放置于黑暗低溫的容器中帶回實驗室，并置于冰箱中。優(yōu)選地，于孵化步驟開始前將野外采集的休眠卵放置于4-5℃的條件下進行保存，該溫度范圍內(nèi)，休眠卵保存時間長，且活性高，溫度過高，會導致休眠卵孵化，溫度過低，會影響休眠卵的活性。優(yōu)選地，將孵化而得的每個輪蟲單獨轉(zhuǎn)移至第二細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入2-5ml的輪蟲培養(yǎng)液，每隔1-2天更換一次輪蟲培養(yǎng)液，獲得各輪蟲的單克隆培養(yǎng)種群作為目標輪蟲品系。具體地，單克隆培養(yǎng)種群的密度為≤1ind./ml，種群規(guī)模至少達到1000只個體，可為后續(xù)實驗提供足夠的實驗樣本。由于有時實驗并非在單克隆培養(yǎng)種群建立后立即進行操作，因此優(yōu)選地，將目標輪蟲品系進行穩(wěn)定化增殖之前，于15-20℃之間，保持種群密度為1ind./ml的情況下穩(wěn)定培養(yǎng)15-30天。期間，可通過每天更換培養(yǎng)液和隨機挑出一些個體的辦法控制食物濃度以及種群密度，使輪蟲受食物濃度、環(huán)境溫度和種群密度影響的母系效應一致化，從而后續(xù)實驗的可重復性佳。更優(yōu)選地，將目標輪蟲品系進行穩(wěn)定化增殖之前，于15℃，保持種群密度1ind./ml的情況下穩(wěn)定培養(yǎng)30天，目標輪蟲品系的活性佳。更優(yōu)選地，將目標輪蟲品系進行穩(wěn)定化增殖之前，在20℃，保持種群密度1ind./ml的情況下穩(wěn)定培養(yǎng)15天，目標輪蟲品系的活性佳。從單克隆培養(yǎng)母種群中選擇帶卵輪蟲作為母體，使其于環(huán)境密度≤0.1ind./ml的條件下生產(chǎn)F1代幼體，此時在該低密度環(huán)境下生產(chǎn)出的F1代幼體理論上均為非混交雌體。將齡長<2h的F1代幼體分別放置于不同體積的輪蟲培養(yǎng)液中單獨培養(yǎng)，并使得F1代個體在發(fā)育過程中經(jīng)歷穩(wěn)定的種群密度，通過計算獲得每個F1代輪蟲所生活的種群密度。期間每天更換一次輪蟲培養(yǎng)液，保證食物濃度相同。在本發(fā)明其他實施例中，還可以采用將不同數(shù)量的F1代幼體分別放置于同樣體積的輪蟲培養(yǎng)液中，建立不同的種群密度的各F1代輪蟲。需注意的是：這里使F1代個體在發(fā)育過程中經(jīng)歷穩(wěn)定的種群密度最好包括小于0.1ind./ml的數(shù)值以及大于0.1ind./ml的數(shù)值，這樣設置的原因是輪蟲的有性生殖與種群密度密切相關(guān)，因此F1代輪蟲的種群密度大于0.1ind./ml，F(xiàn)1代會受到自體產(chǎn)生的有性生殖誘導信號的刺激，其后代中會有一定比例的個體為混交雌體，而F1代輪蟲種群的種群密度小于0.1ind./ml的部分，則可驗證在0.1ind./ml條件下進行孤雌生殖是否為合理設置。將各F1代輪蟲產(chǎn)生的F2代幼體分別挑出單獨培養(yǎng)，保證各F1代輪蟲的種群密度不變，且于相同的環(huán)境溫度下進行培養(yǎng)，使得各F1代輪蟲受食物濃度、環(huán)境溫度和種群密度影響的母系效應一致化。計算各F1代輪蟲對應的F2代有性個體比率；優(yōu)選地，F(xiàn)2代有性個體比率由以下方式獲得：將挑出的F2代幼體分別置于第一細胞培養(yǎng)板內(nèi)，第一細胞培養(yǎng)板的每個孔內(nèi)添加有0.15-0.22ml的輪蟲培養(yǎng)液，每24h更換一次，直至可以通過F2代帶卵情況分辨F2代為混交雌體或非混交雌體結(jié)束培養(yǎng)，此處采用的分辨方法為通過卵的不同形態(tài)進行分辨。具體地，輪蟲可以生產(chǎn)三種形態(tài)的卵，其中非混交雌體生產(chǎn)的非需精卵體積較大，卵膜薄而透明；混交雌體產(chǎn)生兩種卵，一種是雄卵，即需精卵未受精者，體積較小，約為非需精卵的一半至十分之一，卵膜較薄而透明，另一種為休眠卵，即受精后的需精卵，其體積比雄卵的體積大，具堅厚的卵殼，不透明，殼面上常有突起或雕刻花紋。需說明的是，此處所述術(shù)語“第一”、“第二”僅用于區(qū)分描述，即第一細胞板與第二細胞板均為細胞板。記錄上述各F2代混交雌體與非混交雌體的個數(shù)，通過混交雌體數(shù)量與雌體總數(shù)的比率得各F2代對應的有性個體比率。將F2代有性個體比率和對應的F1代種群密度進行非線性擬合，求得各F1代輪蟲的有性生殖閾密度；輪蟲的有性生殖發(fā)生與其種群密度密切相關(guān)，因而有性生殖閾密度的定義為當一個種群中出現(xiàn)有性雌體時的種群密度。本發(fā)明中，我們使用種群中一半雌體發(fā)生有性生殖時的種群密度Q50作為某一輪蟲品系有性生殖閾密度的指示標準。對于某一物種和克隆種群來說，這個值是判斷種群是否會發(fā)生有性生殖的關(guān)鍵指標，也是分析物種或種群有性生殖傾向性的一個重要依據(jù)。例如，利用非線性擬合公式進行擬合；其中，公式中y為有性個體比率，x為種群密度。將多個目標輪蟲品系的F1代輪蟲的有性生殖閾密度進行比較，得有性生殖傾向最低的輪蟲品系。本發(fā)明中采用的輪蟲培養(yǎng)液，可以直接購買于市面，也可以自行配置。優(yōu)選地，本發(fā)明中優(yōu)選為自行配置，具體地，采用間接配制法，即先配置濃縮母液，再向水中添加濃縮母液的方式配制最終使用的輪蟲培養(yǎng)液，其中水為雙重蒸餾水或純水，防止雜菌或雜質(zhì)污染該輪蟲培養(yǎng)液，影響其效果。配置該輪蟲培養(yǎng)液的具體各原料以及濃度如表1所示：表1輪蟲培養(yǎng)液的具體成分該輪蟲培養(yǎng)液營養(yǎng)豐富，適合輪蟲生存繁殖，提高輪蟲的存活率以及生長速度。試驗例在北京市的后海、密云水庫以及玉淵潭分別采集后海品系輪蟲休眠卵、密云水庫品系輪蟲休眠卵以及玉淵潭品系輪蟲休眠卵，其中，各品系輪蟲均為萼花臂尾輪蟲。將各品系輪蟲休眠卵分別置于盛有輪蟲培養(yǎng)液的容器內(nèi)，將容器放置于25℃，光周期L：D＝16:8、光照強度為3000lx的恒溫培養(yǎng)箱中孵化，孵化而得的每個輪蟲單獨轉(zhuǎn)移至第二細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入2ml的輪蟲培養(yǎng)液，每隔1天更換一次輪蟲培養(yǎng)液，獲得各品系輪蟲的單克隆培養(yǎng)種群作為目標輪蟲品系。其中，單克隆培養(yǎng)種群的密度為1ind./ml，種群規(guī)模至少達到1000只個體，于20℃之間，保持種群密度為1ind./ml的情況下穩(wěn)定培養(yǎng)30天。然后將各目標輪蟲品系分別于環(huán)境密度≤0.1ind./ml的條件下穩(wěn)定化增殖4周，建立單克隆培養(yǎng)母種群。從單克隆培養(yǎng)母種群中選擇帶卵輪蟲作為母體，使其于環(huán)境密度≤0.1ind./ml的條件下生產(chǎn)F1代輪蟲幼體，將齡長<2h的F1代輪蟲幼體分別單獨放置于輪蟲培養(yǎng)液中，使其種群密度分別為6.4ind./ml、3.2ind./ml、1.6ind./ml、0.8ind./ml、0.4ind./ml、0.2ind./ml、0.1ind./ml、0.05ind./ml、和0.025ind./ml，每個目標輪蟲品系設五個重復樣本。將各F1代輪蟲種群產(chǎn)生的F2代幼體分別挑出，單獨置于每個孔內(nèi)添加有0.2ml的輪蟲培養(yǎng)液第一細胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，每24h更換一次輪蟲培養(yǎng)液，直至可以通過F2代所帶卵的形態(tài)分辨F2代為混交雌體或非混交雌體才結(jié)束培養(yǎng)，并通過有性雌體個數(shù)與總雌體的個數(shù)的比值求得各種群密度對應的有性個體比率，實驗數(shù)據(jù)如表2、表3以及表4所示：表2玉淵潭輪蟲品系實驗結(jié)果表3后海輪蟲品系實驗結(jié)果表4密云水庫輪蟲品系實驗結(jié)果其中，輪蟲培養(yǎng)液的具體各原料以及濃度如表5所示：表5輪蟲培養(yǎng)液的具體成分將表2、表3以及表4的數(shù)據(jù)根據(jù)公式進行非線性擬合，其中，y為有性個體比率，x為種群密度，得各品系a、b、k的平均數(shù)值如下，并求得各品系的有性生殖閾密度，即當y為0.5時產(chǎn)生有性生殖的種群密度，如表6所示：表6各輪蟲品系的生殖閾密度abkyx玉淵潭0.887269.589279.378310.50.27后海0.8869642.024059.654130.50.41密云0.9191517.5743616.170980.50.19由表6可得，后海品系的有性生殖閾密度值0.41最大，因此后海品系為有性生殖傾向最低的輪蟲品系。試驗例采用實施例中的三個目標輪蟲品系的F1代做三組種群增長實驗，每組設3個平行樣，具體地，在20攝氏度，光周期為L:D＝16:8，光照強度為3000lx，培養(yǎng)液中小球藻濃度為1×106cell/mL，每天更換新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)條件下，進行該實驗30天，每天記錄各平行樣的種群密度，得到的各目標輪蟲品系的各平行樣的種群密度數(shù)據(jù)如表7、表8以及表9所示：表7密云水庫品系的種群增長實驗結(jié)果由表7數(shù)據(jù)可知，密云水庫品系在培養(yǎng)開始至培養(yǎng)25天，種群密度持續(xù)增長，最高平均種群密度30.8ind./mL，接著種群密度開始下降，有性生殖增強，產(chǎn)生大量休眠卵。表8后海品系的種群增長實驗結(jié)果由表8數(shù)據(jù)可知，后海品系在培養(yǎng)開始至培養(yǎng)25天，種群密度持續(xù)增長，第26天至培養(yǎng)結(jié)束，種群密度呈波動增長并維持穩(wěn)定，結(jié)束實驗，最高平均種群密度59.6ind./mL，至結(jié)束培養(yǎng)平均種群密度57.4ind./mL，種群增長速度良好，有性生殖率低。表9玉淵潭品系的種群增長實驗結(jié)果由表9數(shù)據(jù)可知，玉淵潭品系在培養(yǎng)開始至培養(yǎng)25天，種群密度持續(xù)增長，最高平均種群密度28.2ind./mL，接著種群密度開始下降，有性生殖增強，產(chǎn)生大量休眠卵。根據(jù)表7、8、9的各品系輪蟲的種群密度的平均值可得，種群增長實驗過程中，三個品系的增長速度并非理論增長值，這是因為實際培養(yǎng)過程中，部分輪蟲先天性無法生育以及培養(yǎng)過程中會有幼體的死亡率等的影響，均為本實驗正常接受范圍內(nèi)。由表7、8、9的數(shù)據(jù)可得，后海品系相比于其他兩組，具有顯著較高的種群增長率。根據(jù)表7、8、9的各品系輪蟲的種群密度的平均值制作各品系輪蟲種群(有性生殖閾密度不同)增長圖，增長圖參閱圖1，由圖1可以直觀的看出，后海品系的種群增長率遠高于其他兩組，即三者中，有性生殖傾向最低的后?？寺∑废迪啾扔谄渌麅山M明顯具有較好的擴大培養(yǎng)潛力，從而證明本發(fā)明提供的輪蟲篩選方法安全可靠。綜上所述，本發(fā)明實施例的輪蟲的篩選方法，可快速，精準的篩選多個目標輪蟲品系中有性生殖傾向最低的輪蟲，并用于大批量培養(yǎng)，可顯著提高生產(chǎn)種群的輪蟲最大培養(yǎng)密度，有利于高密度集約化培養(yǎng)，從而解決有性生殖所帶來的輪蟲餌料供應不足的問題，節(jié)約生產(chǎn)成本，具有極佳的推廣價值。以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。當前第1頁1 2 3